1、SOD活性测定SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。阻止中间物的积累而测定其酶活性。 1、试剂及仪器 (1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。 (2)UV754紫外分光光度计。 2、测定方法： (1)邻苯三酚自氧化速度的测定。 在25度、45ml50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每
2、隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。 (2)SOD或粗酶抽提液活性测定： 测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。 0.0700A325mm/min -100度 0.70 样液稀释倍数 样液稀释倍数 酶活性(u/m1)-反应液总体积- 50 样液体积 3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算： SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。 蛋白浓度ug蛋白/ml样液稀释倍数10负3次方mg蛋白/ml总蛋白mg蛋白/ml原液总体积mg蛋白。 4、比活(
3、u/mg蛋白)的计算： 单位活力(u/ml) 总活力 比活-u/mg蛋白 蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白 超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxidedismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，
4、并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。 按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原
5、核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。原理 SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2-，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
6、Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与CN抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。 在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯
7、三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留3045s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。 酶活力单位定义：在25恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。 试剂和器材 1、试剂 （1）pH8.2、50mmol/LTris-HCl 称取Tris0.61g，EDTA-2Na0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH=8.20（用pH计校正），最后
8、定容至100mL。 （2）10mmol/LHCl （3）50mmol/L邻苯三酚 称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/LHCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。 （4）SOD样液 2、器材 （1）恒温水浴槽 （2）紫外分光光度计 （3）试管、刻度吸管、微量注射器 方法和步骤 1、邻苯三酚自氧化速率的测定 取两支试管按下表加入25预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增
9、减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。试剂空白管（mL）自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/L HCl0.020.0150 mmol/L邻苯三酚-0.012、SOD样液的活性测定样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。试剂空白管（mL）样品管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/L HCl0.02-SOD样液-0.0150 mmol/L邻苯三酚-0.01（3）计算实验二十六 植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的通过实验，掌握植物体内多
10、酚氧化酶活性的测定方法。二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下： 多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）12 O2 邻醌 H2O三、材料、仪器及试剂1. 材料：马铃薯块茎等2. 仪器：UV1206或UV1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01molL1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m molL1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 molL1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 m
11、olL1儿茶酚；20三氯乙酸。四、实验步骤1. 粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1molL1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于23ml 0.01molL1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。2. 活性酶的测定在试管中加入3.9ml 0.05 molL1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 molL1儿茶酚在37恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性
12、增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在12min内测定吸光度变化（A）值。五、酶活性的计算以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。 A 酶提取液总量（ml）酶活力（0.01Amin1） 0.01反应时间 测定时酶液用量（ml） A 酶提取液总量（ml）酶的比活性(0.01Ag1Fwmin) 0.01W反应时间 测定时酶液用量（ml）公式中：A 为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。原理 SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物
13、在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与CN抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和
14、设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。 在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2 -，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留3045s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出S
15、OD的酶活性。 酶活力单位定义：在25恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。 试剂和器材 1、试剂 （1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl 称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。 （2）10mmol/L HCl （3）50 mmol/L邻苯三酚 称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。 （4）SOD样液 2、器材 （1）恒温水浴槽 （2）紫外分光光度计 （3）试管、刻度
16、吸管、微量注射器 方法和步骤 1、邻苯三酚自氧化速率的测定 取两支试管按下表加入25预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚 ），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。 试剂 空白管（mL） 自氧化管（mL） pH8.2、50mmol/L Tris-HCl 2.98 2.98 10mmol/L HCl 0.02 0.01 50 mmol/L邻苯三酚 - 0.01 2、SOD样液
17、的活性测定 样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。 试剂 空白管（mL） 样品管（mL） pH8.2、50mmol/L Tris-HCl 2.98 2.98 10mmol/L HCl 0.02 - SOD样液 - 0.01 50 mmol/L邻苯三酚 - 0.01 （3）计算 问题补充：对于若着的答案。测试管也有Hcl啊。超氧化物歧化酶【超氧化物歧化酶概述】超氧化物歧化酶 英文：Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD) 别名：肝蛋白、奥谷蛋白 简称：SODSOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的
18、活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。 超氧物歧化酶(Superoxide Dismutase简称SOD)是一种新型酶制剂,它在生物界的分布极广,几乎从人到细胞,从动物到植物,都有它的存在。原
19、多从牛血中提取，1997年欧盟禁止使用动物中提取的SOD.补充：SOD是Super Oxide Dimutese 缩写，中文名称超氧化物歧化酶，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！ SOD是超氧化
20、物歧化酶(superoxidedismutase)的英文缩写,是一种含有金属元素的活性蛋白酶,是目前生物学、医学和生命科学领域中世界级的高、尖、精课题。超氧化物歧化酶（SOD）目前世界范围内的开发，大都从动物血里提取，不但代价昂贵，而且动物性SOD的排他性、不易常温保存、艾滋病等血液病毒的交叉感染及其它潜在危险，所以国际卫生组织呼吁：立刻停止动物性SOD的使用。SOD是中国卫生部批准的具有抗衰老、免疫调节、调节血脂、抗辐射、美容功能的物质之一，法定编号为ECl.15.1.1；CAS9054891。(一) SOD超氧化物岐化酶(SuperoxideDismutase)，简称SOD，ECl.15.
21、1.1，是1969年美国Dude大学IFridovich教授和他的研究生McCoard发现的。它催化如下的反应：202+2H+H2O2+O2O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。1、自由基（Free Radical）自由基是一类非常活跃的化学物质，是个有不成对（奇数）电子的原子、原子团、分子和离子。其中最重要的是氧自由基，它可聚集体表、心脏、血管、肝脏和脑细胞中。如果沉积在血管壁上，会使血管发生纤维性病变，导致动脉管硬化，高血压，心肌梗塞；沉积在脑细胞时，会引起老年人神经官能不全，导致记忆、智力障
22、碍以及抑郁症，甚至老年性痴呆等，是造成人类衰老和疾病的元凶。2、氧自由基可分为两类：(1)无机氧自由基：超氧自由基、羟基自由基(2)有机氧自由基：过氧自由基、烷氧自由基、多元不饱和脂肪酸自由基RUFA、半醌自由基。另外，单线态氧1O2、H2O2、NO2、NO等分子虽然没有奇数电子，但氧化能力强，因此有人把它们和上述氧自由基放在一起，统称为活性氧。3、自由基的产生及性质人体正常的新陈代谢就会产生自由基、是人体活动所需要的，但在某些特殊的情况下，体内会产生过量的自由基。人体利用氧气的过程就会产生活性氧辐射线：日光、核能、X光、复印机、计算机电磁波：微波炉、吹风机、手机污 染：汽车尾气、工业废气、废
23、水、香烟(二手烟)、农药残留、杀虫剂摄入物：药物滥用，某些食品添加剂体 况：疾病、体力透支。精神压力、郁闷、焦躁4自由基可能参与的疾病眼睛：白内障、退化性眼底病变，新生儿视网膜病变皮肤：异位性皮肤炎、色素沉着黑斑、老人斑、皮肤过敏心血管：高血压、动脉硬化、心肌梗塞、心肌无力、心律不整呼吸系统：鼻子过敏、气喘、肺气肿、肺纤维化、成人呼吸窘迫症脑：老年痴呆、帕金森氏症、脑循环障碍红血球：镰刀型贫血、蚕豆症、铅中毒泌尿系统：肾脏病、蛋白尿、膀胱炎、摄护腺肥大、肾丝球发炎其它：便秘、口臭、糖尿病及共并发症、风湿性关节炎、癌症、化疗副作用手术、器官移植、肝炎、更年期。 编辑本段【超氧化物歧化酶SOD与人
24、体健康的关系】SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内 6性极强的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧链条。1、抗氧化医学报告指出， 抗氧化能力的衰退期已提前至35岁左右，光靠蔬果已经不足以消除人体内外共同形成的氧化压力预防慢性病及其并发症自由基是科学家最近才发现导致各种慢性病与老化的罪魁祸首故说它是万病之源，是人体健康的大敌，自由基对身体的伤害是日积月累的，尤其是糖尿病与心血管方面的疾病，林天送博士说：照顾好您的心血管，就可以
25、活到九十岁。养成多多摄取抗氧化物的好习惯，保证可以让您远离慢性疾病的威胁。抗衰老人之所以会衰老，老化迹象一点一滴出观，如色素沉淀、体力衰退、是因为体内产生氧化作用，所谓氧化作用就类似于生锈反应，抗氧化剂的补充有助于降低氧化的速度，减慢衰老的脚步。抗疲劳过多的自由基在体内残存， 就犹如毒素蓄积体内一样，会让人：容易疲劳、厌倦、注意力不集中、常常昏昏沉沉、打哈欠，SOD对上班族熬夜加班，学生应付考试所产生的疲劳，在提振精神及集中注意力方面成效显著，有助于工作绩效的提升，及考试成绩的进步。 化疗副作用的消除剂接受化疗的癌症病患体内的抗氧化能力会大大地降低，万一低到某个程度，自由基就会损害细胞、黏膜、
26、五脏六腑、脑、中枢神经等所以癌症患者应及时补充抗氧化剂来维持好体力。日本厚生省与美国癌症中心(NCI)亦建议使用抗氧化剂来预防癌症或治疗因氧自由基破坏细胞所引起的病变。降低抗癌药物所引起的如呕吐，食欲不振、掉发等副作用。避免手术的二次伤害手术会引起大量自由基，故建议手术前后口服抗氧化剂来迅速恢复体力加速伤口复原。化解妇女的氧化压力危机妇女的氧化危机有三：A、皮肤出现斑点皱纹： 因为氧自由基无法有效被清除，破坏胶原蛋白、弹力纤维蛋白，使皮肤保湿及维持弹性的功能丧失，皱纹横生，起加速黑色素的沉淀。B、血液循环不良、经期不顺、黑眼圈、肤色灰暗无光泽。C、更年期障碍：因为动情激素的缺乏、体内的抗氧化能
27、力降低，常有以下症状出现：阵发性朝热、失眠、夜间流汗、头痛、情绪不稳、心神不宁。1药物类，主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者；2用于生化制药，作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，具有极强的抗衰老，抗肿瘤、 调节人体内分泌系统作用；3用于化妆品类，可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。以 SOD为主要成份的产品风靡世界，引发了化妆品历史上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真； 4. 用作保健食品、饮料、如SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常畅销! 在饮料、糖果、糕点等食品中加入SOD既可利用其
28、抗腐蚀性延长保质期，又可调节人体内分泌系统。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶人体内的垃圾清道夫。 SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。全球118位科学家发表联合声明：自由基是百病之源，SOD是健康之本。体内的SOD活性越高，寿命就越长。 编辑本段【超氧化物歧化酶SOD作用与用途】过氧化物游离基可造成机体的损害，本品由哺乳动物的红细胞、肝和组织中分离提取的一种肽链大分子的金属酶，能促使过氧化物游离基转化成过氧化氢和氧，从而清除炎症过程中伴随产生的过氧化物游离基，而有强大的抗炎作用。临床用于类风湿关节炎、骨关节病、放射性膀胱炎。此外，试用于纤维性海绵体炎，
29、于阴茎硬结区域内注射，1次注射5mg10mg后，多数病人症状即获得明显改善。 编辑本段【超氧化物歧化酶剂量与用法】肌注，慢性风湿性关节炎，8mg/次，34次/周。关节腔内注射：骨关节炎，2mg/次，每2周1次。深部皮下注射：放射性膀胱炎，4mg/次，在放疗后1530分钟注射。 编辑本段【超氧化物歧化酶副作用】肌注偶见注射局部疼痛、荨麻疹及蛋白尿。 超氧化物歧化酶（ SOD ）又称过氧化物歧化酶。 SOD 属于金属酶，按照结合金属离子种类不同，该酶有以下三种：含铜与锌超氧化物歧化酶（ Cu-ZnSOD ）、含锰超氧化物歧化酶（ Mn-SOD ）和含铁超氧化物歧化酶（ Fe - SOD ）。三种
30、SOD 都催化超氧化物阴离子自由基歧化为过氧化氢与氧气。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代谢时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基自由基很不稳定，它要在身体组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，当细胞分子推陈出新动一个电子后，它也变成自由基，又要去抢夺细胞膜或或细胞核分子中的电子，这样又称会产生新的自由基。如，超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由基，等等。在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体内的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代谢失常等，最终使机体发生病变。因此，自由基作为人体垃圾，能够促使某些疾病的发
