1、最新提RNA逆转录qRTPCR步骤汇总提RNA-逆转录-qRT-PCR步骤汇总【一、提NA】一、实验准备：1、试剂：75%乙醇、Tril、.5L进口E管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RN专用）、2、配75%乙醇（DPC水+无水乙醇),放-0冰箱预冷；3、预冷离心机（1.5LEP管用的);4、清洁桌面,酒精喷过之后擦干,新手套、两层口罩；二、操作步骤：0、弃上清(不回收,直接倒去）;2、m孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去,随后用200L枪吸尽PBS）;3、每孔加50L rol,轻晃，随后室温放置2min左右;4、枪头吹打，吸出放入m 进口EP管；0、加入100氯仿（即1体积的izol)；06、4离
2、心机,12000g,1mi;07、吸200L（可减少）上清放入新的1。5m 进口P管中(注意:只能吸到上清)；08、加入等体积异丙醇,充分混匀,常温放置103in(1min）；09、4离心机，1200,1n;10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；1、4离心机,7500g,5min;12、倒掉上清,加入1mL预冷的7%乙醇,混匀;3、离心机,500g，5in;4、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10in，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠;1、每管中加入40(06）的DEPC水,吹打溶解；6、测浓度（先知楼1楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；三、注
3、意事项01、如果当时不测A浓度,可暂时把RNA放在-20冰箱.但长时间(4h)保存，需要放在-80冰箱;02、异丙醇作用是沉淀N，作用比乙醇好；03、0、05、0、07、08、09、【二、测RN浓度】一、实验准备：01、先知楼21楼-10教室，一个冰盒+EPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10L枪头(RNA专用）、本子+笔；二、操作步骤:01、登记;02、打开电脑=打开“”软件=点击“Nclei aci=选择“O”=选择“RNA；03、灭菌dd H2O清洗23遍,擦干;0、D水校零:即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干；05、测RNA:加样品一滴,点击“measue”，擦干,随后加
4、下一个样品；、记录数据,包括RN浓度(100g/L)、60/8;07、灭菌d H2O清洗-3遍，擦干；8、-80冰箱保存;三、注意事项 23nm代表有机物水平(碳水化合物)，260n代表RNA水平，20n代表蛋白水平,2023表示有机物量，260280代表RN提取量;1。A6nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0。11.。如果不在此范围，稀释或浓缩样品,使之在此范围内;如果吸光度小于0.5,检查是否存在操作因素(如移液不准确，样品内有悬浮物等)影响。DA样品的A260 吸光度值是否0.1.（请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于,其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这
5、些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值0。1）;。A280nm、A2m是蛋白最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯 DN 的 A260/28比值为18,纯RNA为2。0。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1。 相当于50%蛋白质/DN溶液。酚的最大吸收峰在270n.3。 230是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯DA 和 R的260A30比值为2。5。若比值小于2。0 标明样品被碳水化合物(糖类）、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。230产生负值主要是由于在很低N 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一
6、个测定中,需要降低样品的稀释度，A23的负值会被校正。4. 0nm或340n 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是,标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的30一般是0。5.60A20和A023 是核酸纯度的指示值.纯度好的NA或NA,在pH8。5 下260 / A8的比值应该在20 或2。5。纯净的样品比值大于1。8(DA）或者2。0(R）。如果比值低于1.8 或者2。0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物、盐(胍盐)等,较纯净的核酸A0/A230的比值大于2.0.当0。5%BSA蛋白质污染时，蛋白污染会导致26和2
7、80的数值都下降,其净结果是26/28比值下降,但260/20的比值变化并不显著,正如分子克隆3所说。但蛋白残留会导致3的数值显著上升，显著影响20/30的比值。也就是说,如果样品的26080=1。7,20 /2300。5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留.用分光光度计测量RA时，用水而不是用T 缓冲液稀释RA样品会造成A26/A0比值下降。原因是低离子强度和低pH溶液会增加20 nm处的光吸收值。加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染,所以现在一般取400l左右。6.当602301时,只有两种情况.一是胍盐污染,二是蛋白污染。【三、逆转录】一、实验准备:
8、01、进口10枪头(qRTPCR专用)、冰盒一个、00L进口 P管;02、冰上融化1、2、4、2号试剂(提前半小时）;03、二、操作步骤：试剂盒:. 2 2. 0。5L(最后加入) 3. 0。5L 4。 0.5L RNA 00g DEP水-10体系01、200L进口管子:EP管加相应 DEPC水=加号试剂（2L)=加3号试剂（0.L)=加4号试剂(0。）=加号试剂(。L)=加NA离心=上机；02、上机:PEN=点击“Ur”菜单下的“lx,点击“ccept”=选择“r”下面的到“ex01rt”=修改体系“10L”（默认为25微升）=点击“Stat,进入界面;03、37.01min=85.0 5s
9、=.0 0mi;0、冰箱保存;三、注意事项01、加液尽量无气泡,枪不要打到底；、严格冰上操作,防止R降解;【qRTCR】一、实验准备:01、试剂:Roche的Sr Gre（rox）02、1。5mEP管、。2mL EP管、96孔板/八连冠；10L、20L、10L、00L、2。L、10L枪;03、冰盒一个、Rox化冻(避光）、引物化冻（APH)、cD、EPC水；二、操作步骤:01、 ox 1L; dd H2 6L；+ P1(F) (R） + cDNA 2-0L体系02、计算：每个样,X个抗体(至少包括APDH内参,还有目的)，三个副孔。 即如果六个样,个抗体（AH,PK1）,三个副孔。6=120(
10、LK）,6*13=182(GAPDH)；234579112/PK16/PL16/K1PL15P5/PLK1/GP6/GAPGAP5/GP5/GAP5/P4/PK4/L14/PK13/PLK1/PLK3/PLK2/PLK2/PLK12PL11/P111PLK4/GA4/GP/AP3/GAP3GAP3/GA/GAP2/GP2/GAP1AP1/GAPGA PLK1 Ro:10=200 DEC水：620=20 ：1*0=20 R:120=20L GPDH Rx：00=200L DEPC水:2120L F:12= R：=20L03、稀释cDNA 10倍(8L DEPC水+2L)配置Mx(Rox+ EPC
11、水+F+R)=加样(一横排先加8 mi（APDH),随后加入1L i（PLK)。 随后六个孔加同一个cDN；06、去除气泡：加好样后，观察有无气泡。如果有气泡,弹开,随后2000rpm离心，时间不定(s即可）;07、上机+设置程序: A、双击打开程序“StepOn Software v2 ”=点击“ K ”=点击“Ire & ontinu Strtu”=点击“ AdvaceSetup =进入“ xpermt Properte界面 ;B、Expement Poperte界面： 将xpriment Name从Untled 修改为“日期,如2015-1-,将Us Name(Otiona）修改为“ZL
12、”；hich itrument are yo sing t u th exriment ?中选择“96 wells”,一般无需修改； What tp of experimnt do you wan to tup ?中选择“Quntitation-mparveCT（C)”; ih reagns doyou want tose o detect he targ sequce?中选择“SY Green e”; Which ram ed do you wat t use in thensruen n ?中选择“Fa( 40 mitesto copltea run)”；、Pat Stup界面Define
13、 Targtsan Samps界面: Dfin arget栏中:如果有GPH、PLK1、Ak、P3K三个引物，则点击“Add e Targt ”三下,出现“arget1、Trgt2、arget3、Target4”三个=将其重命名; Definemples栏中:如果有6个样品(；.5；;6;9；1)，则点击“Add w Saple ，出现“Sampe 、Smple 2、Samle 3、Sampe 4、ample 5、Smpe 6”六个=将其重命名; Pat ep界面-AsigTaretndSampl界面：GAP/GAP/1GAP/1GP/GA/2GAP/2GP/3GAP/3AP/G/GAP/4G
14、A/4lk1/1k1Plk1/1Pl1/2Plk/Plk1/lk/3Plk/3Pk/3Plk/4Plk1/4Pk1/4Akt1Akt/A/At/2A/Akt2kt/3Akt/3kt3Akt/4A/4Ak/PK/1P3/13K1P3K2PIK/I3K2PIK/3IK3PI3K/PI3K/4I343K/4A/5GPGAPGP6GAP/6Plk1/5Pl15Plk1/5Pk1/6Pl16Pk1Akt5Akt/5t/Ak/6Akt/6Ak/6I3K/P3K/5PI3K/5P3/6PI3K/6I3/D、RunMthod界面:设置温度;随后修改“Reactin Volume PerWell”,将其改为“2体系”； E、点击“Star Rn三、注意事项0、注意一定要禁止气泡。 吸液体时,观察枪头中有没有气泡和液体;打加入液体时,延管壁加入,枪头只能打到第一档，随后观察枪头有没有打尽；0、加入引物时，一定要涡旋混匀;03、Rox加入后,一定要避光；04、加入的液体一定要等量;
