1、制药工程专业毕业论文中国医科大学毕业设计(论文)猪心中细胞色素C的提取工艺研究学 院XX学院专 业制药工程班 级20XX级X班学生姓名学生姓名学 号12345678指导教师X教授202X年3月猪心中细胞色素C的提取工艺研究摘要目的：细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂，细胞色素C与细胞凋亡有密切关系，它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中，以猪心为原料来提取纯化细胞色素C并将细胞色素C进行纯化。方法：取猪心在酸性条件下提取细胞色素C粗品后通过吸附法将细胞色素C进行提纯，并对比不同条件下的提取率。结论：测定其含量为2.85%关键词 细胞色素C；提取；提纯The pig heart in extrac
2、tion and purification of cytochrome CAbstractObjective：Cytochrome C is a kind of cell respiration activator, cytochrome C has close relationship with cell apoptosis, it widely exists in various kinds of animal, plant and microbe, with pig heart as raw material to extract purified cytochrome C and cy
3、tochrome C and purification.Methods：The pigs heart was extracted under acidic conditions, and the cell pigment C was purified by adsorption method, and the extraction rate was compared under different conditions.Results：Determination of its content is 2.85%Key wordsCytochrome C;extract ;purification
4、1 前言细胞色素C溶液用于各种组织缺氧急救的辅助治疗1。目前很多高发的疾病和难以治愈的慢性疾病都和细胞色素C有关。细胞色素C对细胞的凋亡，细胞组织的生长，对细胞器官的发育都有着很大的影响。细胞色素C广泛存在于人体细胞中所以细胞色素C对人体机能的平衡影响也非常大，因此细胞色素C的研究对生物学有着重大的意义。可以说细胞色素C的价值很高应用前景非常的广泛，细胞色素C在不仅临床急救的应用很广而且细胞色素C对很多慢性病的治疗也十分有效。想要得到细胞色素C也十分简单，我们可以从动物体内提取细胞色素C，动物心脏中含有丰富的细胞色素C，本实验正是从猪心中提取细胞色素C。细胞色素是呼吸链中重要的电子传递体，细胞
5、色素包含很多种，细胞色素C只是细胞色素的一种，细胞色素C主要存在于线粒体中，需氧最多的组织及酵母细胞和心肌细胞中，细胞色素C的含量非常的丰富。目前来看,心血管疾病、脑组织损伤、癌症、败血症、糖尿病和神经性的疾病在全球的发病率非常高,在这些疾病中细胞色素C均表现出不同程度的代谢紊乱。细胞色素C是由两个无活性的前体分子合成的，即前细胞色素C和亚铁血红素2。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度，主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。细胞色素C（Cytochrome C）是从猪心中提取的细胞呼吸激活剂，是含铁卟啉的色蛋白质3。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉
6、中含量最为丰富。细胞色素C主要作为电子载体或者氧化还原酶参与细胞的能量传递过程4。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度，主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量5。细胞色素C是细胞凋亡的重要信息物质之一。发展简单、快速的细胞色素C的检测方法对于临床检测和生物学研究具有重要意义6-7。它在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着非常重要的意义8-10外源性细胞色素C是不能进入健康细胞11-12从线粒体中泄露出的细胞色素C有诱导细胞凋亡的作用13-15。在生物氧化过程传递电子中细胞色素C起到了重要的作用16-18。细胞色素C的研究对现代生物药
7、物的研究有着很重要的意义，生物制药是近几十年来研究的热门。而且细胞色素C在临床上应用十分广泛，在抢救患者生命中也扮演者非常重要的角色。细胞色素C能用于各种组织细胞缺氧的治疗，比如一氧化碳中毒的患者还有心肌缺氧的患者都可以通过注射细胞色素C来得到及时的抢救。同时细胞色素C的提取工艺也非常的简单利用其易溶于酸的特性通过简单的吸附法能简单有效的得到细胞色素C提取物，原料的来源也非常多，动物的心脏含有非常丰富的细胞色素C。所以细胞色素C的药物制品是一种非常廉价又使用效果很好的药物，非常值得研究和发展。通过本实验的研究希望能更好的利用细胞色素C来防治疾病。2 材料与方法2.1 实验材料与仪器2.1.1
8、实验材料猪心（市场购买的新鲜猪心）；2mol/L H2SO4溶液；1mol/LNH4OH（氨水）溶液；0.2%NaCl溶液；25%（NH4）2SO4溶液：100ml溶液中含25g（NH4）2SO4，约为25摄氏度时40%的饱和度；BaCl2试剂（称BaCl212g溶于100ml蒸馏水中）；20%三氯乙酸（TCA）溶液；人造沸石（Na2OAl2O3xSiO2yH2O）：白色颗粒，不溶于水，溶于酸，选用60-80目：联二硫酸钠。2.1.2 实验仪器绞肉机；电磁搅拌器；电动搅拌器；离心机；722型分光光度计；玻璃柱（2.5cm*30cm)一根；烧杯不同容量若干；500ml下口瓶；量筒，移液管，玻棒，
9、抽滤机，透析纸，滤纸，纱布，玻璃漏斗。2.2实验方法2.2.1细胞色素C的提取取新鲜的猪心一颗，去除血块、肌腱和脂肪，切成条块状洗掉血液，用绞肉机将其绞碎。称取心肌碎肉，加入1到2倍量的蒸馏水搅拌均匀，用1mol/L的硫酸调整PH到4左右，在常温条件下搅拌提取两个小时，然后进行压滤，滤液用1mol/L的氨水调节PH至6.2，离心，得到提取液。滤渣再加等量蒸馏水同上方法重复提取一次，合并两次提取液。提取液加入2mol/L氨水调节PH至7.5，再在冰浴中静置沉淀杂蛋白，吸取上层清液，每升提取液加入10g人造沸石，搅拌吸附40分钟，静置去掉上层清液。收集吸附细胞色素C的人造沸石，再用蒸馏水洗涤三次，
10、2g/L的氯化钠洗涤4次，再用蒸馏水洗至洗液澄清为止。过滤抽干，装入柱内用25%硫酸铵溶液进行洗脱，得到洗脱液。2.2.2细胞色素C的纯化将洗脱液加入固体硫酸铵达到45%的饱和度（相对密度1.21到1.23），使杂志蛋白析出，然后过滤。收集透明液体，然后慢慢加入20%的三氯乙酸（25ml/L，按体积计算），边加边搅拌使细胞色素C沉淀析出，离心收集沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，装入透析袋中，用常水和蒸馏水透析至无硫酸根为止，最后过滤得到细胞色素C粗品溶液。粗品溶液通过处理好的Amberlite IRC-50(NH4)树脂柱吸附，然后将树脂移入大烧杯中，用水洗到澄清为止，再分别上柱，用0.6mol/L磷
11、酸氢二钠-0.4mol/L氯化钠混合溶液洗脱，流速2ml/min。洗脱液用蒸馏水透析去离子，得到细胞色素C精致液。2.3细胞色素C的含量测定本实验得到的细胞色素C是氧化型和还原型的混合物，因此在测定含量时，要加入联二亚硫酸钠，使混合物中的氧化型细胞色素C转变为还原型。还原型的细胞色素C水溶液在波长520mm处有最大吸收值，根据这一特性，用国产722型分光光度计选一标准品，做出细胞色素C浓度和对应的光吸吸收值的标准曲线，然后根据所测溶液的光吸收值，由标准曲线的斜率求出所测样品的含量。3 结果与分析3.1细胞色素C提取纯化试验结果3.1.1细胞色素C提取时料液比对结果的影响分别称取50g取绞碎后的
12、猪心肌肉糜,用蒸馏水浸提,分别加入蒸馏水为50mL、100mL、150mL、200mL，在pH为4.0条件下30浸提2小时，提取液采用人造沸石吸附,（NH4）2SO4洗脱，三氯乙酸沉淀法纯化得到细胞色素C粗品。5mL蒸馏水溶解细胞色素C粗品后，520nm处测吸光值考察料液比对提取效果的影响。结果图1表明随着水量的增大吸光值越大，料液比为1:2时为最佳提取条件。图1 吸光度随蒸馏水量的变化3.1.2细胞色素C提取时PH对结果的影响100mL蒸馏水，温度为30，选择提取 pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0，浸提 2h，提取液采用人造沸石吸附，（NH4）2SO4洗脱，三氯乙酸沉淀法纯化得到
13、细胞色素C粗品。5mL蒸馏水溶解细胞色素C粗品后，20nm处测吸光值，考察pH对提取效果的影响。图2表明PH为4.0时吸光值最大，所以PH为4.0时为最佳的提取条件。图2 吸光度随PH的变化3.1.3细胞色素C提取时温度对结果的影响分别称取 50g 取绞碎后的猪心肌肉糜，加入100mL 蒸馏水，分别在 25、30、35、和 40条件下，pH 为4.0，浸提 2h，提取液采用人造沸石吸附，（NH4）2SO4 洗脱，三氯乙酸沉淀法纯化得到细胞色素 C 粗品。5mL蒸馏水溶解细胞色素C粗品后，520nm处测吸光值，考察浸提温度对提取效果的影响。图3表明温度在30时吸光值最大，所以最佳的提取温度条件为
14、30。图3 吸光度随温度的变化3.2 细胞色素C得率的测定取1ml标准品(80mg/ml)，稀释至25ml，从中分别取得0.2,0.4,0.6，0.8,1.0ml，分别放置在5个试管当中，每管补加蒸馏水到4ml，并加入少许联二亚硫酸钠作为还原剂，然后在520mm处测得吸光值分别为0.177,0.328,0.517,0.699,0.867。以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，作出标准曲线图4。图4 细胞色素C浓度吸光值标准曲线图反复实验结果得知520mm处测平均吸光值为0.305。据图4得知浓度测得得率为2.85%4 讨论本次实验主要利用了细胞色素C在酸性条件下溶解度大，利用吸附法将细胞色素C吸附并
15、提取纯化。吸附法设备简单操作方便，廉价安全，吸附洗脱过程中PH变化小，较少引起生物活性物质失活。本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量的操作简单方便。并且比较了不同条件下提取纯化对提取结果的影响，用最佳的方式提取并得到了细胞色素C纯化制品。细胞色素C的研究对生物学有着非常重要的意义19-20。本次实验受到实验幻境的影响和多方面的因素，因此本次试验存在一定的误差，需要经过多次反复操作方可符合要点要求。参考文献1肖云.从猪心中提取纯化细胞色素C工艺研究N.武汉.武汉职业技术学院.2015.22王艳杰，邓雯，张鹏飞.细胞色
16、素C与细胞凋亡研究进展J.动物医学进展，2012，（20）：15-183李六水.细胞色素C对庆大霉素、依替米星致大鼠肾小管毒性的预防作用研究D.安徽 .安徽医科大学.2012.5.14付慧慧.Shewanella oneidensis呼吸替补通路及细胞色素c成熟机制的研究D.浙江.浙江大学.2016.4.15马志科.秦川牛心肌细胞色素C和辅酶Q10提取纯化及检测的研究D.西北农林科技大学.2015.11.16尹雪花.新型纳米材料的制备及其在细胞色素C检测中的应用D.湖南.湖南大学.2016.5.17赵丹，贺莉芳，刘晖，李晓飞，刘流，晏容.线粒体、细胞色素C、Caspase与细胞凋亡J,医学动物
17、防治,2012，（07）：20-268吉浩宇,王小龙.早期激素性股骨头坏死过程中细胞色素C的作用J.中国组织工程研究,2016，（05）：35-389韩蕊.Shewanella oneidensis MR-1外膜细胞色素c介导的胞外电子传递过程研究D.华南理工大学.2016.6.2610覃芳.细胞色素C氧化酶的表达、纯化及其活性测定D.湖南.湖南大学.2013.6.111叶平，宋金辉，侯连生.细胞色素C在盘基网柄菌细胞凋亡中的作用J.动物学杂志，2015，（08）：50-5512刘萍,丛国正,独军政,邵军军,林彤,常惠芸.细胞凋亡信号传导通路的研究进展J. 湖北农业科学，2013，(03)：2
18、0-2313刘畅,王筠,姜丁文.内质网应激在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用J.广东医学，2012，(01)：36-4014马宇洁,杨兴易,林兆奋,缪明永,张雷,宁波.大鼠心肺复苏后神经细胞线粒体通透性转换孔变化在细胞色素C释放中的作用J.中华急诊医学杂志，2013，(10)：11-1315金苗.Shewanella oneidensis细胞色素C成熟系统及亚硝酸盐抑制其延胡索酸呼吸分子机制的研究D.浙江.浙江大学.201616高小娥.猪心中细胞色素C的提取与鉴定J.南方农机，2016，(10)：23-2617王佺荃,张文丽,元小冬,彭伟,骆泓洁.线粒体在细胞凋亡中的作用J.中国医学创新，2015
19、，(06)：30-3218沈泓,林琼秋,易喻,梅建凤,庄震远,应国清.应用疏水层析法纯化hcg单克隆抗体J. 药物生物技术，2012，(05)：29-3119张瑜.细胞色素C在硼掺杂金刚石电极上的电化学特性研究J.天津.天津理工大学.201420唐乾,史珊珊,曹洪玉,郭相金,张涛,郑学仿.细胞色素C与NO的反应机制J.无机化学学报，2015，(08)：23-27致谢不知不觉我在xx的四年学习时光过去了，在这四年中特别感谢我所有的老师，他们严谨敬业，认真负责。在本次论文实验中，实验室的整个过程都在麻烦xx老师并得到了他无私的帮助，在此特别的感谢他。同时也非常感谢实验室里所有同学的帮助。在整个论文
20、中，无论论文的选题、资料的搜集、实验的操作以及论文的撰写和修改，最感谢的人是指导老师朱丹丹，感谢她所有的细心指导和大力支持以及鼓励。毕业在即，感谢所有老师和同学的陪伴。毕业在即，在今后的工作和生活中，我会铭记师长们的教诲，继续不懈努力和追求，来报答所有支持和帮助过我的人！文献综述细胞色素C的研究进展摘要：目前,心血管疾病、脑组织损伤、癌症、败血症、糖尿病和神经性的疾病在全球的发病率非常高,在这些疾病中细胞色素C均表现出不同程度的代谢紊乱。许多中药提取物、有效部位和化学成分对这些疾病有良好的治疗作用和较小的副作用。中药主要是通过影响疾病相关组织或细胞线粒体内的细胞色素C的产生或释放,调控相应靶细
21、胞的凋亡,进而防治相应的疾病。查阅近年来的相关文献报道,综述了通过调控线粒体通路细胞色素C实现治疗疾病的中药提取物、有效部位和化学成分,希望能提高防病治病中作用机制的认识。 关键词：细胞色素C；药理作用；疾病防治 1 前言细胞色素是包括多种能够传递电子的含铁蛋白质的总称，它广泛存在于各种动植物和微生物中。细胞色素的呼吸链中极其重要的电子传递体，细胞色素C只是细胞色素的一种，它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中，细胞色素C的含量十分丰富1。细胞色素C溶液用于各种组织缺氧急救的辅助治疗，如新生儿窒息、一氧化碳中毒、氰化物中毒、催眠药中毒、严重休克期缺氧、脑震荡后遗症、脑血管意外、
22、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心机缺氧的治疗2-5。人类疾病的发生主要与细胞的凋亡和增值密切相关，局部的细胞凋亡和增值失去平衡了之后，就会引发各种疾病。线粒体凋亡途径中，细胞色素C起着非常重要的作用6-7。细胞色素C的研究对生物学有着重大的意义。细胞色素C易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。在pH7.5时细胞色素C呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。细胞色素C是由一条含有104个氨基酸残基的多肽链及具有氧化原活性的血红素组成的，其生理功能的发挥也伴随着分子构象的变化8-10，分
23、子内各集团所处的微环境也随之改变。天然的细胞色素C主要是螺旋血红素上的铁原子与两个轴向配体配位11-13。细胞色素C是粒体内膜上的嵌入蛋白，位于线粒体内膜外侧。细胞色素C是由两个无活性的前体分子合成的，即前细胞色素C和亚铁血红素。2 细胞色素C提取纯化的研究2.1 细胞色素C性质通过文献可以得知细胞色素C为含铁的结合蛋白质，分子量大约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基构成的。他溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，所以可以从酸性溶液中提取，制品可为还原型和氧化型两种，氧化型水溶液呈红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使其变性，引起部分失活。
24、2.1.1 细胞色素C的提取细胞色素C易溶于酸溶液，首先取猪心去血块脂肪和肌腱等，然后切成块状洗去血液在绞肉机中绞碎，称取心肌碎肉，加入1到2倍量的蒸馏水搅拌均匀，用1mol/L的硫酸调整PH到4左右，在常温条件下搅拌提取两个小时，然后进行压滤，滤液用1mol/L的氨水调节PH至6.2，离心，得到提取液。滤渣再加等量蒸馏水同上方法重复提取一次，合并两次提取液。提取液加入2mol/L氨水调节PH至7.5，再在冰浴中静置沉淀杂蛋白，吸取上层清液，每升提取液加入10g人造沸石，搅拌吸附40分钟，静置去掉上层清液。然后收集吸附细胞色素C的人造沸石，然后再用蒸馏水洗涤三次，2g/L的氯化钠洗涤4次，再用
25、蒸馏水洗至洗液澄清为止。过滤抽干，装入柱内用25%硫酸铵溶液进行洗脱，得到洗脱液。2.1.2 细胞色素C的纯化洗脱液加入固体硫酸铵达到45%的饱和度（相对密度1.21到1.23），使杂志蛋白析出，然后过滤。收集透明液体，然后慢慢加入20%的三氯乙酸（25ml/L，按体积计算），边加边搅拌使细胞色素C沉淀析出，离心收集沉淀。再将沉淀溶于蒸馏水，装入透析袋中，先用常水后用蒸馏水透析至无硫酸根为止，过滤得到细胞色素C粗品溶液。粗品溶液通过处理好的Amberlite IRC-50(NH4)树脂柱吸附，然后将树脂移入大烧杯中，用水洗到澄清为止，再分别上柱，用0.6mol/L磷酸氢二钠-0.4mol/L氯
26、化钠混合溶液洗脱，流速2ml/min。洗脱液用蒸馏水透析去离子，得到细胞色素C精致液。3 细胞色素C的药理作用研究3.1 缺氧急求研究本品用于组织缺氧的急救和辅助用药，比如一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等问题。根据文献可以得知细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程,在机体生长发育、细胞分化和病理状态中起着重要作用,已成为近30年来研究热点。线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用,而细胞色素C从线粒体释放到胞浆细胞是凋亡程序关键的一步,在凋亡机制中发挥着重大作用。细胞色素C在急救患者缺氧窒息和一氧化碳中毒有着
27、非常好的效果14。3.2 细胞色素C与细胞凋亡的研究线粒体细胞色素C释放在细胞凋亡过程中起重要作用。细胞的凋亡是当前生物学领域中研究的最新课题之一。细胞的凋亡在保证多细胞生物健康生存的过程中扮演着关键角色,对个体的正常发育具有非常重要的作用。它在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着非常重要的意义。目前对与细胞凋亡的研究已进入分子水平,在细胞凋亡的机制、相关基因及其应用方面都取得了不小的进展。细胞色素C 是线粒体呼吸链的重要组成部分,它是由两个无活性的前体分子合成的:前细胞色素C(该蛋白质由细胞核基因编码, 然后被转运至线粒体)和亚铁血红素(由线粒体合成)。由于细胞色素 C 具有
28、亚铁血红素基团, 它可以在呼吸链复合酶 (细胞色素还原酶)和 IV(细胞色素氧化酶)之间传递电子。细胞色素 C 缺乏时, 电子传递链被阻断,将导致两方面的后果:ATP 合成减少及不完全氧化造成的超氧阴离子(ROS)过度生成 ,而ROS是诱导凋亡的重要因素14。4 结论跟据大量文献的报道，许多研究表明细胞色素C在脑缺血损伤所致的凋亡中起到非常重要的作用15-17。线粒体在凋亡过程中起中心控制作用 ,而线粒体因子如细胞色素 C 的释放则是支配细胞命运的关键因素18-19。对这一信号途径及其相关事件的认识对进一步了解凋亡的正常生理和病理过程,它在肿瘤及神经退行性疾病中的调控 , 以及新型细胞毒药物和
29、细胞保护药的发展具有重要意义。研究细胞色素C对许多疾病的治疗有非常重要的意义20。参考文献1王艳杰，邓雯，张鹏飞.细胞色素C与细胞凋亡研究进展J.动物医学进展，2012，（3）：15-182肖云.从猪心中提取纯化细胞色素C工艺研究D.武汉.武汉职业技术学院.2015.23杨泽栋,李永东.细胞色素C评价心肌细胞凋亡的研究进展J.医学综述，2012，（03）：33-364李六水.细胞色素C对庆大霉素、依替米星致大鼠肾小管毒性的预防作用研究D.安徽 .安徽医科大学.2012.5.15付慧慧.Shewanella oneidensis呼吸替补通路及细胞色素c成熟机制的研究D.浙江.浙江大学.2016.
30、4.16陈剑钰，林兵，张宏，秦路平.中药调控细胞色素C的研究进展J.现代药物与临床，2014，（08）：33-367刘晓婷,王延让,张明.线粒体介导细胞凋亡的研究进展J.环境与健康杂志，2013.（02）：15-198阎海.细胞凋亡研究进展J.中山大学研究生学刊(自然科学.医学版)， 2012，(03)：28-319刘萍,丛国正,独军政,邵军军,林彤,常惠芸.细胞凋亡信号传导通路的研究进展J. 湖北农业科学，2010，(03)：19-2410高小娥.猪心中细胞色素C的提取与鉴定J.南方农机，2016(10)：23-2611王佺荃,张文丽,元小冬,彭伟,骆泓洁.线粒体在细胞凋亡中的作用J.中国医
31、学创新，2015，(06)：30-3212赵丹，贺莉芳，刘晖，李晓飞，刘流，晏容.线粒体、细胞色素C、Caspase与细胞凋亡J,医学动物防治,2012，（07）：20-2613朱玉山,陈俭.线粒体与细胞凋亡调控J.生命科学，2013，(04)：22-2314李超,伏圣博,刘华玲,马欣荣.细胞凋亡研究进展J.世界科技研究与发展，2013，(03)：18-2115马志科,昝林森.细胞色素C在生物医学方面的研究进展J.畜牧兽医杂志，2014，(05)：17-2216方希敏,陈铭珍,陈日玲.细胞色素C与细胞凋亡J.国外医学，临床生物化学与检验学分册，2013，(01)：35-3817刘畅,王筠,姜丁文.内质网应激在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用J.广东医学，2012，(01)：36-4018马志科,昝林森,张双奇.秦川牛心肌细胞色素C提取纯化及鉴定的研究J.家畜生态学报，2014,(03)：11-1319黄林,陈传平.马心细胞色素C含量测定的几种方法比较J.安徽农学通报，2015，(13)：31-3320尹雪花.新型纳米材料的制备及其在细胞色素C检测中的应用D.湖南.湖南大学.2016.5
