1、病原菌与环境中重要微生物功能基因分析12. 病原菌与环境中重要微生物的功能基因组分析Dorothea K Thompson Jizhong Zhou魏华译；刘妍初校；朱晨光复校12.1 介绍 病原菌的致病机理，特别是动物宿主与引起它们患病的病原菌之间相互作用的分子基础与分子调节是非常复杂的，并且涉及多个毒力因子的共同控制。生理特性与毒力特性的广谱性是多种基因功能表达紧密协调的一种反映。通常，病原菌的感染循环始于黏附并定植于宿主，然后（有时）细菌侵袭宿主组织或细胞，存在于宿主细胞中并在宿主细胞中繁殖，最后释放出来再感染新的宿主（参见Finlay与 Falkow1997年发表的一篇综述）。微生物感
2、染被复杂的调节网络所调控，包括种特异性的细胞与细胞之间的交流。20世纪90年代中期, 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)全基因组序列的发表（Fleischmann 等人发表于1995年）标志着基因组时代的来临，研究全基因组范围内细菌毒力特征的分子特性的方案使科学家对细菌致病机理的研究方式发生改变。目前，已经有至少25个亲源关系很远的病原菌全基因组序列得到解析，并且，其它一些病原微生物的全基因组序列的测定工作也正在进行中（见第二章）。我们已经知道了一些病原菌如幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）(Tomb等人，1997；Alm等人，1999)，结核分枝杆
3、菌（Mycobacterium tuberculosis）(Cole等人，1998)，生殖道支原体(Mycoplasmagenitalium)(Fraser等人， 1995)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) (Stover等人，2000)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(Hoskin等人，2001)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(Heidelberg等人，2000)，单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes) (Glaser等人，2001)的全基因组序列信息，最近炭疽芽胞杆菌(Bacillu
4、s anthracis)(Read等人，2003)的全基因组序列也被测出。大量的环境中重要的真菌与古菌，包括金属离子还原菌Shewanella oneidensis（Heidekberg, 2002），耐放射异常球菌Deinococcus radiodurans (White等人，1996b)，耐高温多型古菌 Pyroccus furiosus(Robb等人，2001)的全基因组序列也已经被测定（见第二章）。一个微生物全基因组的生物信息学分析可用来寻找与感染相关的基因，以及潜在的抗生素药物作用的新靶点。比较分析多个种系相差很大的病原微生物和种系相近的病原微生物，可以揭示天然群落中细菌基因的易变
5、性，种属多样性的分子机制，以及细菌致病机理的进化与引起不同发病情况的菌株特异性的基础。由于大量的古菌已被测序，比较基因组可以揭示古菌（特别是crenarchaeal和euryarchaeal分支）、细菌、真菌之间的差异。另外，象DNA微阵列这类功能基因组工具对我们理解微生物感染后导致宿主临床病变的一些宿主的基因表达起了非常重要的作用。最早应用微阵列技术对环境中重要微生物功能基因的研究主要针对少量的几个使微生物能在恶劣环境中生存的特定基因，如这些基因的功能、调节网络、基本的表型以及特异的酶系统等。最终，蛋白组学将加深我们对基因功能的了解，为预测毒力因子和未知基因以及了解病原微生物的转录后与翻译后
6、调节作用提供新的视角。本章将讨论基因组序列与生物信息学分析在鉴定毒力因子中的作用、比较基因组在病原微生物的基因多样性与进化中的作用、基于遗传和微阵列的技术在阐述基因功能、宿主与病原菌相互作用及细菌发病机理的蛋白组学。大量的病原菌序列已被测序，还有一些序列目前正在测定，每一个病原微生物序列的复杂信息就不在这章讨论了。我们将在本章通过介绍我们选择的研究文献，讨论功能基因组与比较基因组对微生物致病性的理解。最后，我们将讨论基因组数据怎样有利于我们对微生物与环境相关表型（如金属还原细菌的生物修复）的理解，并为研究极端环境（高温、高pH、高盐）中微生物生存的分子机制与特征提供便利。12.2通过基因组序列
7、与功能注释研究细菌的致病机理 病原菌可以感染动物与植物细胞，逃避宿主免疫防御与抵御抗生素制剂，在不同的细胞外与细胞内环境中存活。由于细菌有如此多样的致病机制，就需要一个可根据细菌的数目与种类而变化的紧密调节的毒力因子库。尽管很多毒力因子是宿主特异性的，但还是有少量机制是多种细菌共同表达一些广谱的毒力表型（参见Finlay与 Falkow1997年发表的一篇综述）。这些共同机制表明至少一些病原菌的基本毒力机制是拥有不同微生物种类中存在保守性的古代进化起源（Rahme等人，2000）。 传统方法对病原菌的研究是耗时的，线性的，且只针对一个基因或一个蛋白的研究。基因序列分析与高通量的工具如DNA微阵
8、列的应用（见第6章）使得对微生物感染相关的多个基因和蛋白可同时平行鉴定并进行功能分析。病原菌的全基因组序列可被用于很多领域，从鉴定新的毒力相关基因与致病岛，到设计新的抗微生物制剂（见13章）。在本章，将讨论用生物信息学技术在全基因组范围内寻找多种毒力基因的侯选基因、可重复的DNA元件以及水平获得的如致病岛之类DNA序列。12.2.1 从序列同源性预测毒力基因 对一个微生物全基因组序列的认识，使我们可以在公共数据库中基于已知的毒力因子来预测毒力基因。但要注意，并不是在所有情况中序列相似的基因都具有相似的功能。在鉴定一个假定的毒力基因的时候，对假定的毒力基因是否具有与已知的同源毒力基因相同的功能，
9、经验性的决定是必不可少的。用大量的基因组数据来鉴定假定的毒力基因存在着限制，因为生物信息技术只能识别功能已被阐述清楚的候选基因。对细菌基因组序列的比较分析提示很大部分（通常30-40%）预测的基因为未知功能或只能假定其功能的基因。基于序列信息本身，很难简单预测毒力基因的新功能或未鉴定的基序(Weinstock，2000)。为了鉴定可能的毒力相关基因，有必要在数据库中寻找更具普遍特征的蛋白序列如与跨膜或分泌蛋白相关的那些序列，因为与宿主致病相关的毒力因子常定位于细胞表面或用于胞外运输（Weinstock，2000）。如脑膜炎奈瑟氏菌（N. meingitidis）的一个毒力血清B株（MC58）的
10、全基因组序列被用于寻找潜在的可开发成基因疫苗的新毒力基因（Pizza等人，2000）。脑膜炎奈瑟氏菌基因组的开放阅读框（ORF）已被用于序列分析、结构基序分析和其他典型的与表面或输出相关的蛋白特征分析，这些蛋白包括跨膜结构域、导肽、已知的表面蛋白同源体、脂蛋白信号、外膜蛋白锚定基序与宿主细胞结合域。最终，基于基因组序列的全基因表达谱可用于寻找与已知的毒力基因共同调节表达的新毒力基因。 目前可以用快速且容易理解的方式，从一个生物体的全基因组序列中获得新的生物信息(Hood等人，1996a，b ；Pizza等人，2000)。如流感嗜血杆菌Rd基因组的1.8Mb序列已很好的用于寻找负责生物合成脂多糖
11、（LPS）的假定毒力基因与结构成分（Hood等人，1996b）。除了是主要的毒力决定因子外，LPS在维持革兰氏阴性细菌的外膜完整性和其功能上也具有重要作用（Strauss Falkow 1997）。通过在流感嗜血杆菌的基因序列数据库中搜寻与已知的其它细菌生物合成LPS的基因相似的DNA与氨基酸序列，得到25个LPS基因的候选基因。序列信息保证了可以进行设计合并构建这25个基因上产生靶向中断所必需的克隆。免疫化学技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离技术和质谱分析（MS）为在大量的候选基因中确定潜在的LPS生物合成基因和估计幼鼠的血管内散播所必须的LPS最小结构提供了可能（Hood等人，199
12、6b）。这样的研究具体说明了计算机技术可以怎样应用于寻找编码假定的毒力基因序列以及如何应用这样的数据来加快鉴定实验假设的任务。12.2.2 重复的DNA元件提示潜在的毒力因子根据序列的同源性，重复的DNA序列提示可能为毒力基因。在许多致病菌中，如流感嗜血杆菌、奈瑟氏菌的某些种、金黄色葡萄球菌（见表12.1）的重复DNA序列都与毒力因子的表型或相变相关。许多编码细胞表面毒力因子基因的一个特征是在翻译读码框的5末端存在单核苷酸重复、二核苷酸重复或三核苷酸重复。一些假说比如滑动链的错配学说（Levinson 与Gutman等人，1987）或基因重组机制(Van Belkum等人，1998)可解释重复
13、核苷酸序列的改变，而重复核苷酸序列的改变又通过改变读码框基因从而调节表面暴露蛋白的表型。滑动链的错配学说认为通常高重复DNA的三级结构导致重复序列附近DNA序列的错配。根据链的方向与DNA聚合酶介导的DNA合成，DNA 重复可被插入或缺失，引起开放阅读框的移框现象（Coggins O Prey，1989；Van Belkum等人，1998）。毒力相关因子的表型变化是病原微生物逃避宿主免疫应答，适应宿主中不同微环境的一个策略（参见Finlay与 Falkow1997年发表的一篇综述）。例如流感嗜血杆菌的菌毛一种细菌黏附到呼吸道上皮细胞的所必须的黏附蛋白，这种蛋白的相变与二核苷酸TA的重复相关（V
14、an A lphen等人，1991）。与之类似，脂多糖生物合成基因读码框的5末端包含多个串联CAAT或GCAA重复序列，与翻译的转换相关（Jarosik 与Hansen，1994；Weiser等人，1989）。 由于重复DNA序列在细菌致病性中的重要作用，可以通过搜寻基因组中串联寡核苷酸重复序列来鉴定可能的新毒力因子。Hood与coworkers采用这样的方法在流感嗜血杆菌的Rd株的假定ORF中找到9个新的包含多个（6-36）串联的四核苷酸重复（Hood等人，1996a）。这些基因编码瑟氏菌的血色素受体蛋白或糖基转移酶（lgtC基因产物）的同源体，或编码耶尔森氏菌的一个黏附蛋白（yadA）。另
15、外，三个目前已鉴定与LPS生物合成相关的基因也包含多个重复的CAAT，证明可用全基因组序列来寻找毒力因子。进一步研究其中的一个新位点lgtC，表明表12.1 病原菌中的短DNA重复序列与其相关功能种重复序列基因基因的功能参考文献流感嗜血杆菌CAATLic1-lic3LPS生物合成Hood 等人(1996a)GCAAYadA黏附素Hood 等人(1996a)GACALgtC糖基转移酶Hood 等人(1996a)TTGGNda离子结合蛋白Hood 等人(1996a)AGTCND限制性修饰 甲基转移酶Hood 等人(1996a)TTTAND未知的杆菌类似物Hood 等人(1996a)TAHifA/B
16、菌毛合成Van Ham等人(1993,1994)脑膜炎奈瑟球菌GIsi2LPS生物合成Burch等人(1997)CTCTTOpa不透明表面蛋白Meyer等人(1990)AOpa不透明表面蛋白Meyer等人(1990)GPorA外膜蛋白Van der Ende 等人(1995)金黄色葡萄球菌93bpFnb*结合蛋白Patti等人 (1994)561bpCan胶原质黏附素Patti等人 (1994)81bpCoa凝固酵素Goh 等人(1992)GAAGAX4AAXAAXCCTXGXAAASpa蛋白AClewell(1993)GAXTCXGAXTCXGAXAGXClf凝集因子，纤维蛋白受体McDev
17、itt与 Foster(1995)aND，无详细说明这个基因与脂多糖表位的表型转换有关，并且其在新生鼠模型中与流感嗜血杆菌的全毒力相关。这个研究清楚说明了如何用全基因组序列信息获得生物学相关的实验数据并用于病原菌生物学研究（Hood等人，1996a）。12.2.3病原菌的进化：基因的获得与丢失全基因组序列的获得与它们的序列比较为研究基因转移在病原菌进化中的作用提供方法（Ochman与 Moran，2001）。基因的水平转移通过从染色体上引入或删除DNA重构基因来改变基因指令。基因获得与缺失的机制（如转化、转导、结合）在第四章有详细的介绍。点突变的积累可以通过调节毒力表型与改变已有基因的表达来增
18、加微生物的多样性，然而逐步的突变则很少形成新的功能或使细菌适应新的环境(Lawrence，1997; Lawrence 与Ochman，1998)。相反，基因横向转移，也就是可移动的遗传因子在细菌中传递，将导致遗传信息的获得或丢失，这对尤其是在新的病原体出现的紧急情况下的基因组进化与细菌物种形成起着重要作用(Ochman等人，2000；Ochman 与Moran，2001)。 基因水平或横向转移的发生率可以用DNA序列分析的方法研究。根据碱基比对，大部分细菌的种的基因序列（G+C含量），密码子使用的偏好，二核苷酸与三核苷酸的频率是相对同源的(Muto与 Osawa，1987；Karlin等人，
19、1998)。新的序列，象通过基因的横向转移获得的外源基因致病岛（下面讨论），保持其供体基因的序列特征，因此可以从G+C含量与密码子使用的模式上把它们和亲代的垂直传播区分开来(Ochman等人， 2000)。基因横向转移范围的确定目前通过全基因组序列比对已经实现。在已测序的细菌基因组中，横向获得的外源DNA的积累量各有差异：如12.8%的大肠杆菌K12基因组，3.3% 结核分枝杆菌基因组，4.5%流感嗜血杆菌基因组，6.2%幽门螺杆菌26695的基因组来自横向获得的外源DNA(Ochman等人，2000)。基因组DNA的水平转移（流动性）、基因多样性的意义以及病原菌的进化将在下面讨论。致病岛 编
20、码毒素、黏附因子（介导黏附到宿主细胞表面的蛋白）、分泌系统的成分、干扰血清抗性的蛋白与其它因子的基因和毒力基因一起决定发病的条件。这种疾病的决定基因可以存在于可转移的基因元件上（转座子，质粒，细菌噬菌体），或者存在于细菌染色体中的一些不连续的称为致病岛（PAIs）的片段中(Hacker等人1997年的一篇综述；Hacker 与Kaper，2000；Grousman与 Ochman，1996)。测序分析PAIs表明，这些致病岛大部分源于基因的水平转移，因此可能在形成新的致病突变种或致病表型中起重要作用（Hacker与 Kaper，2000）。然而这种可以改变细菌天然种的横向基因转移并不是不加选择
21、的。换句话说，那些特定的细菌在获得致病岛之前已经具有形成病原菌的一些条件：因为它们已经拥有在宿主细胞中生存的能力，如抵御宿主防御的能力与营养缺陷的代谢补偿能力(Ochman 与Moran，2001)。PAIs区别于其他基因组序列的特征，微生物的PAIs以及PAIs的调节将在本节讨论。从全基因组序列中区分出PAIs 在基因组测序中最常见的主题是G+C含量与密码子的使用是否同源（Hacker 与Kaper，2000，Karlin，2001）。如果一个基因的密码子使用与基因组中其它序列基因的密码子使用有明显差异，这个基因可能来自水平转移（Finlay与 Falkow，1997；Hacker与Kape
22、r，2000；Ochman等人，2000），将其归为假定的外源基因（pA）（Karlin，2000）。细菌中假定的外源基因与反常的基因簇（有时指基因岛）和致病岛相关。在测序中可以通过5个分析MNA序列的准则来发现已测序基因组中反常的基因区（Karlin，2000）。(i) G+C含量的差异 标准的辨别象致病岛这样的异常基因区的评估方法是在变化窗口W（W在长度上相当于10，20，或者直到50kb）中与平均基因组的G+C含量进行比较。比较发现G+C含量与基因组剩余序列中G+C含量有很大差异的窗口可能是潜在的基因岛。(ii) 基因组标签的比较 每一个基因组都有一个区分于其它细菌基因组的标签（sign
23、ature）（Campbell 等人，1999 ；Karlin，1998； Karlin等人，1997）。一个基因组标签是一套二核苷酸的相对丰度值，二核苷酸的相对丰度值是所观察的二核苷酸频率与随机选择的相邻序列中预期二核苷酸频率的比值（Campbell 等人，1999）。与基因组平均标签的差异或二核苷酸的偏好都提示DNA的外源性。(iii) 密码子的偏好 统计所有基因的密码子偏好并与基因组中平均基因进行比较，与经典密码子的应用存在明显差异的一个基因或一组基因可能代表一个PAI。(iv) 氨基酸应用的分歧 比较组成蛋白的氨基酸偏好性与决定蛋白组的平均氨基酸频率。在翻译阅读框中，氨基酸的使用与平均
24、蛋白氨基酸的使用存在明显差异的区域可能组成基因岛或PAI。密码子的偏好与氨基酸的偏好都是基因组组成的测定方法。(v) 假定外源基因簇 如果一些基因与平均基因、核糖体蛋白基因、翻译与转录过程中加工因子的基因和伴侣基因的密码子利用率差异很大，那么这些基因都被标记为假定的外源基因。这些假定的外源基因可能代表包含致病岛的毒力相关基因。PAIs已经在尿路与肠道分离出的大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，幽门螺杆菌，和特定的革兰氏阳性细菌中（见表12.2，Hacker等人，1997）被鉴定出来，另外多个致病岛也可以在同一株细菌中存在(Mecsas 与Strauss，1996)。因为PAIs不断的在多组病原菌中发现，
25、特别是作为微生物基因组序列的一部分，它们的共有特征已被发现，这使得PAIs可以根据一系列标准被定义（Hacker 与Kaper，2000；Hacker等人，1997）。(1) PAIs 毒力相关基因，象黏附因子，毒素，III型分泌系统等。（2）PAIs广泛分布于病原微生物的基因组中，而在无侵袭能力的相同菌株或密切相关的共生菌株的基因组中不存在。（3）PAIs在微生物基因组中占有相对较大的区域，在长度上10-200kb，它们的G+C含量与密码子的利用明显区别于核心基因组。（4）PAIs常被短的重复序列（9-135bp）与插入元件包围。这种特异的边界序列与整合酶编码序列以及其它移动位点的存在，提示
26、PAIs是由重组介入到染色体中的（Hacker与Kaper，2000；Mecsas与 Strauss， 1996）。直接重复与IS可能是重组酶的靶点，导致一些PAIs的遗传不稳定（Hacker等人，1997）。(5) PAIs经常与转运RNA（tRNA）基因相关，tRNA可能是整合外源DNA的“基因组路标”（Hacker等人，1997）PAIs对毒力表型的贡献 这部分是通过着眼于具有重要致病性的革兰氏阴性杆菌，来阐述PAI相关毒力决定因子的多样性。肠杆菌家族的成员是肠道与尿路感染的病原菌。肠道与尿路大肠杆菌的染色体PAIs是第一个被阐述与深入研究的毒力决定区域（Hacker等人，1983，19
27、97；Blum等人，1994；Swenson等人，1996）。举个例子，尿路大肠杆菌536（UPEC）包含两个致病岛，PAI I 与PAI II，它们在大小上分别有70和190kb，并且被直接重复序列包围（Blum等人，1994；Ritter等人，1995）。PAI I 编码一种毒素 溶血素(hly)，通过插入细胞膜裂解红细胞与其它真核细胞。PAI II携带与prf决定因子相关的hly毒力基因，prf决定因子编码P相关菌毛，P相关菌毛是尿路大肠杆菌重要的黏附因子（Hacker与Kaper，2000）。PAI II编码P菌毛，使尿路表12.2 致病岛例子细菌PAI 名称大小（kb）G+C含量a相
28、关t RNA功能Uropathogenic E.coli(536)PAI PAI 70 19051/4151/41selCleuX溶血素产物及P相关菌毛溶血素产物及P相关菌毛Uropathogenic E.coli(J96)PAI PAI 17011051/4151/41pheVpheR溶血素产物溶血素产物Enteropathogenic E.coli (E2348/69)LEEb3551/39selC黏附、抹杀、侵入（翻译 型分泌系统）Salmonella typhimuriumSPISPI-2SPI-3SPI-44040172552/40-4752/40-47-valVselCputati
29、ve tRNA侵入非噬菌细胞 （翻译 型分泌系统）宿主内细菌存活（翻译 型分泌系统）侵入并在单细胞内存活侵入并在单细胞内存活Helicobacter pylorCag PAI4038-45/35glrc 编码完全毒力必需的CagAd和VacA调节因子Vibrio choleraeVPI39.547-49/35ssrA含TCP-ACFe因子和toxFf基因，调节霍乱毒素Yersinia pestisHPI(pgm locus)10246-50/46-50asnT铁的获取，氯化高铁血红素吸收、Yersiniabactin合成Clostridium difficile19.6毒素A和BListeri
30、a monocytogenesprf vir Gene cluster10prf vir Gene cluster a细菌的宿主的G+C(%)含量/ PAI的G+C(%)含量bLEE肠细胞抹除的基因位点cglr谷氨酸消旋酶dCagA细胞毒素相关的抗原eTCP毒素相关的菌毛，ACF附加定殖因子toxT=转录激活体基因大肠杆菌通过半乳糖-半乳糖1，4特异性受体分子黏附到尿道上皮。两个UPEC-特异性PAI都与tRNA基因有关，PAI I定位在selC tRNA基因上，PAI II整合到一个小的亮氨酸leuX的tRNA上。与之相似，肠道致病大肠杆菌（EPEC）在染色体selC位置有35kb的致病岛（
31、McDaniel等人，1995），但是与UPEC-特异性的PAI不同，EPEC 特异性致病岛编码高特异性的型分泌系统，输出可黏附肠上皮并可导致肠上皮细胞损伤（Jarvis等人，1995）的重要蛋白，因此导致不同的疾病条件。与鞭毛进化相关，革兰氏阴性杆菌的型分泌系统是高保守性的，并且是唯一的适应性的毒力机制。型分泌系统的结构成分是保守的，但是运送到细胞质中的调节宿主细胞功能的效应蛋白对于每一个细菌菌株是唯一的。组成型分泌机制的蛋白也在耶尔森氏菌，志贺氏菌，沙门氏菌与许多植物病原菌的PAIs中编码（Hacker与Kaper，2000 ，综述）。另一个符合先前描述的PAIs的定义的致病岛，最近在霍乱弧菌中被发现，霍乱弧菌是引起被称为霍乱的一种腹泻的条件致病菌。然而有害的水生霍乱弧菌与毒力霍乱弧菌的染色体致病岛只在流行病学中被鉴定。霍乱弧菌致病岛（VPI），其标志为与平均基因组G+C含量（47-49%）比，含低G+C含量（35%），在染色体上基因比较稳定，占39.5kb区域。序列分析表明，VPI 包含TCP-ACF簇与toxT基因，toxT具有调节霍乱毒素功能（Karaolis等人，1998）。由tcpA-tcpF基因编
