1、生物技术微生物学实验讲义实验一 革兰氏染色实验 一、目的要求 1、学习并初步掌握革兰氏染色法2、了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时
2、，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal v
3、iolet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。 2、其他：革兰氏染色液，载玻片，显微镜、盖玻片、吸水纸，接种针。 四、操作步骤 1. 涂片将培
4、养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2. 染色 （1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染 用番红液染12分钟，水洗。（5）镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与
5、金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，常呈阴性反应。五、实验报告 1结果：在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？ 2思考题 (1)你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？(2)为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?(3)如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、 时间太长，又会怎么样呢？ （
6、4）革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？（5）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？（6）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性和革兰氏阴性菌分别是什么颜色？（7）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？实验二 酵母细胞数量及出芽率的测定-血球计数板法一、目的要求1了解血球计数板的构造和使用方法。2学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。3学会出芽率的测定。二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液
7、（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（ 01mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格
8、又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即1625=400小方格。每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为01mm，所以计数室的容积为01mm3。在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因1ml=1cm3=1000mm3， =50000AB（个）同理，如果是16个中方格的计数
9、板，设五个中方格的总菌数为A，则三、器材酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，玻璃棒。四、操作步骤1稀释将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。3加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。4显微镜计数静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节
10、稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。出芽的酵母，芽体大小达到酵母细胞的一半时，即作两个菌体计数，芽体小于菌体12时为细胞芽体，计数细胞芽体的数目，计算出芽率。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。5清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。五、实验报告1结果将结果记录于下表中。 A表示五个中方格中的总
11、菌数； B表示菌液稀释倍数。2思考题根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？实验三 土壤微生物的分离、培养、鉴定及菌落数的测定1 培养基的配制及灭菌【目的要求】1了解培养基的概念、种类及用途2了解培养基的配制原理及其常规配制程序3学习和掌握细菌、放线菌、霉菌常用培养基的配制方法。【基本原理】培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物
12、生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。马丁氏培养基用于霉菌的分离培养。【材料与用品】1材料与试剂牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、MgSO47H2O、NaOH溶液（1mol/L）。【仪器与用品】天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸等。一、肉膏蛋
13、白胨培养基的配制1培养基成分牛肉膏 0. 3g蛋白胨 1gNaCl 0.5g琼脂 1.5g水 100mLpH 7.27.42配制方法（1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的23左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。（4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.27.4。（5）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌20分钟。待培养基冷
14、却至60左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。二、高氏一号培养基的配制1培养基成分可溶性淀粉 20gKNO3 1gNaCl 0.5gK2HPO4 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g琼脂 20g水 1000mLpH 7.27.42配制方法（1）称量及溶化：先称量可溶性淀粉，置于一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，加热，使淀粉完全融化。再分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一加入水中溶解。（2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。（4）调p
15、H：待溶液冷至室温时，用1mol/lLNaOH溶液调pH至7.27.4。（5）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌20分钟。待培养基冷却至60左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。三、马丁氏培养基的配制1培养基成分葡萄糖 10g蛋白胨 5gK2HPO4 1gMgSO47H2O 0.5g琼脂 16g水 1000mL链霉素溶液（10000U/ml） 3.3mL（临用前加入）的2配制方法（1）称量：称取培养基各成分的所需量。（2）溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一加入并溶化培养基各成分。（3）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（4）加琼脂：将所需
16、量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。（5）加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌20分钟。（7）临用前，加热融化培养基，待冷却至60左右，按每1000ml培养基以无菌操作加入3.3ml的链霉素溶液，迅速混匀。【思考题】1 制作平板培养基的注意事项是什么？2 培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌？如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？3 如何检查灭菌后的培养基是否无菌？4 在马丁氏培养基的配制中，链霉素为什么要临用前才加入？5 如果你需要配制一种含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培养基，其抗生素的终浓度(或工作浓度)为50g/ml，你将如何操作?2 微生物的分离和培养【目的要求】
17、1掌握细菌、放线菌和霉菌稀释分离技术。2学习从样品种分离、纯化出所需菌株。3了解培养细菌、放线菌以及霉菌的培养条件和培养时间。【基本原理】土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多。本实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品的季节、气温条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品种各类微生物相互干扰。细菌或放线菌在中性或微碱性环境较多
18、，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌。【材料与用品】1菌源选定采土地点后，铲去表涂层23cm，取310cm深层土壤10g。2培养基肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏合成一号培养基3无菌水4其他试剂与用品无菌培养皿、无菌移液管、玻璃涂棒、1重铬酸钾等。【实验步骤】一、细菌分离1制备土壤稀释液称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使土壤中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成102稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备107稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支
19、，按103107顺序编号，放置在试管架上。取移液管一支，准确吸取0.5ml102土壤稀释液，此为103稀释度的土壤稀释液，依次操作，制成104、105、106、107的土壤稀释液。2涂布分离用无菌移液管分别吸取上述107、106、105、三个稀释度菌悬液0.1ml，依次加入对应编号已经准备好的平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手那培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒将菌也自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。每个稀释度涂两个平板。3恒温培养将平板置于30恒温培养箱中培养24h后观察结果。二、放线菌分离1制备土壤稀释液称取土样1g，加入盛有
20、99ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成102稀释度的土壤稀释液。2涂布分离用无菌移液管分别吸取上述105、104、103、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。3培养将涂好的平板放于28恒温培养箱中培养57d后观察结果。三、霉菌的分离1制备土壤稀释液称取土样5g，加入盛有95ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成102稀释度的土壤稀释液。2涂布分离将已灭菌的培养基溶化，加入链霉素溶液，待培养基凝固后，用无菌移液管分别吸取104、103、102、三个稀释度菌悬液0.1mL，涂平板。每个稀释度涂两个平板。3培养将涂好的平板放于28恒温培养箱中培养35d后观察
21、结果。四、酵母菌的分离1制备土壤稀释液称取土样1g，加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡后静置5min，即成102稀释度的土壤稀释液。2涂布分离用无菌移液管分别吸取上述104、103、102、三个稀释度菌悬液0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。3培养将涂好的平板放于30恒温培养箱中培养23d后观察结果。【思考题】1 稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50左右，才倒入装有菌液的培养皿内？2 在恒温培养箱中培养微生物时为什么培养皿需倒置？3 纯培养菌种的菌落、菌体形态观察【目的要求】1学习并掌握观察细菌、放线菌以及霉菌个体形态的基本方法。2初步了几种中细菌的个体形态以及与其相应的菌落形
22、态特征。3通过观察和比较分离出来的细菌以及放线菌及霉菌的菌落特征，掌握初步鉴别上述微生物的方法。【材料与用品】上个实验培养出来的各种细菌，霉菌以及放线菌。【操作步骤】一、细菌、霉菌、放线菌。（略）二、菌落形态特征的观察由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特征及产生色素的能力等各不相同，因而个体及它们的群体在固体培养基上的生长状况也不一样。根据微生物的固体培养基上相成的菌落特证，可初步辨别它们的分类地位。观察时，应注意菌落的形状，大小、表面结构、边缘结构、颜色、透明度、气味、黏滞性、质地软硬情况、表面光滑与粗糙情况等。通常，细菌菌落多为光滑型、湿润、质地软，表面结构及边缘结构特征很多
23、，具有各种颜色。但也有干燥、粗糙的菌落，甚至呈霉状但不起绒毛。放线菌的菌落硬度较大，干燥致密，且与培养基结合紧密，不易被挑取。菌落表面呈粉状或皱褶呈龟裂状，具有各种颜色，正面和背面颜色不同。霉菌菌落长成绒状或棉絮状，能扩散生长，疏松，很容易挑取。也具有各种颜色，如白色，绿色，灰色等，正面和背面不尽相同。三、细菌、放线菌及霉菌菌落特征的比较对分离培养出来的细菌，放线菌及霉菌的菌落特征仔细观察，并将上述微生物进行比较，做仔细记录。四、细菌、放线菌及霉菌菌体形态的观察 对细菌和放线菌进行简单染色，对霉菌不做染色直接制片，观察微生物的菌体形态。【实验结果】填写下表菌落特征名称 形状颜色质地表面光泽与培
24、养基结合程度菌体形态细菌放线菌霉菌思考题1 菌落干燥与湿润的原因是什么？2 具有鞭毛、荚膜的细菌在它们形成菌落时，一般会有哪些相应的特征？实验四 比色法测微生物的生长曲线一、目的要求1了解细菌生长曲线特点及测定原理 2学习用比浊法测定细菌的生长曲线二、原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和
25、培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。三、实验材料大肠杆菌、肉膏蛋白胨培养基、721分光光度计、比色杯、恒温摇床、无菌吸管、灭菌试管，三角瓶。四、实验步骤1用5mL灭菌吸管取2.5mL大肠杆菌过夜培养液，加入盛有65mL无菌LB液的三角烧瓶中，混
26、合均匀。2取10支灭菌试管，分别标记培养时间，即1、2、39、10。各管分别加入上述大肠杆菌混合液5mL，37振荡培养。3培养1、2、39、10小时后，分别取出标记相应时间的试管，以未接种的LB培养基作为对照，依次测定OD600nm的光密度值。，使细胞分布均匀4如果菌液浓度过大，用LB培养基对其进行稀释，以稀释后菌液OD值在0.10.65为宜。培养液实际OD值的功能与稀释后测得的OD值乘以稀释倍数。测定时，需将待测培养液振荡均匀。5以测定的OD值为纵坐标，以培养时间为横坐标，绘制大肠杆菌生长曲线。五思考题1浊度比色法测微生物生长曲线的原理是是什么？2测OD值为什么要设立空白对照？3细菌生长繁殖
27、所经历哪几个时期，各时期有什么特点？实验五 水中细菌菌落总数的测定【目的要求】1.学习利用滤膜法检测水中细菌菌落数的方法和基本原理。2.了解细菌数量与水质状况的关系以及对饮用水卫生的重要意义。【基本原理】滤膜法是采用滤膜过滤水样，将水中含有的细菌截流在滤膜上，然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，直接计数滤膜上生长的细菌菌落，算出每升水样中含有的细菌菌落数。所用的滤膜是一种多孔硝化纤维膜或醋酸纤维膜，孔径为0.450.65m。【材料与用品】 细菌滤器、滤膜、注射器、无菌水、牛肉膏蛋白胨固体培养基、培养箱【操作步骤】一、配制牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（步骤略）二、滤膜法检测水中细菌总数 1滤膜灭
28、菌：将滤膜放在烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴煮沸灭菌3次，每次15min前两次煮沸后需要更换蒸馏水洗涤23次，以除去残留溶剂。滤器灭菌使用高压锅121下，灭菌20min。2滤膜安装：用无菌镊子夹住滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴在滤器上，稳妥地固定好滤器。3过滤水样：将l0mL水样注入滤瓶中，启动抽真空系统，在-50kPa下抽滤，使水通过滤膜流到下部，水中的菌细胞被截留在滤膜上。水样滤毕，再抽气5s，关上滤器阀门，取下滤器。水样用量可适当增减使获得菌落适量。 4用无菌镊子小心将截留有细菌的滤膜取出，平移贴于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上（注意无菌操作，有菌的一侧朝上，滤膜应与培养基完全贴紧，无气泡），然后将平皿倒置，37培养22-24h。5. 逐日观察膜上是否有菌落生长，并计数，计数出每毫升水样中的菌落总数。【思考题】1.怎样保证结果的准确性，在取样、操作过程中应注意什么？设计性实验-实验五 产淀粉酶菌株的筛选及生理生化鉴定（20人）设计性实验-实验六 营养缺陷型菌株的筛选（20人）要求写出设计方案，五人一组，自行完成。
