1、微生物遗传学的几个基本概念核酸是遗传物质基础的三个经典实验原理质粒、质粒分离及质粒分类举例基因及其突变的基本定义,二、基因突变的特点（规律）,（参见 P199）,自发性,菌种衰退的根本原因,不对应性,突变的性状与突变的原因无关系,稀有性,自发突变几率低（10-610-10）,突变率：每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。（某一单位群体在每一世代中产生突变株的数目）,独立性,某基因的突变率不受它种基因突变率的影响,可诱变性,自发突变的频率可因诱变剂的影响而提高（10-310-6）,稳定性,基因突变后的新性状是稳定的,可逆性,野生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发生反向的回复突变。,证明
2、突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！,如何证明基因突变的非对应性？,三个经典实验:,1.变量实验、2.涂布实验、3.影印实验,三、基因突变自发性和不对应性的实验证明,1）变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria&Max Delbruck(1943),对噬菌体T1敏感的E.coli 对数期培养物，稀释至103/mL,分装两试管，各10 mL,与甲管分装的各小管同时保温2436h,甲管,乙管,2）Newcombe的涂布实验（1949）,在涂布过的一组中，共长出抗性菌落353个，比未经涂布过的（28个菌落）高得多,约繁殖了12.3代,选用对T1 噬菌体
3、敏感的E.coli，以相等数目涂布于12个平板上,3）影印实验（replica plating）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,通过使菌不接触抗性环境而检查其抗性菌落的方法,营养缺陷型 抗性突变型 条件致死突变型 形态突变型 抗原突变型 产量突变型,下面介绍几种常用的突变型及其分离,1.按照突变的表型分类：,选择性突变株（能在选择性培养基上或其它的选择性条件下迅速选出或鉴别出）,非选择性突变株,四、基因突变的类型,（1）营养缺陷型（auxotroph）,一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境
4、或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。,营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段,表型判断的标准：,在基本培养基上能否生长,特点：,在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长,负选择标记,突变株不能通过选择平板直接获得,营养缺陷型的表示方法：,基因型：,所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）,表型：,同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC,在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。,（2）抗药性突变型（resistant mutant）,基因突变使菌株对某
5、种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,特点：,正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）,表示方法：,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示strr 和 strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性,（3）条件致死突变型（conditional lethal mutant）203,在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。,常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（temperaturesensitive）表示，这类突变在高温下（如42）是致死的，但可以在低温（如25-30）下得到这种突变。,特点：
6、,负选择标记,这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,（4）形态突变型（morphological mutant）,造成形态改变的突变型,特点：,非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。,举例：,产蛋白酶缺陷突变株的筛选,菌落颜色变化,半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开。,形成芽孢缺陷菌株,（5）抗原突变型,指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，包括细胞壁缺陷变异、荚膜或鞭毛成分变异等。,（6）产量突变型,通过基因突变而引起的目标代谢产物的产量发生变化的变异菌株，其在产量上高于或低于原始出发菌株。如果产量提高的突变株，被
7、称为“正突变”（plus-mutant），也称为“高产突变株”(high producing mutant)；如果产量低于出发菌株的突变株，则称为“负突变”（minus-mutant）。,2.按照突变所引起的遗传信息的改变情况可分为三种：,同义突变,表型不发生改变（密码子是简并的,如CGU变成CGC，但都编码精氨酸）；,错义突变,改变的密码子编码的氨基酸改变了；,无意义突变,终止密码子（UAA,UAG,UGA）,其它突变类型,毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用中具有重要意义突变类型,一般都不具有很明显或可直接检测到的表型。其突变株的获得往往需要较大的工作量。,第四节 基因突变的
8、机制,一、基因突变的分子基础,(一)自发突变,(二)诱发突变,引起自发突变的原因主要有以下几方面：背景辐射和环境因素引起；有害代谢产物引起；互变异构效应引起的碱基配对错误；DNA复制过程中碱基配对错误；转座因子的作用。,通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高自发突变频率的手段。,生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变（10-6-10-9）。它是生物进化的根源。,(二)、诱发突变,诱变剂（mutagen）：,凡能提高基因突变频率的因素统称为诱变剂,诱变剂的种类,物理诱变剂,化学诱变剂,生物诱变剂,碱基类似物诱变剂；与碱基起化学反应的诱变剂；嵌入诱变剂；,：辐射和热,：转座因子,(1)
9、碱基类似物-间接引起置换的诱变剂,它们在DNA复制中能掺入DNA 分子中，由于其产生异构体的频率高，因此发生的错误配对可引起碱基的置换。,一类与正常碱基结构相似的物质，称为碱基类似物。如：5-BU,8-NG,2-AP等。,A-T,A-T,A-BU,A-T,G-BU,G-C,A-BU,加入5-BU,1.化学诱变剂,(2)与碱基起化学反应的诱变剂-直接引起碱基置换,该类诱变剂与碱基起化学反应，改变碱基的结构，导致错配。,亚硝酸：G-C A-T 转换互变,各种烷化剂：G-C A-T 互变,羟胺：只引起G-C A-T 转换（专一性与C起反应）,亚硝酸：对碱基的主要作用是氧化脱胺作用（使氨基变为酮基，改
10、变配对性质，引起碱基转换）。,HNO2 A H（次黄嘌呤）AT GC C U GC AT G X（黄嘌呤）不引起突变,A-T,H-T,H-C,A-T,H-C,G-C,烷化剂,甲基磺酸乙酯（EMS）甲基磺酸甲酯（MMS）硫酸二乙酯（DES）N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)氮芥、硫芥环氧乙烷,NTG：诱变作用强，称为超强诱变剂（突变率1%）；能诱发邻近位置的基因同时发生突变，即所谓并发突变。,很多烷化剂除了能诱发点突变外，还能诱发染色体畸变。由于染色体畸变常为辐射所诱发，所以这些物质又称为拟辐射物质。,烷化剂作用的主要机理是引起碱基上某些能形成氢键的集团发生烷基化。烷化位点主要在鸟嘌呤的
11、N7位和腺嘌呤的N3位上，烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误。烷化剂的另一作用是使嘌呤整个地从DNA链上脱下来，产生一个缺口，在与缺口相对应的位点上就能配上任何一个碱基，从而引起转换或颠换。,(3)移码突变的诱变剂嵌入诱变剂,吖啶类染料（如原黄素，吖叮黄（橙），ICR类等）具有类似碱基对的扁平结构，能插入DNA分子的碱基对之间，使DNA结构变形，导致 DNA在复制过程中的滑动，引起DNA链中插入或缺失一个或几个核苷酸，产生移码突变。,ICR：一系列烷化剂和吖啶分子相结合的化合物,2.物理诱变剂及其诱变机制,紫外线，x-射线，射线，快中子，超声波等,(1)紫外线（UV）,紫外
12、线是实验室中常用的非电离辐射诱变因子，其作用机制主要是能引起：DNA链的断裂、DNA分子双链的交联、嘧啶的水合作用 相邻碱基形成嘧啶二聚体（TT，TC,CC）等。其中最主要的效应是胸腺嘧啶二聚体的形成。胸腺嘧啶二聚体通常出现在同一DNA单链上两个相邻的胸腺嘧啶之间，也可出现在两条DNA单链之间。两种情况导致结果不同。,X射线、射线、快中子等属于电离辐射。以X射线为例解释该类诱变剂诱变机理：X射线的诱变作用有直接和间接两种方式：(1)直接作用是引起DNA双链间氢键的断裂、DNA单链的断裂、不同DNA分子之间的交联等。(2)间接作用是电离辐射能从水或有机分子中产生自由基，这些自由基作用于DNA分子
13、，引起缺失和损伤。自由基对嘧啶的作用更强烈。此外，X射线还可能使细胞中形成一些碱基类似物，突变由这些碱基类似物所诱发。与紫外线不同的是，电离辐射可通过玻璃和其他物质，穿透力强，能达到生殖细胞，因此常用于动植物的诱变育种。,(2)X射线、射线、快中子,短时间的热处理也可诱发突变，热的作用是使胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶，从而通过碱基配对错误而引起GCAT的转换；另外，热也可引起鸟嘌呤脱氧核糖键的移动，从而在DNA复制时出现包括两个鸟嘌呤的碱基对，在下一次的DNA复制中该碱基对错配就会引起GCCG的颠换。,(3)热,(1).转座因子（transposable element)定义：位于染色体或质粒上的
14、一段能改变自身位置的DNA序列。广泛分布于原核和真核细胞中。又称“跳跃基因”,(2).转座因子的特点,1)在转座时，通过转座因子的复制，可将新形成的拷贝以非同源重组的方式转移到染色体的新部位上；,2)都携带有编码转座酶的基因，该酶具有转移位置的功能，是转座所必需的;,3)两端都有正向或反向末端重复序列。,3.生物诱变剂(转座因子)及其诱变机制,(3)根据分子结构和遗传性质，转座因子可分为3类：,插入序列（Insertion sequence,IS）,仅含有编码转座所必需的转座酶的基因，两端存在941bp的反向重复序列。但其插入可干扰基因的正常读码序列，导致基因失活或引起突变。,转座子（Tran
15、sposon,Tn）,除转座基因外，还有抗药性基因。分为复合转座子和复杂转座子,Mu噬菌体,是以大肠杆菌为宿主的温和性噬菌体。它在几方面不同于另一种温和噬菌体：第一、Mu DNA几乎可以插入到宿主染色体的任何一个位点上；第二、DNA 两端没有粘性末端；第三、会引起宿主的被插入基因的基因突变。,(4)转座的过程：,插入突变(基因失活和极性作用)染色体畸变(染色体的缺失重复和倒位),(5)转座的遗传学效应：,二、诱变及化学致癌物质的检测Ames试验,“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他
16、不良的后果。,Ames试验的依据,诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。,回复突变(reverse mutation或back mutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。,美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验,标准菌株要求：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率（为了增加试验的敏感性，该菌株还应包括另外两个突变，一个是造成细胞表面透性增加的深度粗糙突变型，另一个是丧失切除修复能力的缺失型）。,A
17、mes试验,斑点试验和平板掺入试验,方法步骤,1菌株鉴定 用于测试的菌株，需经基因型和生物学性状鉴定，符合要求才能投入使用。菌种：TA97、TA98、TA100和TA102 鉴定项目：（1）脂多糖屏障丢失（2）R因子（3）紫外线损伤修复缺陷（4）自发回变（5）回变特性诊断性试验,应用：1斑点试验只局限于能在琼脂上扩散的化学物质，大多数多环芳烃和难溶于水的化学物质均不适宜用此法。此法敏感性较差，主要是一种定性试验，适用于快速筛选大量受试化合物。2平板掺入试验可定量测试样品致突变性的强弱。此法较斑点试验敏感，获阳性结果所需的剂量较低。点试获阳性结果的浓度用于掺入试验（每皿0.1ml），往往出现抑（
18、杀）菌作用。3致变作用迟缓或有抑菌作用的试样，培养时间延长至72h。4挥发性的液体和气体试样，可用干燥器内试验法进行测试。5目前，Ames试验作为检测环境诱变剂的一组试验中的首选试验，广泛应用于致突变化学物的初筛。但是，与今天快信息、高效率的社会要求相比，该试验程序还嫌繁琐，方法不够简便，有待于创建新的更为快速灵敏、简单易行的环境诱变剂短期生物测试法。,用途：广泛用于检测环境和食品中是否存在化学致癌物。特点：快速、准确、费用廉价,三、DNA损伤的修复,除了DNA聚合酶进行校正外，还通过几种不同的机制进行DNA的修复：(1)光复活作用(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复,紫外线诱变时必须
19、在暗室、红光下进行,（1）光复活作用（photoreactivation）,可见光可大大降低经紫外线照射后微生物死亡率的现象。,机理：经UV照射后带有嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中会和一种光激活酶光解酶结合，形成酶DNA复合物，该复合物暴露在可见光下时，光解酶会因获得光能而被激活，并使二聚体重新分解成单体，光解酶也从复合物中释放出来，再结合到其它二聚体上。,这种修复机制不是移去和取代核苷酸，而是胸腺嘧啶二聚体直接被修复，所以是一种无错误的修复。,（2）切除修复（excision repair，又称暗修复）,一种普遍的修复系统。能移去胸腺嘧啶二聚体和修复大多数引起的DNA扭曲损伤。该修复系统不
20、需要可见光，通过酶切作用移去损伤的碱基（包括损伤位点附近的一些碱基），随后合成一段正常DNA链。,内切核酸酶 4种酶参与 外切核酸酶 DNA聚合酶 DNA连接酶,（3）重组修复,这是一种越过损伤而进行的修复。这种修复不将损伤的碱基除去，而是通过复制后，经染色体交换，使子链上的空隙部位不再面对着嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种情况下，DNA聚合酶和连接酶便能起作用，把空隙部分进行修复。留在亲链上的二聚体仍要依靠再一次的切除修复加以除去，或经细胞分裂而稀释掉。,(4)SOS修复这是在DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。涉及几个基因：recA、lexA、uvrA、uvrB、uvrC的共同作用。此外，经紫外线照射的大肠杆菌还可能诱导产生一种称为错误倾向（error-prone）的DNA聚合酶，催化空缺部位的DNA修复合成，但由于它们识别碱基的精确度低，所以容易造成复制的差错，这是一种以提高突变率来换取生命存活的修复，又称错误倾向的SOS修复。,
