1、基因工程3第七章 重组DNA的连接、转化和筛选第一节 目的DNA片段与载体的连接 外源DNA片段与载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5-磷酸和3-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：1、 连接具有同源互补粘性末端的DNA片段；2、 连接双链DNA分子间的平端；3、 在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。一般说来，在选择外源DNA同载体分子连接反应的
2、程序时，需要考虑到以下三个因素：1） 实验步骤要尽可能简单易行；2） 连接形成的“接点”序列应能被一定的核酸内切酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；3） 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：（一）、具互补粘性末端片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成14核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但
3、是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。若外源DNA插入片段和适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。但是，在同源粘性末端连接方案中，存在以下两个弊端：高背景和两向插入。高背景：连接物中除重组子以外，还有相当数量的载体自身环化分子，这将产生转化菌中较高的假阳性克隆背景。针对这一问题，往往需要在连接前，将切割后的线性载体DNA分子用碱性磷酸酯酶进行5端去磷酸化处理。两向插入：由于载体与插入片段之间的末端全为粘性互补顺序，所以插入片段插入载体中存在两个方向。对于原核或真核表达型重组子的构建，反向插入的
4、重组子，由于插入片段的转录及翻译阅读方向与载体启动子转录方向相反，产物的表达困难，或表达出完全不同的产物，故必须筛选出正向连接的重组子。其解决办法是将重组子进行内切酶图谱分析，以鉴定重组子中插入片段的方向。目前，采用所谓的定向克隆技术，可以使外源DNA片段按一定方向插入到载体分子。定向克隆：根据核酸内切限制酶的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA片段。十分明显，如果载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对核酸内切酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA片段将按一种取向退火形成重组DNA分子。互补粘性末端连接方案中还有一个问题：片段的
5、多拷贝插入。当需要表达蛋白质产物时，多拷贝的插入，在没有拼连剪切信号的情况下，将会导致表达困难或紊乱。所以需要用内切酶图谱对单拷贝插入片段进行鉴定和筛选。适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般比例为21（插入片段摩尔数载体摩尔数）。（二）、平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为
6、模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5磷酸基团或3羟基与另一个平末端的3羟基和5磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平末端的连接速度为粘性末端的1/101/100。为了提高平末端的连接速度，可采取以下措施：（1）增加连接酶用量，通常使用粘性末端连接用量的10倍，但是实际操作中，这种方法并不常用，因为酶量加大，反应体系中甘油的浓度也提高，有时对连接反应不利；（2）增加DNA平末端的浓度，提高平末端之间的碰撞机率；（3）加
7、入NaCl或LiCl以及PEG；（4）适当提高连接反应温度，平末端连接与退火无关，适当提高反应温度既可以提高底物末端或分子之间的碰撞机率，又可增加连接酶的反应活性，一般选择2025较为合适。既然在一定反应条件下，用T4DNA连接酶可以将平末端的DNA片段有效地连接起来，那么对于上面提到的非互补粘性末端的两种DNA片段之间，经过专门作用于单链DNA的S1核酸酶处理变成平末端或用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段填补后变成平末端，一样也可以使用T4DNA连接酶进行有效地连接。不过，平末端DNA片段间的连接作用不仅在效率上明显地低于粘性末端间的连接作用，而且重组之后一般不能从原位删除下来。平末
8、端连接的另一个特点是可以恢复一个原始的酶切位点，甚至产生一个新的酶切位点。例如，EcoR I识别G/AATTC序列，切割后产生3-CTTAA-5的5端突出的粘性末端，用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段填补后，末端填平为5-GAATT-3,若与一个5端为C的平末端DNA连接，如Hae III(GG/CC)的酶解DNA片段，连接后则恢复EcoR I的识别切割位点。BamH I酶也一样（BamH I识别G/GATCC序列）,即EcoR I和BamH I酶切产生的末端，填平后，只要另一个片段末端能供给一个5C，如Hae III酶切或Taq I酶切并填平的末端（识别T/CGA），两种酶的识别位点
9、都可以恢复。 有些特殊情况下，两个不同的内切酶位点产生的末端填平后，其连接成的序列，可产生出另一种内切酶的识别切割位点，在克隆位点选择时，也是一种可以考虑的方案。例如BamH I与Bgl II的末端填平连接后，可产生一个Cla I的切割位点。平末端连接没有粘性末端的碱基互补限制，只要是平末端均能连接，所以平末端外源DNA片段在载体中的插入方向有两种可能性，在重组子筛选后，应该利用内切酶图谱对阳性重组子中外源DNA片段的插入方向进行鉴定。另外，由于平末端连接要求较高的底物浓度，故载体中多拷贝的外源DNA插入现象在所难免，因此应该利用加大连接酶浓度、降低ATP浓度、载体去磷酸化、用PEG促进连接等
10、其它措施提高连接效率，不要过分加大外源DNA的浓度，从而减少多拷贝插入的机率。当然，重组子还需内切酶酶解鉴定，筛选插入单拷贝外源DNA片段的重组子。（三）、DNA片段末端修饰后的连接待连接的两个DNA片段的末端未必都是平末端，或者未必都是互补的粘性末端，两个不能互补的粘性末端原则上不能直接连接，虽然可以采用上述方法将它们转化成平末端后再进行连接，但是，所产生的重组子往往会增加或减少几个碱基对，并且破坏了原来的酶切位点，使重组的外源DNA片段无法回收；如果连接位点位于基因编码区内，则会破坏阅读框架，使之不能正确表达。在这种情况下，连接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰改造。常采用以下几种方法：
11、1）DNA连接子技术（人工接头连接）DNA连接子是等摩尔数的两条完全互补的寡聚脱氧核糖核苷酸链，形成的平末端双链DNA序列中含有一个或多个限制性内切酶位点。DNA连接子的作用主要是在DNA平末端添加新的内切酶位点以产生粘性末端，便于DNA片段之间的连接，是亚克隆技术及基因文库构建中一项常用的技术。连接子大小一般为812bp核苷酸长的一段迥文序列，接受连接子的DNA片段必须是平末端，对于粘性末端则需预先修饰成平末端。而且只有5末端磷酸化的连接子才能在T4DNA连接酶的催化下进行连接反应，5末端去磷酸化的连接子需要用T4多核苷酸激酶在其5末端磷酸化后，才能成为连接酶的适合底物。使用连接子进行亚克隆
12、操作包括三个步骤：将连接子连接于外源DNA片段两侧平末端上；用相应的内切酶切割连接子；含新的粘性末端的外源DNA片段与相应的线性载体DNA分子连接。由于连接子分子量小，很容易达到DNA平末端连接所需的高末端浓度，一般连接子的末端浓度必须高于靶DNA末端浓度的23倍。另外，420mol/L连接子末端浓度才能驱动T4DNA连接酶的连接反应，这样靶DNA的浓度就可以较低。如果靶DNA片段中有与连接子相同的内切酶位点，在添加连接子之前，必须预先用相应的甲基化酶进行修饰，防止内切酶切割连接子时降解靶DNA片段。2）DNA适配子技术DNA适配子是一条人工合成的具有一个以上限制酶识别位点的寡聚脱氧核糖核苷酸
13、链，它含有某种限制酶的粘性末端的突出顺序，不需用内切酶切割而产生。在DNA重组中，通过与其它适配子或连接子互补配对，形成双链DNA，再与靶DNA连接，可适用于各种类型的DNA末端之间的连接。它克服了连接子只适用于DNA的平末端连接和还需要用内切酶消化才能产生新的粘性末端的两个弊端。适配子在不同类型DNA末端连接中的应用：1 平末端DNA分子产生新的粘性末端：将BamH I的适配子与HapII的连接子退火，将产生一端平一端粘的双链DNA分子，其平端与平末端DNA分子相连后，靶DNA分子双侧形成BamH I的粘性末端，而BamH I适配子5端脱磷酸防止了适配子之间聚合，这样可以直接克隆到含BamH
14、 I 位点的载体中去。直接使两个非互补的粘性末端连接：A：将一种内切酶切割的外源DNA片段插入到另一种内切酶切割的载体中。例如：将EcoR I适配子和BamH I适配子联合，能够使EcoR I切割的外源DNA片段直接与BamH I切割的载体DNA连接，其中一个适配子5端去磷酸化，使得配合的两个适配子双链DNA片段不能自身连接。通过适配子使插入片段与载体DNA连接后，连接处除了BamH I和EcoR I外，还产生了一个新切点Xho I。B：适配子填平连接5突出与3突出粘性末端。以上这个方案适应于外源DNA与线性载体DNA分子的粘性末端均为5或3突出，如果两者之间，一个为3突出末端，一个为5突出末
15、端，连接两个分子，其接端存在一个较大的缺口，可以考虑由适当的适配子填补。例如：用适配子5-pAATTCCTGCAOH-3连接EcoR I（5突出粘性末端）和Pst I（3突出粘性末端）产生的末端。适配子添加到DNA片段末端上的操作与连接子几乎相同，一般也需要较高的摩尔浓度（1020 mol/L）。唯一不同的是有些适配子需要退火处理，再与DNA连接。3）同源多聚尾序连接同源多聚尾序包括dA:dT和dG:dC两种类型。在DNA分子末端添加同源多聚尾序，一般由末端脱氧核苷酸转移酶催化，该酶是一个分子量为80 kD的多肽分子，它能在单链、双链DNA的3-OH上添加脱氧核糖核苷酸，其最适底物是具有3端突
16、出的双链DNA。对于平末端和5端突出的双链DNA催化活力不高，需要用核酸外切酶处理，删切5端部分碱基，形成3端突出端，添加dA或dT尾序时，可用Ca2+为辅助因子，而Mg2+则适用于dG或dC尾序的添加。同源多聚尾序克隆方案存在两个缺陷，一是DNA分子内部必须完整，即在两个DNA链中间不存在裂口，否则游离的3-OH会因添加多聚尾序而分支，破坏了载体的活性；另外DNA末端加尾破坏了该部位的内切酶位点，同时添加了许多核苷酸顺序，影响了外源DNA片段表达的真实性，并且在多数情况下，外源DNA片段不能从载体上完整地切割下来。对于有些内切酶切割DNA产生的末端，添加适当的尾序可以保留原内切酶的识别位点。
17、如Pst I的粘性末端为3突出（5-CTGCAG-3），添加(dG)n外源DNA形成的重组子，仍然保留Pst I位点。具有相似功能的酶还有Kpn I (5-GGATCC-3)+dC、Sst I (5-GAGCTC-3)+dC、Hae III (5-GGCC-3)+dC等。还有两种方法从同源多聚尾序的重组子中切割插入片段，dA:dT尾序相对不稳定，在4550%的甲酰胺存在下，用核酸酶S1或绿豆核酸酶在37550C切割变性解链dA:dT区，从而回收外源DNA，本方法对dG:dC尾序则无效。另一种方法是先用一个内切酶将重组子变成线性，然后将线性DNA变性。短暂复性，使得每一条DNA链插入片段两侧的d
18、A:dT快速退火，而载体DNA仍未复性呈单链状，然后用大肠杆菌核酸外切酶V II从5-3、3-5两个方向切除单链载体DNA，插入片段再退火形成双链DNA。第二节 受体细胞外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。选择适宜的受体细胞已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。所谓受体细胞（receptor cell）又称为宿主细胞或寄主细胞（host cell）等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA
19、并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。一般情况下，受体细胞的选择应符合以下基本原则：（1）便于重组DNA分子的导入。（2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。（3）便于重组体的筛选。（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。（5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。（7）受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性。（8）具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。（9）在理论研究和生
20、产实践上有较高的应用价值。以上是受体细胞选择的总原则，在实际应用过程中，可根据具体需要或用途而重点考虑其中部分要求即可。（一）、原核生物细胞: 是较为理想的受体细胞类型，其原因是：（1）大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA进入。（2）没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。（3）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。（4）原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。鉴于上述原因，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和cDN
21、A文库，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主菌。但是，以原核生物细胞来表达真核生物基因也存在一定的缺陷，有为数不少的真核生物基因不能在大肠杆菌中表达出具有生物活性的功能蛋白。其原因是：第一，原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使许多真核生物基因能得以表达，得到的也多是无特异性空间结构的多肽链；第二，原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用；第三，原核细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。这在一定程度上制约了原核受体细胞作为生物反应器进行异源真核生物蛋白的
22、大规模生产。至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。由于大肠杆菌繁殖迅速，培养简便，代谢易于控制，利用DNA重组技术建立的大肠杆菌工程菌已规模生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。目前已经实现商品化的多种基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌工程菌生产的，如人胰岛素、生长素和干扰素等。但是，大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。枯草杆菌，又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性杆菌，作为基因工程受体菌的最大优势是：（1）枯
23、草杆菌具有胞外酶分泌-调节基因，能将基因表达产物高效分泌到培养基中，大大简化蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然构象和生物活性。（2）枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。（3）枯草杆菌具有芽孢形成能力，易于保存和培养。此外枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点，这些特点在一定程度上弥补了大肠杆菌作为受体菌的不足。现已成功地用枯草杆菌表达了人的干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。蓝细菌，也称为蓝藻，在细胞结构和生物化学方面与细菌很相似，亲缘关系也较
24、密切。作为基因工程受体细胞的最大特点是：（1）蓝藻是一类光能自养型生物，由于具有叶绿素a等光合色素（缺少叶绿素b）而能进行光合作用，同时释放出氧气，因此蓝藻培养简便易行，营养条件要求低，并可用于大规模生产。（2）由于密码子的偏向性和启动子的通用性，某些蓝藻可能成为植物基因表达的宿主。近些年来，随着蓝藻质粒的发现、有关载体的构建和大量突变体细胞的获得，蓝藻基因工程有了长足的发展，目前已获得高效表达PHB等产物的蓝藻工程菌。此外，将重组DNA分子导入棒状杆菌和链霉菌等受体细胞，构建的工程菌可用于抗生素和氨基酸的生产，这是利用大肠杆菌和枯草杆菌等受体细胞难以完成的工作，也具有十分重要的经济价值。（二
25、）、真菌细胞真菌是低等真核生物，其基因的结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。常用的真菌受体细胞有酵母菌细胞等。酵母菌是一群以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物。它是外源真核基因最理想的表达系统，其优势是：（1）是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对较为简单。（2）具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。（3）不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属（如酿酒酵母等）在食品工业中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统。（4）培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。
26、（5）能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工等。在基因工程研究和应用中，酵母菌具有极为重要的经济意义和学术价值。（三）、植物细胞虽然植物细胞具有由纤维素参与组成的坚硬细胞壁，但经纤维素酶等处理获得的原生质体， 同样可摄取外源DNA分子，且原生质体在适当培养条件下可再生细胞壁，进行细胞分裂。另外，即使不预先制备成原生质体，利用基因枪等仪器和农杆菌介导等方法，同样可使外源DNA进入植物细胞。作为基因转移的受体细胞，植物细胞最突出的优点就是其全能性，即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。鉴于上述原
27、因，以植物细胞为受体的转基因工作得以迅速的发展。现在用作转基因受体的植物有水稻、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。（四）、动物细胞动物细胞也可用作受体细胞，不过早期多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为基因转移的受体细胞，由此培育出一定数量的转基因动物。但是近年来通过体细胞培养，获得了多种克隆动物，因此，动物体细胞同样可以用作转基因受体细胞。目前用作基因转移的受体动物主要有猪、羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疫病的基因治疗等。常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、HeLa细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵
28、巢细胞（CHO）等。（五）、受体细胞的选择作为基因工程的受体细胞，应利于外源DNA的转化或转导，同时又要有较好的安全性。野生型的菌并不是理想的受体细胞，因其自身具有限制和修饰系统，对未经甲基化处理的外源DNA分子有一定降解作用，导致外源DNA的转化或转导效率低下。此外，它们对其他生物种群可能存在潜在的致病性。因此必须通过适当的诱变手段对野生型菌进行遗传性能状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株，通常应从以下几个方面加以考虑：（1）限制与修饰系统。（2）重组系统。（3）易于转化或转导。（4）有明显的选择性差异。（5）感染寄生缺陷型。第三节 重组DNA分子转入宿主细胞体外连接的DNA重组分子导入
29、合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。转化和转导主要应用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。由于原核生物作为基因工程受体具有其他生物所没有的优点，所以早期开展的基因工程操作，都以原核生物为受体细胞，尤其是大肠杆菌应用最为广泛。因此，本节重点介绍以大肠杆菌为受体的基因转移。（一）、转化方法重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation）。转化现象最早是由Gr
30、iffith于1928年在肺炎双球菌中发现的，它在原核生物中广泛存在，是自然界中原核生物基因重组的一种主要方式。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤：（1）细菌感受态的形成。（2）转化因子的吸收。（3）整合复合物前体的形成。（4）单链DNA转化因子的整合。（5）转化子的形成。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性细菌有所不同，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那
31、些与其亲缘关系较远的DNA分子更是如此。因此在大肠杆菌的重组质粒DNA分子的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表方法之一是Ca2诱导的大肠杆菌转化法。1Ca2诱导的转化转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。这项技术始于Mandgl和Higa 1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的
32、CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被噬菌体DNA感染，随后Cohn 1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌。其原理是将处于对数生长期的细菌置于0，CaCL2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时Ca2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2 又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（Dnase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2 的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2 与CaCl2 又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，Hanahan除了用CaCl2与MgCl2 处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯
