1、生化分离工程期末考试第一章 绪论1、生物分离工程：从发酵液或酶反应液或动植物培养液中分离、纯化生物产品的过程。2、生化分离工程的特点：目标产物浓度低、杂质含量高；物料体系复杂多相，非牛顿流体；目标产物稳定性差；分离过程可变性；质量要求高产品价格与产物浓度呈反比第二章 发酵液的预处理和固液分离1、预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率。2、预处理的方法：凝聚和絮凝、加热法、调节悬浮液的PH值、杂蛋白的去处、高价无机离子的去除、助滤剂和反应剂 。3、凝聚：指在投加的化学物质作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成mm 大小块状凝聚体的过程。机理：1）中和粒子表面电荷 ；2）消除
2、双电层结构；3）破坏水化膜。4、絮凝：指使用絮凝剂将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。机理：架桥作用。采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。5、絮凝的影响因素：1.发酵液的性质；2.絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖；3.絮凝剂的分子量；4.pH 控制；5.搅拌速度。6、混凝：对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好絮凝效果；对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝
3、。7、杂蛋白的去除方法：沉淀法（等电点沉淀法、酸碱调节）、变性法（蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性）、吸附法（加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去）。8、固液分离的方法：过滤、离心、膜分离、双水相萃取、扩张床吸附。9、影响发酵液固液分离的因素：1）发酵液中悬浮离子的大小；2）发酵液的黏度（固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。）10、过滤:借助于过滤介质，在一定的压力差P作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。 11、离心技术分类：(1)按分离因子Fr分类：常速离心机（Fr 超滤0.010.1 纳滤0.
4、0010.01m 反渗透 小于0.001m；分离粒子：微滤截留固体悬浮粒子，固液分离过程；超滤、纳滤、反渗透为分子级水平的分离；分理机理：微滤、超滤和纳滤为截留机理，筛分作用；反渗透机理是渗透现象的逆过程：压差：微滤、超滤和纳滤压力差不需很大，0.10.6 MPa8、微滤:以多孔薄膜为过滤介质，压力差为推动力，利用筛分原理使不溶性粒子（0.1-10um）得以分离的操作。操作压力0.05-0.5MPa。应用:1)除去水/溶液中的细菌和其它微粒；2)除去组织液、抗菌素、血清、血浆蛋白质等多种溶液中的菌体；3)除去饮料、酒类、酱油、醋等食品中的悬浊物、微生物和异味杂质。9、超滤:是以压力为推动力，利
5、用超滤膜不同孔径对液体中溶质进行分离的物理筛分过程。 应用: 1)蛋白、酶、DNA的浓缩；2)脱盐/纯化；3)梯度分离；4)清洗细胞、纯化病毒；5)除病毒、热源。10、反渗透：利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂而截留离子物质性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。 11、反渗透中溶剂和溶质是如何透过膜的，在膜中的迁移方式如何？答：溶解扩散模型，优先吸附模型（溶解扩散模型适用于均匀的膜，能适合无机盐的反渗透过程，对有机物优先吸附毛细孔流动模型比较优越。）12、溶解扩散模型 （无孔学说）：膜是均匀的，无孔，水和溶质分两步通过膜：第一步：首先吸附溶解
6、到膜材质表面上；第二步：在膜中扩散传递(推动力为化学位梯度)，扩散是控制步骤，服从Fick定律。13、优先吸附-毛细孔流动模型（有孔学说）：优先被吸附的组分在膜面上形成一层吸附层，吸附力弱的组分在膜上浓度急骤下降，在外压作用下，优先被吸附的组分通过膜毛细孔而透过膜。与膜表面化学性质和孔结构等多种因素有关。14、纳滤：分离范围介于反渗透和超滤之间，能截留透过超滤膜的那部分有机小分子，透过无机盐和水。15、纳滤膜的特点：1）纳滤膜的截留率大于95%的最小分子约为nm,故称之为纳滤膜；2）从结构上看纳滤膜大多是复合膜，即膜的表面分离层和它支撑层化学组成不同。其表面分离层由聚电解质构成；3）能透过一价
7、无机盐，渗透压远比反渗透低，故操作压力很低。 16、纳滤的应用：小分子量的有机物质的分离；有机物与小分子无机物的分离；溶液中一价盐类与二价或多价盐类的分离；盐与其对应酸的分离。17、浓差极化：膜分离过程中，膜面浓度高于主体浓度的现象。18、浓差极化 - 凝胶层模型：当发生浓差极化后，膜面上浓度 Cw大于主体浓度Cb，溶质向主体反扩散；当溶质向膜面的流动速度与反扩散速度达到平衡时，在膜面附近存在一个稳定的浓度梯度区，这一区域称为浓度极化边界层；在边界层中取一微元薄层，对此微元薄层作物料衡算。推导边界层形成后，通量与Cw及Cb的关系。19、影响膜过滤的各种因素：1.压力：在超滤中压力升高引起膜面浓
8、度升高，则透过膜的溶质也增大，因而截留率减小；2.浓度；3.温度，在超滤或微滤中，一般说来，温度升高都会导致通量增大，因为温度升高使粘度降低和扩散系数增大；4.流速,根据浓差极化-凝胶层模型,流速增大,可使通量增大；5.其它因素，在反渗透中特别要注意不要使溶解度小的溶质析出，膜过滤含胶体粒子，以免膜堵塞。20、膜的污染：是指处理物料中的微粒，胶体或溶质大分子与膜存在物理化学作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附，沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化现象。大体可分为沉淀污染、吸附污染、生物污染 。21、防止膜污染的方法：进料液的预处理：预过滤、pH及金属离子控制；
9、选择合适的膜材料：减轻膜的吸附；改善操作条件：加大流速。22、膜污染的清洗方法：物理法：海绵球擦洗、热水法、反冲洗和循环清洗；化学法：（选择清洗剂要注意三点：1.要尽量判别是何种物质引起污染；2.清洗剂要不致于对膜或装置有损害;3.要符合产品要求。）23、化学法常用的清洗剂有：NaOH、酸、表面活性剂、氧化剂、酶、有机溶剂24、膜污染的清洗方式:利用膜的不对称性和膜组件的结构特点进行清洗。第六章 溶剂萃取法思考题：1.将青霉素由水相萃取到丁酯相中，其pK=2.75，萃取条件：pH=2.5，T=10，VFVS = 11，测得萃取前发酵液（水相）效价20000 u/ml，平衡后废液效价645.2
10、u/ml，求分配系数K和K0？弱酸的表观分配系数：K=K0 /(1 10 pH pK )。弱酸的表观分配系数： K=K0 /(1 10 pK pH )2.为什么青霉素在酸性（pH2.5）条件下，而红霉素却要在碱性（pH9.8）条件下才能被萃取到丁酯中去呢？ 答：（1）根据表观分配系数公式可知，弱酸的表观分配系数：K=K0 /(1 10 pH pK )弱酸的表观分配系数： K=K0 /(1 10 pK pH )。对于弱酸：pH pK 时，分配系数大。（2）不同pH条件影响弱电解质电离，从而影响分子的极性，根据相似相溶原则，在弱极性的丁酯中极性小的分子溶解度比水中大青霉素 红霉素酸碱性pHpK 弱
11、酸性(2.75) 弱碱性(9.4) 游离分子 “+” “” 游离分子 根据相似相溶原则，在弱极性的丁酯中游离分子极性小，溶解度比水中大，故从水相转入丁酯相中，而发酵液中存在的其它杂质由于极性情况与抗生素不同，故很少进入丁酯中，这样就达到一定程度的纯化。酸性物质：pH pK时，主要以负离子存在；pH pK生) 酸性(pK酸杂pK生) 萃取时 杂质自然除去pK酸杂 pH pH pK生碱性酸性(pK酸杂pK生) 碱性(pK碱杂 pH pK生萃取时无法去除反萃取pK碱杂 pH pK生1、弱电解质的表观分配系数K：分配达平衡时，溶质在两相的总浓度之比。2、带溶剂：对于水溶性强的溶质，可利用脂溶性萃取剂与
12、溶质间的化学反应生成脂溶性复合分子，使溶质向有机相转移。3、乳化：水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。这样形成的分散体系称乳浊液。4、乳浊液的破坏措施：物理法：离心、加热，吸附，稀释；化学法：加电解质、其他表面活性剂。5、乳浊液稳定性和下列几个因素有关：界面上保护膜是否形成；液滴是否带电；介质的粘度：表面活性剂分子在分散相液滴周围形成保护膜。保护膜具有一定的机械强度，不易破裂，能防止液滴碰撞而引起聚沉。介质粘度较大时能增强保护膜的机械强度。6、影响物质分配的因素主要有：聚合物及其分子量的影响；系线长度对分配平衡的影响；体系中无机盐离子的影响；体系pH的影响；温度。7、大规模操作一
13、般在室温下进行,不需冷却。原因：a.成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性;b.常温下溶液粘度低，容易相分离;c.常温操作节省冷却费用。第八章 双水相萃取1、萃取:又称液液萃取,指当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时,生化物质倾向于在两相之间进行分配,当条件选择得恰当时,所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移,集中到一相中,而原来溶液中所混有的其它杂质分配在另一相中,这样就能达到某种程度的提纯和浓缩。影响因素: 影响萃取操作的因素：pH、温度、盐析；有机溶剂的选择；带溶剂；乳化与去乳化。2、双水相萃取法：又称双水相分配法，利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差
14、异进行萃取的方法。特点：保留产物活性。不存在相的分离。溶液分相不依赖有机溶剂。固液分离。优点：易于放大，分配系数K值重复性好，故可直接放大。第九章 超临界流体萃取法超临界流体萃取：利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得到分离。第十章 电泳技术1、电泳：带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。2、电泳技术的特点: 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;样品用量极少;设备简单;可在常温进行;操作简便省时;分辨率高。3、影响电泳的外界因素:电场强度 ；电泳介质的pH值；缓
15、冲液的离子强度；电渗作用；粒子的迁移率；吸附作用。 4、迁移率：是指载流子在单位电场作用下的平均漂移速度，即载流子在电场作用下运动速度的快慢的量度，运动得越快，迁移率越大；运动得慢，迁移率小。溶液中带电粒子在电场 (E)中向着与它相异电荷的电极移动。5、电渗现象：液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动的现象。6、常用的电泳分析方法：纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、等速电泳、双向凝胶电泳（二维电泳）、免疫电泳。7、试述聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质原理？答:具有分子筛和电泳的双重作用(1)SDS-PAGE的原理:蛋白质分子的聚散SDS是一种阴离子去污剂,作为变性剂和助溶性试剂
16、,能断裂分子内和分子间的氢键,是分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级,三级结构;而强还原剂,如二硫苏糖醇,-硫基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂SDS-PAGE测定蛋白质相对分子量：SDS：阴离子去污剂，水溶液中一单体和分子团存在。能破坏蛋白质分子之间及与其他分子间的非共价键，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，使蛋白质丧失了原有电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征点负离子团。具有分子筛和电泳的双重作用第十一章 色层分离法1、层析介质：要求：不溶于流动相；化学稳定；机械强度；大的表面积；粒度均匀。种类：无机（氧化铝，硅胶，活性碳）有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺等）。2、层析的分类：根据溶质
17、分子与固定相相互作用的机理不同的分类：吸附层析法（离子交换色层分离法、疏水作用色层分离法、金属螯合色层分离法、共价作用色层分离法）；分配层析法；凝胶过滤法。根据实验技术的分类:低压层析技术、中压层析技术、高压层析技术、电泳法根据固定相的形状不同的分类：柱层析法、纸层析法、薄层层析法。根据流动相的物态不同的分类 ：汽相层析法、液相层析法。操作方式不同的分类 ：迎头法、顶替法、洗脱分析法。3、层析剂种类：氧化铝 、硅胶 、活性炭、琼脂糖、纤维素。4、层析分离的基本原理：层析分离是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中5、离子交换树脂的结构
18、：其结构由三部分组成：1.不溶性的三维空间网状结构构成的树脂骨架，使树脂具有化学稳定性和机械强度；2.是与骨架相联的功能基团；3.是与功能基团带相反电荷的可移动的离子，称为活性离子，它在树脂骨架中的进进出出，就发生离子交换现象。第十二 吸附与离子交换法 1、阳离子交换树脂：活性离子为阳离子称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换2、阴离子交换树脂：活性离子为阴离子称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换3、离子交换操作步骤：树脂的选择树脂预处理离子交换吸附洗脱再生。 4、离子交换吸附:溶液中待交换离子与树脂上的活性离子发生交换反应的过程使尽可能多的待交换离子吸附到树脂上，同时保证其选择性.5、软化水:将水中硬度去除或降低到一定程度的水，水在软化过程中，仅硬度降低而总含盐量不变。脱盐水:指水中盐类除去或降低到一定程度的水,含盐量小于1-5毫克/升。纯水:是指水中的强电解质和弱电解质去出或降低到一定程度的水含盐量小于1毫克/升。
