1、生 物 工 艺 学,国家十一五规划教材生物工艺学（邱树毅主编）配套课件,目录,第一章绪论第二章工业微生物菌种选育、制备与保藏 第三章工业培养基及其设计 第四章生物工艺过程中的无菌技术 第五章生物反应动力学 第六章 发酵过程原理第七章 生物反应器及生物工艺过程的放大第八章 生物反应过程参数检测与控制 第九章 生物产品分离及纯化技术 第十章 生物产品工艺学及应用,第五章 生物反应动力学,5.1 生物反应动力学概述5.1.1 菌体生长速率5.1.2 基质消耗速率5.1.3 代谢产物的生产速率5.2 生物反应过程的质量和能量平衡5.2.1 质量平衡5.2.2 能量平衡5.3 微生物发酵动力学5.3.1
2、 分批发酵5.3.2 连续发酵5.3.3 分批补料发酵,5.1生物反应动力学概述,生物反应动力学研究的核心之一是反应速率，可用绝对速率和比速率两种定义来描述。,绝对速率(简称速率)，对于液态发酵过程，定义为单位时间、单位反应体积某一组分的变化量，单位为g/(Lh)，当为反应热的生成速率时，单位为kJ/(Lh)。用下面表达式来表示：,比速率是以菌体浓度为基准来表述各组分的变化速率，单位为h-1，当为反应热的比速率时，单位为kJ/(gh)。比速率的大小反应了具有催化活性的细胞活力大小，其中的菌体浓度为单位体积或单位面积的培养基中的菌体量。除受细胞自身的遗传信息支配外，还受环境因素的影响。,5.1.
3、1 菌体生长速率,5.1.2 基质消耗速率,（2）在基质中的某些成分如碳源，除了构成菌体生长的组成成分外，还提供菌体生长代谢的能量需要。所以在基质的消耗中若考虑提供能量，维持代谢的部分，则基质消耗速率及比消耗速率表示为：式中：Yx/s是理论得率，为细胞得率的最大值，是一个常数，g/g。细胞的维持系数，s-1。细胞维持系数对于菌株是一种特性值，对于特定的菌株在特定的培养条件下，是一个常数式中：菌体干重，g；s 用于维持的基质消耗量，g,5.1.2 基质消耗速率,合成代谢：又称同化作用，是新陈代谢当中的一个重要过程，利用能量由小的前体或分子合成较大分子的过程。分解代谢：又称异化作用，是生物体将体内
4、的大分子转化为小分子并释放出能量ATP的过程，如呼吸作用。合成代谢为分解代谢提供物质基础，分解代谢为合成代谢提供能量来源。维持代谢：又叫內源代谢、内呼吸，是指活细胞群体的生长速率与死亡速率处于动态平衡时，无新生物量的生成及无胞外代谢产物合成的状态，细胞所需能量由细胞内源储藏物的氧化及降解产生。细胞维持系数m（s-1）：是指单位质量的干菌体在单位时间内因维持代谢消耗的基质的质量。特定菌株在特定条件下的m值是一个常数。（3）当产物的合成与能量代谢过程相偶联时，基质的消耗速率也应考虑产物的生成速率。,5.1.3 代谢产物的生成速率,一、根据代谢产物与微生物生长繁殖的关系：(1)初级代谢产物：与微生物
5、自身生长繁殖关系密切，是微生物生长过程必需的一类结构简单、代谢途径明确、产量较大的小分子物质。如：氨基酸、核苷酸、核酸等。(2)次级代谢产物：与微生物的生长繁殖无明确关系，在微生物的生长后期，细胞浓度积累到一定量后产生的分子结构复杂、代谢途径独特的物质（初级代谢产物作其前体）。如：抗生素、生物碱、色素、毒素等。,二、根据产物生成速率与细胞生成速率之间的动态关系：（1）生长关联型（2）生长部分关联型（3）非生长关联型,5.1.3.1 生长相关型,产物生成关联模型动力学特征示意图,由图可见细胞与产物的浓度、反应速率、比速率变化几乎为同步的，最大值出现的时间相差不大，当基质浓度开始降低时，细胞及产物
6、的浓度开始增长；基质的消耗速率逐步增高时，细胞及产物的生成速率也先后增加；基质及细胞的比速率几乎为同步，产物的比生成速率在前期增长时与基质、细胞的比速率也几乎同步，但后期达最大值后，就出现延后现象。,由图可知,5.1.3.2生长部分关联型,生长部分关联型：该类反应产物的生成与基质的消耗仅有间接关系，是细胞的能量代谢的间接结果，产物的生成与底物的消耗仅有时间关系，无直接的化学计量关系。,产物生成部分关联模型动力学特征示意图,由图可知,从图中可以看出当细胞及基质的比速率下降到一定程度，细胞浓度有一定的积累时，产物生成才有较明显的增加，开始大量生成、积累。如：氨基酸、柠檬酸等物质的生成。其动力学可以
7、用Luedeking-Piret方程表示为：式中：为与菌体生长速率相关的产物生成常数 为与菌体浓度相关的产物生成常数 在此模型中的一些特殊情况，如考虑到产物可能存在部分分解时，还可以可写成：式中：kd产物分解常数,5.1.3.3 非生长关联型,非生长关联型是指产物的生成与细胞的生长无直接联系，即产物的生成与细胞的生长无偶联关系。当细胞处于生长阶段时，几乎无产物生成，细胞生长处于静止阶段时，细胞浓度积累到一定值时，产物才大量积累。此类产物多属细胞的次级代谢产物，如抗生素、微生物毒素、甾体类物质的生成。,产物生成非关联模型动力学特征示意图,在图中也可看出在细胞浓度较高时，产物才开始生成、积累；在反
8、应前期细胞的生长速率及比速率大时，产物的生产速率很小，几乎为零，而反应的后期恰相反。其动力学方程可表示为：,由图可知,5.2 生物反应过程的质量和能量平衡,5.2.1 质量平衡,5.2.1.1 碳元素平衡,5.2.1.2 氮平衡,5.2.1.3 基质平衡,5.2.2 能量平衡,5.2.1.1 碳元素平衡,在生物反应过程中，碳源是细胞生长和代谢过程中必不可少的重要物质，研究碳平衡可了解碳元素在生物反应中的流向，通过理论计算及工艺优化控制，为碳源对产物的转化率及生产效率的提高提供有力的依据。,基质中的碳源，经微生物利用可转移到菌体、产物、分解代谢的CO2中，根据平衡关系，建立细胞生长代谢过程的碳元
9、素平衡关系。式中：si第i项基质含碳量，g/mol或g/g；x干菌体含碳量，g/g；pj第j项产物含碳量，g/mol或g/g；cCO2含碳量，g/mol或g/g。,返回,5.2.1.2 氮平衡,基质中的氮源，可以根据平衡关系，建立细胞生长代谢过程的氮元素平衡关系。,式中：si第i项基质含氮量，g/mol或g/g；x干菌体含氮量，g/g；pj第j项产物含氮量，g/mol或g/g；,在分批发酵过程中，随着营养物质的消耗，基质中氮源的减少及细胞因营养的限制而使生长速率下降等因素使细胞对氮的摄入率下降，从而使细胞中的氮含量减少。如果进行补料控制，维持细胞的活性及比生长速率，可获得稳定的氮摄入率及氮含量
10、。,返回,5.2.1.3 基质平衡,在碳元素平衡的基础上建立基质平衡，在好氧发酵中，含碳基质经呼吸作用释放出能量，满足细胞生长代谢的需求，并在代谢过程中转化成初级代谢产物，进而合成细胞成分及次级代谢产物,基质的平衡关系：式中：Cs基质分解的消耗量；(Cs)m微生物维持分解需消耗的基质量；(Cs)x用于菌体生长相应的基质消耗量；(Cs)F用于产物生成相应的基质消耗量。,返回,能量依附于物质存在，物质代谢过程中伴随着能量的变化，一般合成代谢伴随着能量的消耗，发生吸能反应。分解代谢伴随着能量的释放，发生放能反应。最后能量由碳-能源基质为来源一部分被细胞和产物贮存起来，另一部分，以热能的形式释放被环境
11、吸收。,5.2.2 能量平衡,式中：N(ATP)s基质分解所生成的ATP量；N(ATP)m微生物维持分解需消耗的ATP量；N(ATP)G用于菌体生长相应的ATP消耗量；N(ATP)p用于产物生成相应的ATP消耗量。,在微生物的生长代谢过程中，能量多以ATP的形式进行贮存，则能量的平衡关系可表示为：,返回,公式字符意义,5.3 微生物发酵动力学,发酵动力学分类,根据微生物对氧的需求可以分为：好氧发酵、厌氧发酵、兼性好氧发酵,根据使用的培养基的形态不同可分：固态发酵、液态发酵、半固态发酵,根据培养基的装载方式不同可分为：浅层发酵、深层发酵,5.3.1 分批发酵,分批发酵又称间歇式发酵(培养)，是指
12、将一定量的培养基一次性地加入发酵罐中，接种后发酵一段时间，一次性地排出发酵成熟液，结束发酵的培养方式。,在整个发酵过程中除了氧气的通入，尾气的排放，pH的调节及消泡而添加的酸碱及消泡剂外，发酵罐内的培养液与外界之间无物质的转移，基本上算一个密闭的发酵过程。,根据菌体浓度随发酵时间的变化情况，人为地将分批发酵中微生物的生长过程分为延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期四个阶段。,5.3.1.1 分批发酵的微生物生长动力学,（一）延迟期,（二）指数生长期,（三）稳定期,（四）衰亡期,（一）延迟期 延迟期又称为调整期、停滞期，是指菌体细胞刚接种到新的营养环境，生长所需要的一个适应阶段。特征：在此阶段，细
13、胞对新培养基中的成分利用较为缓慢，需分泌相应的诱导酶来利用其成分，合成胞内物质，单个菌体细胞的质量有所增加，但数量却几乎不增加，比生长速率接近为零。延迟期的长短与细胞生理状态、培养条件等因素密切相关，在生产上，常采用（1）处于对数生长期的菌种、（2）合适的接种量、（3）减少菌种培养发酵培养基组分间的差异等措施来缩短延迟期的时间，进而缩短细胞的非生产时间，提高生产效率。,返回,（二）对数生长期 对数生长期又称为指数生长期，是指在延迟期后，细胞的生长繁殖速率快速提高，能达到比生长速率最大值的阶段。特征：在此阶段中，培养基中营养充分，菌体生长不受基质浓度限制，菌体生理活性高，繁殖速度快，胞内反应速度
14、快，细胞数量及质量呈指数倍增长，胞内的各组分均以相同的速率增加，细胞的平均组成相对恒定，比生长速率可视为定值。,由此可以得出结论,返回,（三）稳定期 稳定期又称为平衡期、静止期，是随着营养成分的继续消耗，影响了细胞比生长速率，降低了生长速率，增大了死亡速率，当生长速率与死亡速率相等时，细胞的纯生长速率为零，新增活细胞数减少，细胞浓度达最大值Cx,max。细胞进入次生代谢产物合成阶段。此时有：式中：kd细胞死亡速率常数。当kd为零时，Cx达最大值,返回,（四）衰亡期 衰亡期是指随着营养物质的不断耗尽，细胞死亡速率增大，细胞浓度迅速下降的阶段。此阶段细胞的死亡速率也遵守一级动力学关系：在衰亡期中的
15、某一时间内，活细胞浓度为：由此可见，在分批发酵过程中，细胞生长速率、比生长速率、细胞浓度等均处于动态变化状态，与其相关的基质浓度、细胞生长速率、活力大小、代谢产物浓度等因素也随之变化，进而使细胞的生长出现了一定的变化规律。,返回,5.3.1.2 Monod模型,对于菌体的生长受培养基中营养物质的限制关系，Monod在1947年提出了限制性基质对微生物比生长速率影响的动力学模型。Monod假设在微生物的生长过程中，仅受培养基中的一种基质浓度限制影响，则这种基质称为限制性基质或底物。,Monod 方程,限制性底物浓度对比生长速率的影响,Monod方程的意义 Monod方程体现了分批发酵过程中Ks、
16、Cs、之间的关系，在发酵前期Cs过量时，细胞生长不受基质浓度限制，以max生长，在发酵后期，Cs下降到Ks水平，开始下降，细胞生长由对数生长期转入衰减期，随基质的消耗，继续下降，最后为零，细胞进入衰亡期，停止生长。Ks越小，细胞对底物的亲合力越大，下降得越慢，细胞在对数生长期停留的时间越长，对细胞生长越有利。,Monod方程的意义,Monod方程,5.3.2连续发酵,定义：连续发酵是在分批发酵的基础上，以一定的速率连续地流加新鲜培养基并流出等量的发酵液，以维持培养系统内各营养物质量的恒定，使细胞处于近似恒定状态下生长的发酵培养方式，也称连续培养。,特点：连续发酵具有机械化、自动化程度高，利于对
17、发酵过程进行优化；发酵罐的清洗、灭菌等非生产时间占用少，有效地提高设备利用率及生产效率等。但在发酵过程中，易染菌污染，菌种易变异。,应用：连续发酵目前主要用于发酵动力学参数的测定、发酵条件的优化等研究中，在工业生产的应用还不普遍，目前只在酒精、单细胞蛋白、丙酮丁醇、葡萄糖酸、醋酸等产品的生产及污水处理等方面应用。,反应动力学的应用连续培养的操作特性,连续全混流操作示意图,F 流入培养液的体积流量；Cs0流入的培养液中生长限制性底物的浓度；CX0 流入的发酵罐的菌体浓度；V 反应器内液体的体积；Cs、Cx、CF 分别为定稳态下的菌体、底物和产物浓度。,假设流入液中仅有一种营养成分为细胞的限制性基
18、质，其他成分不发生抑制，则在反应过程中，菌体、限制性底物、产物的物平遵守下式：流入速度=流出速度=F,(1)细胞的物料平衡细胞和限制性基质浓度、培养基流速之间的关系依物料平衡关系建立下式：发酵罐中细胞浓度的变化量=流入的细胞量流出的细胞量+生长的细胞量死亡的细胞量。即：,对于用限制性基质培养时，当稀释率开始增加时，在发酵罐内底物残留浓度增加得很少，大部分底物被细胞所消耗，直到Dmax时，底物残留浓度才显著增加。细胞对底物的亲和性不同，即Ks不同，底物残留浓度随D的增大而变化的程度也不同。如果继续增大稀释率，菌体将从系统中被洗出，菌体浓度随稀释率的增大迅速降低，底物残留浓度也随之迅速增加。现将导
19、致底物开始从发酵罐中洗出时的稀释率定义为临界稀释率Dc，即是在恒化器中能达到的最大稀释率。,(2)限制性基质的物料平衡 限制性基质的物料平衡可建立如下关系式：发酵罐中限制性基质浓度的变化量=流入的限制性基质的量流出的限制性基质的量维持生命所需的限制性基质的量形成产物消耗的限制性基质的量。一般情况下，用于细胞维持生命的量及用于产物形成的量均大大小于基质用于细胞生长的量，mCsCs/Yx/s，qsCsCs/Yx/s，故可忽略不计。在达到稳定状态时，上式变成：Monod方程应用于连续培养时，大多数情况下，Dc相当于分批培养的max，则有：当D小时，底物被细胞充分利用，Cs0，细胞浓度。随着D的增加，
20、达到Dc时，Cx0，CsCs0，即为洗出点，则有：,5.3.3分批补料发酵,定义：分批补料发酵是在分批发酵(培养)过程中，间歇地或连续地向培养基中补加新鲜培养基的发酵(培养)方式，是介于分批发酵及连续发酵之间的一种过渡性操作，又称为半连续发酵(培养)。,特点：从工业应用的角度来看，分批补料发酵基质浓度可控，染菌、菌种变异几率较低，优于分批发酵和连续发酵，是目前应用较广的发酵方式。特别适于细胞的高密度培养、存在底物抑制或分解代谢物阻遏的反应过程、营养缺陷型菌株的培养、需补充前体物质的反应过程及高粘度的培养系统等情况。,分批补料发酵法生产的部分产品,5.3.3.1 分批补料发酵的分类,无反馈控制流
21、加方式常根据基质流加方式及流速的不同：指数流加；恒速流加；间歇流加；变速流加,间歇流加是指将基质间歇性地、间断地流入反应器中，操作简单，但不适于细胞生长的不同阶段对营养的需求。,恒速流加是指以恒定的速率将基质连续不断地流入反应器中，是最简单的一种基质补加方式，但在细胞的比生长速率下降后，会造成基质的浪费。,变速流加是指根据不同时期细胞对基质的需求大小不同，来调整基质流加的速度。此种方式能维持细胞较高的比生长速率，同时又节省补加的基质用量。,指数流加是指在整个细胞培养期间，基质流加的速率与细胞生长速率相一致，也呈指数方式增加，符合细胞的生长及其对营养的需求规律，是一种简单有效的补料流加方式。,根
22、据基质的流加方式的不同:反馈控制流加；无反馈控制流加,重复分批补料发酵是在单一分批补料发酵的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大工作容积，从而延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发酵液全部放出的方式。,5.3.3.2 分批补料发酵动力学,(1)单一分批补料发酵,分批补料的流加操作示意图F培养液的流加速率；Csf流加培养液中基质浓度；V反应器内液体的体积；Cs、Cx、CF分别为定常态下的菌体、底物和产物浓度。,恒速流加,变速流加,恒速流加即是将限制性基质以恒定不变的流速流入反应器中，是一种最简单的操作方式。假设反应器内为理想混合，培养基中仅有
23、一种限制性基质，底物仅用于细胞的生长，Yx/s为一常数。在操作中，随着新鲜培养液的流加，其稀释率随时间而下降，当限制性底物的消耗速率等于其流加速率时，即达到D，则流加操作可视为达到拟稳态操作。在拟稳态下，则有：底物：细胞：在恒速流加时，细胞的总量随时间呈线性关系：细胞的比生长速率：,返回,指数流加操作是考虑细胞的生长特性而提出的，是采用流加速率随时间呈指数变化的方式来流加限制性基质，以维持细胞的比生长速率不变的操作模式。可表示为：细胞的总量为：分批补料发酵方式中控制的核心即是使反应器中限制性基质的浓度在反应中保持恒定；即,式中 Cs D为要求控制的基质浓度。最终整理得：其中：Ft为时间t的加料速率,返回,(2)重复分批补料发酵,与单一分批补料发酵方式不同，当反应器中的培养液体积达到一定程度后，就取出部分培养液，剩余的部分继续流加培养液，如此反复进行流加、排放的操作方式。对于恒速流加的重复补料分批发酵方式可在排放一部分培养液后，使细胞的比生长速率重新得到提高，同时有效地延长了细胞的生产过程，提高了生产能力及设备的利用率。假设在流加操作过程中达到拟稳态，培养液初始体积为V0，经过时间tm的恒速流加后，培养液体积达到Vm后，排放一部分培养液使体积恢复到V0，再流加培养液，再排出培养液，反复进行操作。,本章小结,生物反应动力学概述,生物反应过程的质量和能量平衡,微生物发酵动力学,
