1、槐米中芦丁提取及含量测定 题 目:槐米中芦丁的提取及含量测定摘要3关键词3前言31 槐米的简介32 芦丁的简介41 实验材料、仪器与试剂5 1.1 实验材料51.1 实验仪器51.2 实验试剂52 实验原理及实验条件52.1 实验相关原理52.2 实验条件的选择73 实验方法和结果 73.1芦丁的提取73.2芦丁的精制7 3.3芦丁的鉴定73.3.1呈色反应73.3.2薄层色谱检识83.4 芦丁的含量测定83.4.1 对照品溶液的配制83.4.2标准曲线的制备93.4.3样品测定103.4.4样品稳定性试验103.4.5加样回收率实验104 讨论与小节115 参考文献116 综述12槐米中芦丁
2、的提取及含量测定摘要：目的：测定槐米中芦丁的含量，掌握芦丁的提取工艺。方法：采用碱提酸沉法获得芦丁粗提物，利用多次碱提酸沉法获得较纯的芦丁，再通过显色实验以及薄层色谱鉴定槐米提取液中的芦丁，并通过标准曲线法测定提取物中芦丁的含量。结果：吸光度与标准溶液的浓度呈良好的线性关系，回归方程为A=30.1081C+0.0184,采样率为96，没有太大的区别。结论：该方法易于操作，实验原理比较简单，薄层色谱与分光光度相结合实现了槐米提取液中芦丁的鉴定与含量测定。关键词：槐米 芦丁 碱提酸沉法 含量测定Abstract: Objective: to determine the content of lud
3、ing in acacia and the extraction process of luding.Methods: alkali, acid sinking method to obtain crude extract rutin using multiple alkali acid sinking method to obtain a more pure rutin, again through the color experiment and TLC identification of rutin in the sophora japonica extract, and through
4、 the standard curve method for determining the content of rutin in extracts.Results: the concentration of standard solution and absorbance had good linear relationship, the regression equation A = 30.1081 + 0.0184 C, R = 0.9997, the sampling rate is 96%, not much difference.Conclusion: this method,
5、easy to operate, the experiment principle is simple, thin layer chromatography combined with a spectrophotometKey Words：Sophora japonica rutin alkali extraction and acid precipitation content determination 前言1.槐米的简介槐米Flos Sophorae Immaturus,是豆科植物槐树Sophora japonica L.的干燥花蕾，微寒，现列在国家卫生部第一批药食同源名单中，有凉血止血
6、，清肝泻火等功效1。全国大部分地方均产，主要产地在河北、天津、北京、山东、山西、辽宁等地。夏季花开放或者花蕾形成时宜采收，并及时干燥，除去枝、梗及其他杂质。开花期采栽者通常称作“槐花”，花蕾期采栽者习惯上称“槐米”。体轻，气微，味道稍微有点苦涩。我国是芦丁的出口国,槐米是提取芦丁的主要原料,2015 版中华人民共和国药典(一部) 规定,槐米中总黄酮的含量(以无水芦丁计)不低于 20%,无水芦丁(C27H30O16)不少于 15%3。 槐花 （开花期） 槐米（花蕾期） 干燥槐米 2.芦丁的简介 芦丁（芸香苷）(Rutin)：槲皮素与芸香糖结合而成的苷。其中芸香糖（Rutinose）为葡萄糖（gl
7、ucose,glc）与鼠李糖(Rhamnose,rham)经1，6-苷键连接而成的双糖。芦丁具有抗炎、抗过敏、抗心肌缺氧及缺血、抗心律失常、降低血清胆固醇、抑制血小板集聚、抗溃疡、抗肿瘤、解痉、镇咳、抗病毒和增强免疫力等功能4，是预防和治疗糖尿病5、心绞痛、慢性心功能不全、高血脂和预防动脉硬化心机梗死、脑血栓等疾病的天然绿色药物。槲皮素具有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用。用于治疗慢性支气管炎。对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。1.实验材料、仪器和试剂1.1实验材料：槐米（购于广西桂林）。1.2实验仪器：Lambda35型紫外-可见
8、分光光度计(PE公司)、KQ-500E型超声波清洗器、FA 2004N电子天平（上海天平仪器厂）、JB202-电热恒温干燥箱(上海忠技仪器有限公司制造)、实验室真空抽滤仪YH-23(青岛仪航有限公司)、乳钵、烧杯（1000ml、500ml）、布氏漏斗、表面皿、量瓶（100ml、50ml、10ml）、10ml移液管、吸量管（1ml、5ml）。1.3实验试剂：饱和石灰水、浓盐酸、芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100086-201755）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）、水（重蒸水）。2 实验原理及实验条件2.1.实验相关原理 芦丁是黄酮类化合物，其基本母
9、核为2-苯基色原酮类化合物即C6-C3-C6结构。分子式为C27H30O16，分子量为610.51，化学式见下图。淡黄色小针状结晶，熔点为174178（含三分子结晶水），188(无水物)。能溶于二甲基亚砜和吡啶、甲酰和碱液，微溶于乙醇；丙酮和乙酸乙酯，几乎不溶于水、氯仿、醚、苯、二硫化碳和石油醚。易溶于碱液中，呈黄色。酸化后复析出，可以溶于浓硫酸和浓盐酸，呈深黄色，加水稀释复析出。稀溶液遇三氯化铁呈绿色。无气味，在光的作用下渐变暗。查阅资料可知，UV maxEtOH nm：259，299（sh），359。IR vmaxKBr cm-1：3400（OH）,1670(C=O)，1620，1520，
10、1470（C6H5）。H-NMR（DMSO-d6）：7.52（1H，dd,J=2.0、8.0Hz）；7.40（1H,d,J=2.0Hz）；6.82（1H,d，J=8.0Hz）；6.64（1H,d,J=2.5Hz）；6.24（1H,d,J=2.5Hz）；5.76（1H,d，J=7.0Hz）；4.32（1H,d,J=2.3Hz）；3.0-4.0（10H,m）；1.08（3H,d，J=6.5Hz）。 芦丁 槲皮素槲皮素，又名栎精，槲皮黄素，分子式为C15H10O7，分子量302，化学式见上图。黄色结晶，熔点为313-314C（2分子结晶水），316C（无水物）。溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮
11、等溶剂，碱性水溶液呈黄色，不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚。其乙醇溶液味道极其苦涩，可作为药品，具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。由芦丁的化学式可知：其基本母核是平面型结构，2-位上引入的苯环与色原酮部分形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，同时7-位及4/-位引入-OH或-OCH3等助色团后，因其促进电子移位、重排，两重作用都使芦丁具有较深的颜色即淡黄色（色原酮部分原本无色），从而使芦丁易于较其他黄酮类化合物鉴别。芦丁分子中含有多个酚羟基，而且7-位处于C=O的对位，4/-位处于C=C的对位，在P-共轭效应的影响下，使酸性较强,易溶于碱液（饱和石灰水）中，酸化后溶
12、解度降低复析出，从而可以用于芦丁的提取和精制。芦丁是由槲皮素3位上的羟基与芸香糖脱水缩合成的苷，因而在酸性条件下又可以水解成槲皮素、鼠李糖、葡萄糖。芦丁为黄酮苷，能与三价的铝生成黄色配合物，在NaNO2的碱性溶液中呈红色，在510nm波长处有最大吸收。根据此显色反应用分光光度法可以测定芦丁，但显色反应需要具备良好的重现性与灵敏性，因此必须控制反应条件，主要是溶剂种类、试剂用量、溶液酸碱度、反应时间和显色时间等。2.2 实验条件的选择最大波长的选择：将芦丁对照品加硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝处理后的溶液，用紫外-分光光度计在200600nm进行扫描，标准溶液和样品溶液均在510nm处有最大吸收，故检
13、测波长选择为5106-7。3 实验方法和结果3.1 芦丁的提取：采用酸提碱沉法8-11；（1）称取槐米30g，在乳钵中研碎至槐米碎裂即可，置1000ml烧杯中，加入300ml饱和石灰水（以棉花过滤至澄明）调节pH 7-8之间，并且不断搅拌，加热煮沸15min，趁热以棉花过滤（过滤前应将棉花用水充分润湿，尽量赶出其中的气泡）。（2）残渣再加200ml饱和石灰水，保持PH 7-8之间，并不断搅拌，同时煮沸10min，趁热过滤，合并两次滤液，放冷。（3）向滤液中加入浓盐酸（边加边搅拌）调PH 3-4并放置过夜。（4）次日倾出上清液（不要振摇），抽滤沉淀（布氏漏斗中垫两层滤纸）并用蒸馏水洗至pH 5-
14、6，将滤得物置于表面皿上，得粗芦丁。3.2 芦丁的精制 将粗芦丁加300ml重蒸水，加热，用饱和石灰水调PH 8-9,使充分溶解，趁热少量趁热抽滤，待滤液冷却后加盐酸调节PH 4-5，静置，冷却，抽滤，并用蒸馏水洗至PH 5-6,即可得比较纯的芦丁。3.3 芦丁的鉴定3.3.1 呈色反应：取上述芦丁提取物3-4mg，加甲醇8-10ml使其溶解，分成3份做以下实验。 盐酸-镁粉反应（检查是否有黄酮类化合物存在的最常用方法）：取上述溶液1-2ml，加2滴浓盐酸，再加入少量镁粉。在本实验中观察到颜色变化：黄紫红；说明有芦丁或者槲皮素存在。 锆-枸橼酸反应（区分芦丁和槲皮素）：取上述溶液1-2ml，再
15、滴加2ZOCl2的甲醇溶液3-4滴，在本实验中观察到溶液颜色加深；再继续加入2柠檬酸的甲醇溶液3-4滴，观察到溶液颜色稍微变浅；此步显色反应证明有芦丁的存在，但无法证明是否有槲皮素存在。因芦丁溶液加ZOCl2后颜色加深（5-OH存在），加入柠檬酸后颜色变浅；槲皮素加ZOCl2后颜色加深（5-OH、3-OHC存在），加入柠檬酸后颜色变化不明显，由于颜色掩盖效应，不可排除两同时存在。 -萘酚反应(糖的检测)：取上述溶液1-2ml，然后再加10-萘酚乙醇溶液2-3滴，摇匀，沿管壁缓缓加入浓硫酸1ml，观察到一层出现紫红色，一层为淡黄色接近无色，说明既有芦丁存在又有槲皮素存在即部分芦丁水解。3.3.2
16、 薄层色谱检识样品溶液的处理：称取芦丁提取物20mg，加入甲醇10ml使配制成溶液；对照品溶液的处理：取芦丁对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液,作为对照品溶液。吸附剂：自制硅胶G-CMC版展开剂：乙酸乙酯-甲酸-水（8：1：1）薄层测定：用毛细管取供试品、对照品溶液各10L,分别点于自制的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8：1：1）为展开剂，展开，一段时间后取出，再晾干，待晾干后喷三氯化铝试剂，等乙醇挥发完全后置于紫外光灯（365nm）下检视。在本实验中，观察到供试品色谱上的荧光斑点与对照品色谱的荧光斑点出现的位置相一致。从而证明了样品中芦丁的存在即芦丁没有全部水解。3.4 芦丁的
17、含量测定3.4.1 对照品溶液的制备精密秤取在120C五氧化二磷减压干燥恒重控制的芦丁对照品20mg，至50ml容量瓶中，加适量60%乙醇，超声波处理使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀。精密量取25ml至 50毫升容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得（每1ml中含无水芦丁0.2mg）。3.4.2 标准曲线的制备（1）精密量取对照品溶液（0.2mg/ml）1.00，2.00,3.00，4.00，5.00，6.00分别放在25ml容量瓶中，各加入30%乙醇至6.0ml，各精密加入5%亚硝酸钠1.0ml，充分混匀，放置6分钟。（2）各精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，充分摇匀，放置6分钟。
18、（3）加入1mol /dm3氢氧化钠溶液10ml，加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟。（4）以相应的试剂为空白对照，在510nm最大波长处测定吸光度。以浓度为横坐标 C，纵坐标为吸光度A，建立回归方程。标准溶液在紫外-分光光度计下测得的吸光度溶液浓度C（mg/ml）吸光度A 0.0080.2620.0160.024 0.502 0.7460.032 0.9640.048 1.472 标准曲线以吸光度为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线后求线性回归方程，得回归方程：A=30.1081C+0.0184,R=0.9997。表明芦丁在0.008mg/ml0.048mg/ml范围内有良好的
19、线性关系。3.4.3 样品测定 精密称取槐米提取液(相当于含芦丁0.2mg/ml)5.0ml，放在25ml容量瓶中，各加入30%乙醇至6.0ml，各精密加入5%亚硝酸钠1.0ml，充分混匀，放置6分钟；精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml，充分摇匀，放置6分钟；加入1mol /dm3氢氧化钠溶液10ml，加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟；于分光光度计上，在510nm波长下测定吸光度为0.1701; 根据样品所测的数据，由回归方程计算出样品溶液中芦丁的含量为0.00504mg/ml; 则无水芦丁（）=标准曲线上读出的浓度(mg/ml)*25ml取样量（ml）*样品的标识浓度（mg/ml）=2
20、13.4.4 样品稳定性试验 精密量取上述配制成的芦丁甲醇溶液（0.2mg/ml）,即刻在510nm处测定吸光度，在常温避免阳光直接照射条件下，每间隔一个小时测量一次，依次为1h、2h、3h、4h、5h8h再次测定；结果表明，吸光度值在8h内保持稳定(如下图)。时间（h）012345678吸光度（A）6.04006.04026.04016.04036.03996.03986.04006.03986.04003.4.5加样回收率实验（1）将经粉碎（过20目筛）的槐米样品称0.3g，每份加入10mg芦丁标准品到50毫升烧杯中；（2）加入3ml石油醚浸泡10min后，超声处理30min，静置，待分层
21、后，仔细地将石油醚层倒出；（3）再次加入3ml石油醚，浸泡10min后，超声处理30min，仔细地将石油醚层倒出，避免粉末层倒出，记录实验现象；（4）经脱脂的药材加60%乙醇30ml，用球形冷凝管加热回流过滤半个小时，分别用60%乙醇 5ml洗涤2次获得醇液；（5）将醇液倒入50ml容量瓶并用60%乙醇定容。（6）精密吸取样品溶液0.8ml于25ml容量瓶中，加30%乙醇至6.0ml，加入5%亚硝酸钠1.0ml，混匀，放置6分钟。（7）加10%硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟。（8）加入1mol /dm3氢氧化钠溶液10ml，加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15min。（9）以相应的试剂为
22、空白，在510 n m最大波长处测定样品平均吸光度为0.319.（10）根据回归方程，计算加样回收率= (加标试样测定值试样测定值)加标量100%.=(60.30-50.70)10=96%，符合加样回收率范围。4.讨论与小节中国药典（2015年版）采用比色法测定芦丁的含量，此法比较复杂。本实验采用紫外-分光光度法，重现性好，精密度高，操作简便，易于实践。同时本实验也结合了芦丁的性质以及前人的实践经验，根据芦丁在冷热水中溶解度的差异以及在不同温度、酸碱度等条件下水解程度的差异，采取了碱提酸沉法。测得槐米中芦丁含量为21，表明了本实验的可行性。5.参考文献1 杨娜，朱开梅，顾生玖从槐米中提取槲皮素
23、方法的研究进展J.时珍国医国药，2015，21(12):33402李锋，唐辉，韦宵等广西全州县金槐生产存在的问题及发展对策J.广西科学院学报，2009，25(2):130-1343 国家药典委员会中国药典S北京:中国医药科技出版社，2015: 3334 李茂星，谢景文，葛欣芦丁的药效学研究进展J华西药学杂志，2011，15(6):450 5 Odetti PR，Borgoglio A,Pascale AD，etal Prevention of diabetes increased aging effect on rat collagenlinked fluorescence by aminog
24、uanidine and rutinJ.Diabetes,1990,39(7):796 6李振志,朱华,谢锋等. 不同产地槐米中芦丁的含量测定J.World Chinese Medicine, 2013，8（8）：952-954.7王朝周,程秀民. 薄层扫描法测定槐米中芦丁含量J.中国方剂学实验杂志，2004，10（4）：21-22.8冀德富，程月召，李慧峰等，高纯度芦丁的制备实验研究J.实验室科学，2014，17（4）：38-41.9李颖平，用碱溶酸沉法从槐米中提取芦丁工艺的优化J. 山西农业科学,2015，43（6）：751-753.10李慧,王明明, 槐米中芦丁的提取结晶与含量测定J.
25、陕西中医,2011,32(10):1412-1413.11姚倩，郭晓强，宋芹, 槐米中芦丁提取工艺的比较研究J.成都大学学报（自然科学版），2013，32(4):332-333.综述芦丁的药理作用及剂型的研究进展 摘要：在我国芦丁产量比较大，槐米、荞麦、红旱莲、野生梧桐叶等植物中含有芦丁，因而目前多通过提取纯化的方法生产芦丁，也有部分通过人工合成。近年来，人们对于芦丁的研究越来越深入，芦丁在医药中的应用也越来越频繁。该综述主要总结前人对芦丁在药理及剂型方面的部分研究。关键词：芦丁 药理作用 剂型 研究进展Abstract: Rutin yield in our country is large
26、r, sophora japonica, buckwheat, red dry lotus, wild wutong leaves, such as plant contains rutin, more so now manufactured by the method of extraction and purification, rutin and some by artificial synthesis.In recent years, the study of luding has become more and more advanced, and the use of lutin
27、in medicine has become more and more frequent.This review mainly summarizes some research on the pharmacological and dosage forms of luding.Key words: rutin Pharmacological effects Dosage forms The research progress芦丁，异名芸香苷、维生素、紫槲皮苷，芸香叶苷，路丁，络通。具有维生素P样作用，能降低血管脆性及异常的通透性，可用于防治高血压及动脉硬化的辅助治疗剂。多年来，国内外学者借助
28、于现代先进的化学和药理手段，尤其是新型的分离和分析方法，对芦丁的药理活性进行了深入的研究。本文着重就芦丁的药理作用、主要剂型和临床应用进行综述。1.芦丁的药理作用1.1 对心血管系统的作用目前，有不少含黄酮类化合物的中药在临床上用于治疗冠心病，其中芦丁、槲皮素等有明显的扩冠作用，同时对由ADP、胶原蛋白或凝血酶引起的血小板聚集及血栓的形成也有抑制作用【1】。储金秀等2研究表明芦丁能剂量依赖性的抑制Ang诱导的心肌细胞的肥大，并能拮抗Ang诱导的心肌细胞蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)蛋白表达的增加和位移，降低PKC的活性。PKC主要存在于细胞核内，对细胞增殖、分化、转化、
29、凋亡信号转导发挥重要作用，与心血管疾病关系密切。在抑制血小板凝聚方面，可能与芦丁可以抑制血小板激活因子（PAF）诱导的血小板聚集、5-HT 释放及血小板游离钙增加有关。PAF 是迄今发现的最强的血小板聚集激活剂，它可由血小板、白细胞、内皮细胞等多种细胞产生并具有广泛的生物活性，在许多疾病过程中起介导作用， 与组织缺血再灌注损伤、冠心病、动脉粥样硬化、脑血管疾病等诸多心脑血管疾病密切相关3。因此拮抗PAF的作用, 为目前缓解缺血性心脑血管疾病的重要途径。1.2 抗炎作用有报道，芦丁及其衍生物羟乙基芦丁（曲克芦丁）对角叉菜胶、5-HT及PEG诱发的大鼠足爪水肿、甲醇引发的关节炎及棉球肉芽肿等均有明
30、显的抑制作用。芦丁抗炎的机制可能与前列腺素生物合成过程中的脂氧合酶受到抑制有关【4】。1.3 抗菌及抗病毒作用有研究表明: 芦丁有抗病毒和抑制醛糖还原酶活性的作用3,此机制尚不明确。1.4 弱雌性激素样作用 有报道称，异黄酮类有雌性激素样作用；而芦丁等黄酮类有弱雌性激素样作用，这可能是它们与己烯雌酚结构相似的缘故【5】。1.5 抗自由基活性、防晒、抗氧化芦丁是清除自由基的强氧化剂, 它可终止自由基的连锁反应, 抑制生物膜上多不饱和合脂肪酸的过氧化作用 ,清除脂质过氧化产物, 保护生物膜及亚细胞结构的完整性, 在机体内起着重要作用6。芦丁是一种天然抗氧化剂，研究发现芦丁对O2-有很强的清除作用，
31、清除效率可达96%以上。1.6 抗脂质过氧化作用脂质过氧化是指活性氧自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸而引起的一系列氧化过程。芦丁作为二价铁的螯合剂，能抑制 Fenton（芬顿）反应和脂质过氧化的链式反应而具有明显的抗脂质过氧化作用7，其保护作用与传统的谷胱甘肽（GSH）保护作用近似。1.7 抗急性胰腺炎(AP)芦丁能有效防止低钙血症的发生,并降低胰腺组织钙离子浓度。研究发现芦丁能提高胰腺组织大鼠磷脂酶含量, 提示芦丁可能对胰腺组织PLA2的释放及激活具有抑制作用; 芦丁能有效防止AP大鼠低钙血症的发生,可能是通过阻止钙离子内流并降低胰腺组织细胞钙离子超载, 而减轻对 AP的病理生理损害8 。 1.8 增强免疫、抗衰老有报道表明，芦丁可减小血管通透性，增加弹性，抑制毛细血管扩张，从而起到祛红血丝的作用；同时芦丁还具有抗辐射和吸收射线的功能，使皮肤红润、光滑、抗皱，起到延缓衰老的作用。1.9降低血糖、抗癌细胞芦丁可激活神经介素受体，神经介素U2是2000年发现的一种
