1、扎那米韦长链酯衍生物1c体内外抗流感病毒活性研究扎那米韦长链酯衍生物1c体内外抗流感病毒活性研究【摘要】 目的 研究扎那米韦长链酯衍生物1c的体内外抗流感病毒活性。方法 体外实验以流感病毒感染的MDCK细胞为模型，以细胞病变为指标，研究了化合物1c的细胞毒性以及对4种流感病毒A型和3种流感病毒B型的抑制活性。体内实验应用感染了流感病毒甲1(H1N1)亚型FM1株的小鼠动物模型，观察不同给药方案、不同剂量、不同给药途径的多项指标。结果 在细胞培养内，化合物1c抑制流感病毒A型的IC50在mol/L之间；抑制流感病毒B型的IC50在mol/L之间。体内实验中，应用不同给药方案1c治疗可以明显改善F
2、M1感染小鼠的存活率，平均生活日及肺指数。结论 化合物1c有潜能开发为抗流感病毒药物。【关键词】 扎那米韦； 衍生物； 流感病毒 ABSTRACT Objective To test the anti influenza virus activities of a zanamivir derivative 1c. Methods The cytotoxicities and antiviral activities of 1c in vitro on four influenza virus A strains and three influenza virus B strains were
3、tested in MDCK cells. The antiviral activities of 1c in vivo were tested in the mice infected with influenza A virus subtype FM1. Results In cell culture, the IC50s of 1c for influenza virus A strains weretomol/L, and for influenza virus B strains weretomol/L. In vivo, 1c displayed significant thera
4、peutical effects on mice infected with influenza virus A subtype FM1 on survival rates, survival days and lung indexes with different medications. Conclusion The new compound 1c may be a potential candidate for new antiviral drugs. KEY WORDS Zanamivir; Derivative; Influenza virus 流感是一种由流感病毒引起的急性病毒性呼
5、吸道传染病，每年都在全世界流行，其波及范围很广，造成的经济损失严重，对公共卫生的威胁巨大1，2。尽管人们在分子和细胞水平对流感病毒的认识有了长足的进展，但是由于流感病毒抗原变异频繁，疫苗效果不理想，药物研发相对缓慢，所以流感病毒引起的死亡和损伤仍然是呼吸系统疾病中最为主要的37。目前人们已经发现的流感病毒药物研发分子靶点有：血凝素、神经氨酸酶(neuraminidase，NA)、M2蛋白等，其中针对NA的研究最为广泛和深入。通过在结构水平对酶活力的研究，可以研制出构效关系更明确、更加广谱的抗病毒药物811。FDA批准的两个NA抑制剂药物扎那米韦和oseltamivir就是明显的例子。由于扎那米
6、韦的口服生物利用度低，分布体积较小，尿清除速率过快，所以临床应用受到限制，给药途径局限为吸入给药12。一些实验室研究了扎那米韦类似物的合成以及它们对流感病毒的抑制活性1315。 本研究中，我们对刘宗英等合成的扎那米韦长链酯衍生物1c(结构式见图1)进行了体内外抗流感病毒活性研究。在体外实验中，我们以MDCK细胞为模型，研究了化合物1c的细胞毒性以及对4种A型和3种B型流感病毒的抑制活性，体内实验以感染了流感病毒甲1(H1N1)亚型FM1株的小鼠为模型，评价化合物1c的体内抗病毒活性。 图1 化合物1c的结构式 1 材料与方法 材料 MDCK细胞由本室自行传代培养。流感病毒A/粤防/243/72
7、(H3N2)、流感病毒A/济防/15/90(H3N2)、流感病毒A/京防/262/95(H1N1)、流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)、流感病毒B/济防/13/97、流感病毒B/京防/76/98、流感病毒B/四川/83/2000和流感病毒甲1(H1N1)亚型(FM1株，H1N1)鼠肺适应株均由本室提供。细胞培养液为含10%新生牛血清，/ml谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100g/ml链霉素的Eagles基础培养液(MEM)。维持液为含10%白蛋白，/ml谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100g/ml链霉素的Eagles基础培养液(MEM)。小鼠为昆明鼠，雌、雄各半，1416g，购
8、于中国医学科学院实验动物研究所。化合物1c和扎那米韦由本研究所合成室提供；利巴韦林(RBV)购自湖北省医药工业研究院。 化合物1c对MDCK细胞毒性实验 (1)细胞病变法(CPE法) 将生长状态良好的MDCK细胞，按每孔约104 MDCK细胞接种到96孔培养板，每孔，37，5% CO2培养箱培养24h，待细胞长成单层后进行实验。加入含有不同浓度倍比稀释的1c的维持液，共8个稀释度，每浓度2孔，同法测定扎那米韦，同时设无药物细胞对照。以观察细胞病变为指标，显微镜下观察细胞病变，75%100%为4，50%74%为3，25%49%为2，1%24%为1，无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度，按R
9、eed & Muench法计算半数有毒浓度CC50。 (2)四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法) 按每孔约104 MDCK细胞接种到96孔培养板，24h后待细胞长成单层后，弃去培养液，加入含有不同浓度倍比稀释的1c的维持液，每个稀释度重复3孔，置37，5% CO2培养箱，培养72h，弃上清，加入100l维持液配制的MTT(/ml)，37继续培养4h，每孔加入100l 50% N，N 二甲基甲酰胺(DMF) 20%十二烷基磺酸钠(SDS)脱色液，37过夜，在酶联仪上测定波长为570nm的吸收值(A570)。每次实验均设定细胞对照孔3孔，结果以公式(细胞对照A570-加药细胞A570)/细胞对照A57
10、0，计算细胞死亡率(%)，并用Reed Muench法计算半数有毒浓度CC50，同法测定扎那米韦。 化合物1c体外抗流感病毒活性实验(CPE法) 按每孔约104 MDCK细胞接种到96孔培养板，24h后待细胞长成单层后，弃去培养液，加入一定量的病毒，37吸附2h，然后弃病毒液，加无血清MEM洗板，加入含不同浓度化合物1c的维持液，每浓度3孔，37，5% CO2培养箱培养，待病毒对照组病变为4个加号时，观察结果。75%100%为4，50%74%为3，25%49%为2，1%24%为1，无病变为0。实验同时设细胞对照，病毒对照，阳性对照药为扎那米韦。并用Reed Muench法计算半数有效浓度IC5
11、0(表1)。 化合物1c小鼠体内抗流感病毒甲1(H1N1)亚型(FM1株)疗效实验预防+治疗实验 采用流感病毒甲1(H1N1)亚型(FM1株)感染方法。除毒性对照组外，其余各实验组小鼠均经乙醚麻醉，用加样器经鼻滴入40l一定量LD50的实验病毒液。实验时化合物1c用5%吐温 80配成一系列浓度的悬液，采取灌胃方式给药。剂量为、及/kg。感染当天在感染前4h灌胃给药1次，感染后间隔4h再次给药，每日2次，共5d。阳性药物RBV采用腹腔注射50mg/kg，每日2次，共5d。病毒对照组采用给予同样体积5%吐温 80 表1 化合物1c体外抗流感病毒活性溶液灌胃给药，每日2次，共5d。按所有给药方式的最
12、高剂量另设药物毒性对照组。实验同时滴定病毒LD50。治疗实验 本次实验感染流感病毒甲1(H1N1)亚型(FM1株)的方法同上。实验时化合物1c用5%吐温 80配成一系列浓度的悬液，采取灌胃和腹腔注射两种方式给药。灌胃剂量为、及/kg；腹腔注射剂量为/kg。感染当天在感染后2h内灌胃或腹腔注射给药1次，间隔4h再次给药，每日2次，共5d。其余操作均同上。判断指标及实验分组 (1)死亡率及平均生活日 预防+治疗实验组每组10只小鼠，共6组/kg，/kg，/kg，RBV，病毒对照(5%的吐温 80)，正常对照。每日观察并记录每组死亡只数，共2周，用2检验比较死亡率，用Kaplan Meier法分析平
13、均生活日。 治疗实验组每组10只小鼠，共7组/kg，/kg，/kg，/kg(腹腔注射)，RBV，病毒对照(5%的吐温 80)，正常对照。每日观察并记录每组死亡只数，共2周，同法统计死亡率和平均生活日。 (2)肺病变、肺指数 预防+治疗实验组每组8只小鼠，共6组/kg，/kg，/kg，RBV，病毒对照(5%的吐温 80)，正常对照。感染后第4晚小鼠禁食，次日(即感染后5d)分组处死小鼠，取出鼠肺，肉眼判断肺病变程度。0表示无肺病变，14为每级递增25%的肺病变。每只小鼠称体重(g)和肺重(g)，计算每只小鼠的肺指数(肺指数=肺重/鼠重)，用t检验分析法比较肺指数，用Ridit分析法比较肺病变。
14、治疗实验组每组8只小鼠，共7组/kg，/kg，/kg和/kg(腹腔注射)，RBV，病毒对照(5%的吐温 80)，正常对照。实验操作、判断指标的计算以及统计分析的方法同上。 (3)鼠肺TCID50滴定 预防+治疗实验组每组20只小鼠，3组/kg，RBV，病毒对照(5%的吐温 80)。在感染后d1、d2和d4分别从每组中取5只小鼠解剖，无菌取肺，在低温和无菌条件下分别按每个鼠肺加入10倍体积的细胞维持液，乳钵研磨，获得匀浆，冷冻离心，转速10000r/min。离心后取上清，得到鼠肺的10-1液，再以细胞维持液作10倍稀释，分别获得每个鼠肺的10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7
15、、10-8、10-9和10-10液。在MDCK细胞中滴定上述鼠肺悬液的TCID50值，计算每组鼠肺每日平均TCID50值，作出曲线图。 治疗实验组每组20只小鼠，4组/kg，/kg(腹腔注射)，RBV，病毒对照(5%的吐温 80)。实验操作、判断指标的计算以及统计分析的方法同上。 (4)LD50测定 两种给药方案操作相同，均为每组5只小鼠，共5组(10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)，每日观察，记录各组死亡只数，并用Reed Muench法计算半数致死浓度LD50。 2 结果 化合物1c的细胞毒性及体外抑制流感病毒实验 化合物1c在MDCK细胞中抗流感病毒A型和流感病毒B型的活性
16、以及对MDCK细胞的毒性结果见表1，阳性对照药为扎那米韦。 表1数值显示化合物1c对流感病毒A型、流感病毒B型不同株的抑制活性差别较大，扎那米韦也显示同样情况；1c对流感病毒A型的抑制活性虽不及扎那米韦，但对流感病毒B型的抑制活性明显高于扎那米韦。化合物1c以及扎那米韦对MDCK细胞的毒性测试结果为：化合物1c的CC50值大于mol/L，扎那米韦的CC50值大于104mol/L。 化合物1c体内抗流感病毒活性实验 结果见表2。 (1)预防+治疗给药方案 表2数据显示，/kg组的4项判断指标与病毒对照组相比均有统计学意义；和/kg组与病毒对照组相比均显示疗效，在平均生活日指标上有统计意义的差别。
17、 (2)治疗给药方案 本次实验除感染方案不同外，还增加了1c的剂量，观察小鼠对1c的耐受情况，并增加一组1c的腹腔给药，与灌胃给药组在同等剂量下，观察疗效有无差别。表2结果显示1c灌胃各剂量组各指标间呈量效关系，同为/kg，腹腔注射组的疗效优于灌胃给药组，其疗效相当于/kg灌胃组，在肺病变及肺指数两项指标上甚至优于/kg灌胃组。小鼠对/kg药量耐受良好，在实验期间，药物毒性对照组体重增长情况与正常对照组相似，未见毒性反应(具体数据未列出)。 图2列出治疗给药方案各组的肺病变照片；预防+治疗给药方案各组肺病变照片结果相似，未列出。 (3)治疗给药方案中鼠肺病毒分离情况 图3显示治疗给药方案各组/
18、kg，/kg(腹腔注射)， RBV及病毒对照组的鼠肺病毒分离及毒力图2 治疗实验中各组肺病变图图3 小鼠肺内流感病毒滴度曲线测定(TCID50)结果。感染后d1，4组鼠肺TCID50相近，d2各组之间病毒TCID50分别为/ml、/ml、/ml以及/ml；d4病毒TCID50分别/ml、/ml、/ml及/ml。1c腹腔注射组病毒滴度降低比灌胃组更明显，与其它指标相一致，RBV降低病毒滴度最明显。 预防+治疗方案各组(/kg，RBV及病毒对照组)的鼠肺病毒分离及毒力测定TCID50结果与治疗方案组相似，未列出。 3 讨论 对化合物1c进行的体内、外抗流感病毒活性研究结果显示，1c具有广谱抗流感病
19、毒活性，且作用机制与金刚烷胺类抗病毒药物不同。体外实验中，1c对流感病毒A型各株的抑制活性虽不如扎那米韦，但1c对流感病毒B型的抑制活性明显优于扎那米韦。在流感流行，病原诊断不明确时，1c有优势。在感染了流感病毒甲1(H1N1)亚型(FM1株)的小鼠模型中，两种给药方案均显示可重复的疗效，并有量效关系。体内实验结果表明1c腹腔注射途径，药物吸收较灌胃佳。由于1c可口服或注射给药，而扎那米韦仅能局部喷药，并需特殊给药装置，所以1c有一定的实用前景。原设计将oseltamivir作为阳性对照药，比较1c与oseltamivir在动物实验中的疗效，但遗憾的是暂时无法获得oseltamivir，我们正
20、在积极寻求，以期解决上述 表2 化合物1c体内抗流感病毒甲1(H1N1)亚型小鼠感染作用治疗方案及 感染病毒量*：； *：。问题。 对1c抗流感病毒的作用机制研究，我们曾初步测定1c抗流感病毒A型粤防243/72株NA活性，发现1c对NA的IC50为/L，活性明显低于扎那米韦/L。文献报道扎那米韦对流感病毒A型不同株NA的IC50值分布范围较广，为/L16，17。有关1c的作用机制需要进一步研究。1c为我国自行研发的全新化合物，有专利保护。鉴于1c体内、外抗流感病毒的活性，有开发为抗流感病毒药物的潜能。 致谢：感谢本研究室董飚硕士及章天主管技师对本工作的协助与支持。 【参考文献】 1 于淑娟.
21、 国内外抗流感药物开发应用新进展J. 黑龙江医药，2006，19(2)：133134. 2 恭晓明，许激扬，丁玉林. 抗流感病毒新药 神经氨酸酶抑制剂J. 药学进展，2002，26(5)：266270.3 李卓荣，刘宗英，汤雁波. 抗流感病毒的研究进展J. 国外医药抗生素分册，2002，23(4)：151154.4 刘颂，王京燕. 抗流感病毒药物研究的进展J. 国外医学药学分册，2005，32(2)：1111155 Chand P, Kotian P L, Dehghani A, et al. Systematic structure based design and stereoselect
22、ive synthesis of novel multisubstituted cyclopentane derivatives with potent antiinfluenza activity J. J Med Chem,2001,44(25):43794392.6 Wang G T, Chen Y, Wang S, et al. Design, synthesis, and structural analysis of influenza neuraminidase inhibitors containing pyrrolidine cores J. J Med Chem,2001,4
23、4(8):11921201.7 Mendel D B, Tai C Y, Escarpe P A, et al. Oral administration of a prodrug of the influenza virus neuraminidase inhibitor GS 4071 protects mice and ferrets against influ enza infection J. Antimicrob Agents Chemother,1998,42(3):640646.8 McKimm Breschkin J L. Neuraminidase inhibitors fo
24、r the treatment and prevention of influenza J. Exp Opin Pharmacother,2002,3(2):103112.9 Hanessian S, Wang J, Montgomery D, et al. Design, synthesis, and neuraminidase inhibitory activity of GS 4071 analogues that utilize a novel hydrophobic paradigm J. Bioorg Med Chem Lett,2002,12(23):34253429.10 St
25、oll V, Stewart K D, Maring C J, et al. Influenza neuraminidase inhibitors: structure based design of a novel inhibitor series J. Biochemistry,2003,3(7):718727.11 Yi X, Guo Z R, Chu F M. Study on molecular mechanism and 3D QSAR of influenza neuraminidase inhibitors J. Bioorg Med Chem,2003,11(6428):14
26、651474.12 Von Itzstein M, Wu W Y, Kok G B, et al. Rational design of potent sialidase based inhibitors of influenza virus replication J. Nature,1993,363:418423.13 Masuda T, Shibuya S, Arai M, et al. Synthesis and anti influenza evaluation of orally active bicyclic ether derivatives related to zanami
27、vir J. Bioorg Med Chem Lett,2003,13(4):669673.14 Honda T, Masuda T, Yoshida S, et al. Synthesis and anti influenza virus activity of 7 O alkylated derivatives related to zanamivir J. Bioorg Med Chem Lett,2002,12(15):19251928.15 Honda T, Masuda T, Yoshida S, et al. Synthesis and anti influenza virus
28、activity of 4 guanidino 7 substituted Neu5Ac2en derivatives J. Bioorg Med Chem Lett,2002,12(15):19211924.16 Hurt A C, Barr I G, Hartel G, et al. Susceptibility of human influenza viruses from Australasia and South East Asia to the neuraminidase inhibitors zanamivir and oseltamivir J. Antiviral Res,2004,62(1):3745.17 Munqall B A, Xu X, Klimov A. Surveillance of influenza isolates for susceptibility to neuraminidase inhibitors during the 20002002 influenza seasons J. Virus Res,2004,103(2):195197.
