1、主管检验技师考试临床医学检验微生物检验讲义第10章细菌的生物化学试验细菌的生物化学试验 考点碳水化合物的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验碳源和氮源利用试验各种酶类试验抑菌试验复合生化试验【内容讲解】不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。一、碳水化合物的代谢试验原理：由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。1.糖（醇、苷）类发酵试验原理
2、：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力不同，分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。培养基：在培养基中加入0.5%1%的糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇、肌醇等）、苷类（水杨苷等）。方法：接种，培养。结果：产酸：培养基中的指示剂呈酸性反应。产气：可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。不分解：培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。2.氧化-发酵试验（0/F试验）原理：氧化型：仅在有氧环境中分解葡萄糖发酵型：在有氧或
3、无氧环境中都能分解葡萄糖产碱型：在有氧或无氧环境中都不能分解葡萄糖培养基：HL（Hugh-Leifson）培养基方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。将培养基于35培养48h或更长。结果： 开管封闭管产碱型-氧化型+-发酵型+3.-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）原理：试剂：0.75M ONPG溶液方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37水浴5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20min3h观察结果。结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在
4、2030min内显色。应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。4.七叶苷水解试验原理：培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。5.甲基红试验原理：培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养24d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。应用：肠杆菌科：沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属（+）肠杆菌
5、属、哈夫尼亚菌属（-）。6.V-P试验原理：培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基方 法：将待检菌接种于上述培养基中，于35培养48h后加入甲液（6%-萘酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液），振摇。结 果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于354h后仍如故者即为阴性。应 用：本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。二、蛋白质和氨基酸的代谢试验原理：不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。细菌对蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。1.明胶液化试验原理：方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22培养7
6、d，逐日观察结果。若用35孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察结果前，先置4冰箱内30min，再看结果。结果：培养基呈液化状态为阳性应用：肠杆菌科细菌的鉴别：沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。多数假单胞菌也能液化明胶。2.吲哚（靛基质）试验原理：培养基：蛋白胨水培养基方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35培养2448h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。3.硫化氢试验原理：培养基：醋酸铅培养基方法：将待检菌穿刺接种于醋
7、酸铅培养基，于35培养2448h观察结果。结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。4.尿素分解试验原理：培养基：尿素培养基方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35培养1824h观察结果。结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性。另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。5.苯丙氨酸脱氨酶试验原理：培养基：苯丙氨酸琼脂培
8、养基方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35培养1824h，滴加10%三氯化铁试剂34滴，自斜面上方流下。结果：应立即观察结果，出现绿色为阳性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。6.氨基酸脱羧酶试验原理：培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油，于35培养14d，每日观察结果。结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余
9、沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。三、碳源和氮源利用试验细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验。1.枸橼酸盐利用试验原理：培养基：枸橼酸盐培养基方法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35培养14d，每日观察结果。结果：由淡绿色变为深蓝色为阳性；不能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌，在此培养基上不能生长，培养基则不变色，为阴性。应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常为阳性。2.丙二酸盐利用试验原理：培养基：丙二酸盐培养基方法：将被检菌接种于培养基，35培养2448h后观
10、察结果。结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。应用：肠杆菌科中属间及种的鉴别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属均为阴性。四、各种酶类试验（一）呼吸酶类试验1.氧化酶试验原理：试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺。方法：1）菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。2）滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。3）试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。为保证结果的准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。2.过氧化氢酶试验
11、（触酶试验）原理：试剂：3%过氧化氢溶液方法：取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加3%过氧化氢数滴；或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。应用：故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。3.硝酸盐还原试验原理：培养基：硝酸盐培养基试剂：甲液（对氨基苯磺酸）；乙液（-萘胺）方法：被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35培养14d。将甲、乙液等量混合后（约0.1m1）加入培养基内，立即观察结果。结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有被还原，试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管
12、内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。应用：肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。4.脂酶试验原理：培养基：脂酶培养基（含维多利亚蓝）方法：将被检菌接种于上述培养基中，于37培养24h。结果：培养基变为蓝色为阳性，阴性为粉红色或无色。应用：主要用于厌氧菌的鉴别。类杆菌属中的中间类杆菌产生脂酶，其他类杆菌则阴性；芽胞梭菌属中产气芽胞梭菌、肉毒梭菌和诺维梭菌为阳性，而其他梭菌阴性。5.卵磷脂酶试验原理：培养基：1%卵黄琼脂平板方法：将被检菌划线接种于卵黄琼脂平板上，3
13、5培养36h。结果：若3h后在菌落周围形成乳白色混浊环，即为阳性，6h后混浊环可扩展至56mm。应用：主要用于厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌、诺维梭菌产生此酶，其他梭菌为阴性。6.DNA酶试验原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解成寡核苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸链则溶于酸，所以当在菌落平板上加入酸后，会在菌落周围出现透明环。培养基：0.2%DNA琼脂平板。方法：将被检菌点种于上述平板上，于35培养1824h，然后用1mol/L盐酸覆盖平板，观察结果。结果：在菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。应用：在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶；在肠杆菌科中沙雷菌和变
14、形杆菌产生此酶。7.凝固酶试验原理：方法：1）玻片法：取兔血浆和盐水各一滴，分别置于洁净的玻片上，挑取被检菌分别与血浆和盐水混合。2）试管法：取试管2支，各加0.5ml人或兔血浆，挑取被检菌和阳性对照菌分别加入血浆中并混匀，于37水浴34h。结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆凝固判为阳性。应用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。8.CAMP试验原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的-溶血素溶解红细胞的活性，因此在两菌（B群链球菌和葡萄球菌）的交界处溶血力增加，出现矢形（半月形）的溶血区。培养基：血琼脂平板
15、方法：先以产-溶血素的金黄色葡萄球菌划一横线接种于血琼脂平板上，再将被检菌与前一划线作垂直划线接种，两线不能相交，相距0.51cm，于37培养1824h，观察结果。结果：在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。应用：在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定。9.胆汁溶菌试验原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是由于胆汁降低细胞膜表面的张力，使细胞膜破损或使菌体裂解；或者是由于胆汁加速了肺炎链球菌本身自溶过程，促使细菌发生自溶。试剂：10%去氧胆酸钠方法：1）平板法：取10%去氧胆酸钠溶液一接种环，滴加于被测菌的菌落上，置3530min后观察结果。2）试管法：被检菌培养物
16、2支，各0.9ml，分别加入10%去氧胆酸钠溶液和生理盐水（对照管）0.1ml，摇匀后置35水浴1030min，观察结果。结果：平板法以“菌落消失”判为阳性；试管法以“加胆盐的培养物变透明，而对照管仍混浊”判为阳性。应用：五、抑菌试验1.O/129抑菌试验原理：0129（二氨基喋啶）对弧菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌属细菌无抑制作用。培养基：碱性琼脂平板。方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取0129纸片（含药40g）贴于平板上，35培养1824h观察结果。结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药。应用：用于弧菌科的属间鉴别。2.杆菌肽试验原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他群链
17、球菌绝大多数对其耐药。培养基：血琼脂平板。方法：将待检菌纯培养物（肉汤）均匀涂布于血液琼脂平板上，稍于后贴上0.04U片的杆菌肽纸片，35培养1824h观察结果。结果：抑菌环直径1Omm为敏感，抑菌环直径1Omm为耐药。应用：用于A群链球菌与非A群链球菌的鉴别。3.奥普托欣（Optochin）试验原理：几乎所有肺炎链球菌对奥普托欣试验敏感，而奥普托欣试验对其他链球菌则无抑制作用。培养基：血琼脂平板。方法：将待检菌菌落或肉汤培养液均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴上含5g/片的Optochin纸片， 35培养1824h观察结果。结果：抑菌环直径：14mm为敏感，若抑菌环直径14mm，对此菌株应再做
18、胆汁溶菌试验，以证实是否为肺炎链球菌。应用：主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。【例题】可分解七叶苷的细菌是A.肺炎链球菌B.A群链球菌C.B群链球菌D.C群链球菌E.D群链球菌 答疑编号502389100101【正确答案】E【例题】属于细菌蛋白质和氨基酸代谢试验的有A.吲哚试验B.七叶苷水解试验C.甲基红试验D.明胶液化试验E.硫化氢试验 答疑编号502389100102【正确答案】ADE【例题】属于细菌呼吸酶类试验的有A.细胞色素氧化酶试验B.过氧化氢酶试验C.硝酸盐还原试验D.氰化钾试验E.凝固酶试验 答疑编号502389100103【正确答案】ABC【例题】大肠埃希菌的靛基质试验阳性，请问靛基质是细菌分解什么物质产生的A.葡萄糖B.尿素C.色氨酸D.半胱氨酸E.枸橼酸盐 答疑编号502389100104【正确答案】C本章小结：一、细菌生物化学试验的类型碳水化合物的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验碳源和氮源利用试验各种酶类试验抑菌试验复合生化试验二、生物化学试验的原理及应用三、生物化学试验的培养基、方法和结果观察
