1、superdex 75 翻译版Superdex 75 Superdex 200 前言Superdex 75 10/300 GL和 Superdex 200 10/300 GL均是 Tricorn 高效柱。该柱子是用于高效过滤分离蛋白、多肽、小于200bp的DNA片段及其他生物分子的预包装玻璃柱子。该柱子有两个手拧接头1/16，一个用于接AKTAdesign系统，与一个1/16 female/M6 male一起接FPLCTM系统。柱子相关数据基底柱床尺寸柱床体积柱效率（N/M）平均粒度通常使用时pH稳定范围清洗时pH稳定范围工作时温度储藏温度复合交联琼脂糖和右旋糖酐 10 300310 mm大约
2、24ml30 000 m -113um3-121-144-404-30Superdex 75 Superdex 200球状蛋白的排阻极限 约为1105 约为1.3106球状蛋白最佳分离范围 3000-70000 10000600000 右旋糖酐（葡聚糖） 50030000 1000100000推荐最大流速（水，室温下） 1.5ml/min 1ml/min柱内最大压力 1.8Mpa，18bar，261psi 1.5MPa,15 bar,218 psi初次使用图一 展示如何锁接头器。黑色的锁环必须在下防止柱床高度的改变。将柱子连接柱层分析仪之前，要确保管道与阀门处没有气泡。将注资上的储存/输送装置
3、及止塞移除。检查上方的接头器是否锁上（将锁环压下去，见图一）。确认柱子的进口已经注满液体，并且一级级接入系统。平衡后第一次使用或长期存储柱子如下操作：a）至少用50ml蒸馏水在0.5ml/min的速度下清洗 50ml洗脱液在0.5ml/min流速下洗涤确保其回压不超过推荐的最大压力值。先以以下条件试一下洗脱液 50mM磷酸缓冲液（PBS） 0.15M Nacl，pH 7.0流速 室温下，0.5-0.75ml/min样品体积 25ul在同样的洗脱缓冲液中就没必要平衡了，认真阅读“优化”这一部分了解如何优化蛋白分离。 缓冲液与耐溶剂在喷射阀前安装一个滤器。如果缓冲液与溶剂有增强粘性，那会影响负压与
4、流速。所有的溶剂全都要经过脱气与0.22um滤器过滤。日常使用所有常用缓冲液，pH均在3-12之间尿素 8M乙腈 达到缓冲液的30%离子型和非离子型洗涤液盐酸胍 6M三氟乙酸 10%甲酸 70%洗涤液 乙腈 30% 氢氧化钠 1M 乙醇 70% 甲醇 100% 乙酸 1M 异丙醇 30% 盐酸 0.1M禁止：氧化物剂 未过滤溶液建议样品状态分子量 3000-70000 （75） 10000-600000（100） 蛋白浓度 样品中蛋白10mg样品体积 25-500ul准备 将样品溶解于洗脱液，用0.22um的旅途过滤除菌或10000g离心10min。深入信息运输/储存柱子有一个储存/运输装置来
5、保证柱内压，同时防止柱子干掉。柱子用脱气的20%的乙醇平衡。如果柱子后后需要储存2天之上，用2倍柱体积的蒸馏水洗涤，后用制定好2倍柱体积的20%乙醇洗涤。在此提醒要按图一将储存/ 运输装置连接好以便长期储存。玻璃管用一塑料保护膜套起来，会有少量空气存留在玻璃跟塑料保护膜之间。如何除去其存储/运输设备 （见右图）（1）按下弹簧帽（2）移去锁定栓（3）松开帽，把装置拧开如何重装该装置(见右图)(1)在储存或运输装置上接一个注射器或泵，并且往里注入20%的乙醇，超过管子上的刻度线即可。把注射器或泵移除。(2)赶净气泡后，将柱塞压到柱上的刻度线处。如何连接储存/运输设备（见右图）（1）在柱子的进出口接
6、头处注入20%的乙醇，将装好的装置逐级连接在柱子顶部。（2-3）附上弹簧帽，用锁栓固定洗脱液的选择选择一种保证样品完全溶解的洗脱液。也尽量选择一个能简化下游应用程序的洗脱液。例如，若蛋白或多肽是冻干的，则需要挥发性洗脱液。低盐浓度下，基于依赖于pH7.0，酸、碱性蛋白会相互反应，此时推荐使用50mM 磷酸钠 0.15M氯化钠 pH7.0的缓冲液。表一列出了一些常用的洗脱液组分。表一 常用洗脱液组分pH洗脱液液或缓冲液特性/应用实例5.00.1M醋酸铵能很好地溶解一些酶，如纤维素酶，其不稳定7.20.05M磷酸盐+0.15M氯化钠生理状态7.80.15M碳酸氢铵适用于分离DNA与蛋白；不稳定，需
7、要现配现用8.00.1M Tris-Hcl，1MmEDTADNA、 RNA极易溶解8.66M盐酸胍，50mMTris-Hcl适合在非自然状态下纯化蛋白11.50.05M氢氧化钠较好的溶解复合物缓冲液添加剂在适宜缓冲液中添加30%乙腈 用于分离疏水性聚合物，易挥发8M尿素（pH7） 能溶解大部分聚合物，低尿素浓度下可保持生物活性，对蛋白的氨甲酰化有影响。6M盐酸胍 决定亚基的分子量0.1%SDS，Tween或类似物 溶解一些蛋白，例如膜蛋白 确保与去垢剂彻底平衡过最优化参照“先以以下条件试一下”部分的描述运行第一次。如果结果不满意的话，请考虑以下：操作 效果增加流速 提高高分子量组分的分辨率；小
8、分子组分的分辨率可能会下降增加样品体积 提高分辨率改变有机溶剂的浓度 改变专一性一次性连两个柱子 由于增加了柱床高度因而提高了分辨率，确保Superdex 75的总柱压低于3Mpa，Superdex 200的总柱低于2.5Mpa更多信息参见“凝胶过滤，原则/方法”使用手册在线清洗（CIP）在10-20个分离循环后按如下循环进行常规清洗。常规清洗：1、用25ml 0.5M的NaoH或者0.5M的乙酸以0.5ml/min的流速清洗柱子；2、接着用25ml蒸馏水洗柱子，然后至少用50ml洗脱液以0.5ml/min的速度清洗。下次使用之前要平衡柱子直至紫外与pH稳定。精密清洗1、更换柱子上的过滤器（因
9、为液体流过时会有杂质被滤器拦截）换过滤器的说明参照过滤器说明。按上述步骤进行常规清洗。根据杂质的特点，前页上的一种洗涤液可能会用到。任何一种清洗方案完成后一般都要用至少两倍柱体积的蒸馏水清洗。如果柱效还没恢复，那么注射含有0.1mg/ml胃蛋白酶，0.1M醋酸，0.5M氯化钠的溶液室温下过夜或者371h。酶处理完之后按“常规清洗”部分描述的步骤清洗柱子。有必要的话可以将柱床顶部2-3mm柱料重悬并用巴斯德管移出。调整适配器将胶上方的空隙消除。检修 状况 对策柱压过高或分辨率太低 确定柱子是这个原因（见下）。如果是这样的话按精密清洗步骤洗柱子。确定系统内的高负压是由柱子某一时刻在样品收集器处有一
10、部分未与运行的泵相连。一次断开每一处与泵的连接，读取相应的压力值从而确定负压是哪造成的。柱中有气泡 将80-100ml脱气的洗脱液 0.5ml/min的速度过柱子。注意少量空气不会影响柱子的性能。柱子性能的控制用以下步骤来检验柱子的性能样品： 100ul0.5%丙酮（5mg/ml）洗脱液： 缓冲液或蒸馏水流速： 0.75ml/min，室温检测： 280nm柱效，用每米的理论塔板数表示，N/m，如下公式计算：N/m=5.54 (vr / w1/2)2 (1000/L)N/m=理论塔板数/米Vr=洗脱峰的距离（米）W1/2=半峰高峰宽（米）L=柱床高度（米）除了上述检修方法外，还可以按图2、3描述
11、的运行功能测试来检测柱效。图2 Superdex 75 10/300 GL功能测试的典型色谱图图3 Superdex 200 10/300 GL.功能测试的典型色谱图注：峰5、6单纯因形状不同而区分Superdex 75 10/300 柱样品： 1、 BSA（M 67000），8mg/ml2、卵清蛋白（M 433000），2.5mg/ml3、核糖核酸酶A（M 13700）5mg/ml4、抑肽酶（M 6512）2mg/ml5、维生素B12（M 1355）0.1mg/ml 样品体积： 500ul洗脱液： 0.05M 磷酸缓冲液，0.15M氯化钠，pH 7.0 流速： 0.4ml/min,室温检测：
12、 280nmColumn Superdex 200 10/300柱样品： 1、甲状腺球蛋白（M,669000）5mg/ml2、铁蛋白（M，440000）0.4mg/ml 3、BSA（M，67000）8mg/ml 4、-乳球蛋白（M,35000）2.5mg/ml 5、核糖核酸酶A (M ，13 700) 5 mg/ml 6、细胞色素C (M，13 600) 1.5 mg/ml 7、抑肽酶(Mr 6 512) 2 mg/ml 8、维生素B12 (Mr 1 355) 0.1 mg/ml样品体积： 500ul洗脱液： 0.05M 磷酸缓冲液 0.15氯化钠，pH7.0流速： 0.4ml/min,室温检测：280nm
