1、申报国家自然科学基金项目申请书样板最新范本模板申报国家自然科学基金项目申请书样板各位申请人: 院科教部从我院申报国家自然科学基金项目中挑选了一份严格按照报告正文撰写提纲要求撰写并在撰写的整体布局、写作方法上比较适宜的申请书作为样板申请书提供给其他申请人在撰写申请书时参考。 注:考虑到本项目也将申请国家自然科学基金从技术保密方面考虑涉及核心技术和关键问题之处将以“XXXXXXX代替。 报告正文 ，一,立项依据与研究内容 1立项依据 肝纤维化是严重威胁人类健康的重要疾病之一迄今没有满意的治疗方法。目前国内外绝大多数学者认为肝星状细胞，hepatic stellate cellHSC，1激活是肝纤维
2、化的关键抑制HSC的激活对肝纤维化的防治有重要价值。 粉防己碱，tetrandrine又名汉防己甲素,是中药粉防己,Stephania tetrandra S Moore，的主要有效生物碱成分具有广泛的药理作用。抗肝纤维化是Tet的重要应用领域之一。我们研究室在过去的十几年中对Tet抗肝纤维化作用及机制进行了系统研究证实Tet是抗肝纤维化有效药物.然而由于Tet的剂量安全范围较小以往研究发现的抗肝纤维化有效剂量与中毒剂量比较接近故成为限制其临床应用的重要因素。近年国内Tet抗肝纤维化研究也由此逐渐走向低谷.为减少毒副反应拓展该药物的临床应用我们近四年从降低Tet的单药剂量、联合用药及改造药物毒
3、性基团等方面进行实验性探索。新近我们在国内外首次发现低浓度Tet能上调转化生长因子,transforming growth factor factor TGF-，抑制性信号分子Smad 7表达调控TGFSmad信号通路抑制体外培养静止期HSC活化阻断TGF促静止期HSC活化效应Tet还诱导活化HSC活化逆转.部分最新1研究成果已经整理成文发表在本领域有一定影响力的SCI索引源期刊上并2被SCI收录（收录号 IDS Number: 963XN )，相关文章参详见申请人简历及附件二、三,。这些全新研究成果进一步增强了我们开发这一传统中药的信心. TGF-是目前认识的最重要的促肝纤维化因子.抑制TG
4、F对HSC的113作用一直以来均是抗肝纤维化重要着眼点。Smad 7是HSC TGF信号通路的最主要负反馈调节信号分子上调Smad 7是抑制TGF-对HSC不良生4物效应的有措施之一.在肝纤维化过程中TGF信号通路还与整合素信号通路存在密切联系。这表现在三个方面:?XXXXXX。？XXXXXX。?XXXXXXXXX。 综上所述XXXXXXX如能XXXXXX可进一步实现XXXXX治疗。 基于以上研究结果我们研究室在国家自然科学基金资助下过去三年中应用化学方法合成了RGD和M6P并将RGD与M6P结合成一新型复合分子RGDM6P研究比较了它们对HSC靶向性及在抑制其功能中的作用,项目名称:RGD修
5、饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究编号:30170412，。我们的研究发现RGD和RGD-M6P均可抑制HSC活化。RGD在抑制TGF-激活同时还可阻止HSC与ECM结合阻断整合素信号转导。研究还发现M6P能提高RGD作用于HSC的靶向性增加其局部浓度使14RGDM6P显示出较RGD更强的抑制作用.我们首次证实新型复合分子RGD-M6P用于抗肝纤维化治疗无论在对HSC靶向的特异性还是多位点联合作用方面都优于单一的含RGD序列的肽段或M6P，参见基金结题摘要相关文章参见申请人简历及附件四,。 RGD-M6P新型复合分子的研制成功及其对HSC靶向与抑制功能的发现有助于我们去研究更多的HSC
6、靶向选择性高、局部作用强、系统毒性小的新型药物和(或）制剂从而提高药物的疗效、减轻毒性反应。结合我们对Tet药理作用的分子机制的研究结果不难发现XXXXXXXX。基于以上系列研究基础与设想紧跟国内外在制剂学方面的进展我们拟设计XXXXXXXXXXX。 当前受体调节药物靶向,receptor-mediated drug targeting,作为一种新16型的给药系统受到人们的重视。XXXXXXXXXXXXXXXXX。 迄今为止尚未见到XXXXXXXXXXX。 结合国内外同行的研究报道与我们的研究基础不难推断XXXXXXXXXXXXXXXXX。 综上所述我们拟在XXXXXXXXXX。本研究将为XX
7、XXXXXX等提供理论与实践基础。XXXXXXXXXX可以设想如能取得预期效果经过良好设计的基础研究后这一XXXXXX应用于临床的时间不会太久前景广阔。 参考文献 1 Friedman SL. Mechanisms of disease: Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications。 Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2004;1(2)：98105. 2 Chen YW， Li DG, Wu JX, et al。 Tetrandrine inhibits activation o
8、f rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factorbeta in vitro via upregulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005;100(3):299-305。 3 Breitkopf K, Haas S, Wiercinska E， et al. AntiTGFbeta strategies for the treatment of chronic liver disease。 Alcohol Clin Exp Res 2005;29(11 Suppl):1
9、21S131S. 4 Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K， et al。 Smad7 prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats. Gastroenterology 2003;125(1):178-91。 5 Ludbrook SB, Barry ST， Delves CJ, et al。 The integrin alphavbeta3 is a receptor for the latency-associated peptides of transformi
10、ng growth factors beta1 and beta3. Biochem J 2003；369（Pt 2）:3118. 6 Annes JP, Chen Y, Munger JS, et al。 Integrin alphaVbeta6mediated activation of latent TGFbeta requires the latent TGF-beta binding protein-1。 J Cell Biol 2004;165（5):723-34。 7 XXXXXXXXXXXXXXXXX。 2 项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题 2.1研究内容: 2。2
11、.1 XXXXX化学合成与鉴定二硬脂酸磷酯酰胺XXXXXXXXXX 合成与鉴定。 2.2.2 不同类型脂质体的制备、技术参数优化、物理性质鉴定和脂质体药物包封率、载药量、配体结合率鉴定与提高。 2.2.3 大鼠HSC分离培养XXXXXXX 修饰脂质体与肝星状细胞体外结合活性研究。 2.2.4 XXXXX 修饰XXXXXXXXX 对肝星状细胞活化、增殖、XXXXXXX 信号通路影响. 2.2。5 XXXXXXXXX 的药代动力学特征、组织分布特征和XXXXXXX 研究。 2。2。6 XXXXXXXX 对胆总管结扎和CCl大鼠肝纤维化防治作用。 42。2研究目标： 2.2.1 研究构建XXXXXX
12、XX为抗肝纤维化药物新剂型开发提供新型靶向载体. 2.2.2 研究XXXXXX 对HSC生物活性影响及机制为中西药结合肝纤维化双靶向、多靶点、协同治疗提供理论基础. 2。2。3 研究XXXXXXXX 体内HSC靶向性及防治实验性肝纤维化的有效性为开发中药新剂型、提高药物在靶组织浓度、降低有效剂量、减轻副作用和提高疗效提供实践基础。 2.3 拟解决的关键问题： 2.3。1 高药物包封率、高配体修饰率的稳定XXXXXXXX 制备。 2。3。2 放射性计数法测定XXXXXX 与HSC结合活性有效抑制HSC活化的剂量、时间参数等。 2.3。3 XXXXXX 体内HSC靶向性、抗肝纤维化效果比较与评价。
13、 3 拟采取的研究方案及可行性分析 3.1 研究方案： 第一部分 XXXXX 及XXXXX 合成 （1) XXXXXX 合成及鉴定 采用我们研究室建立的方法化学合成XXXXXX。应用XXXXXXXXXX。合成反应图示如下。高效液相,HPLC,、质谱等方法鉴定合成产物纯度及分子量。 反应图,略， （2） XXXXXXXXXXX 采用一步法合成。XXXXXXXXXXXX。合成反应图示如下。高效液相,HPLC,和质谱分析法进物产物纯化与鉴定。 反应图,略， 第二部分 长循环脂质体制备、鉴定与技术条件优化（1) 脂质体制备 采用经我们改良的逆相蒸发法制备。具体方法如下:XXXXXXXXXX。 （2）
14、性质鉴定 XXXXXXXXXXXXXXXX。 (3) 均匀设计优化处方 根据实验结果及文献确定影响包封率的主要因素。以包封率为评价指标采用二项逐步回归计算回归方程并进行方差分析优化条件。 第三部分 XXXXX修饰长循环脂质体与HSC体外结合活性 采用两步胶原酶灌注和密度梯度离心法分离大鼠HSC选择静止态和激5/mL）。待贴壁后1胎牛血活态的HSC接种于6孔板上（细胞密度为5。010清DMEM培养过夜细胞同步化. (1）配体结合的浓度-效应关系 XXXXXXXXXXX。 (2) 配体结合的时间-效应关系 XXXXXXXXXXXX。 （3） 竞争抑制 XXXXXXXXXX. (4） 细胞荧光定位、
15、配体表面结合率与内吞率测定 XXXXXXXXXX。 （5） 平衡解离常数(Kd ）和细胞最大结合位点数(Bmax) XXXXXXXXXXX。 第四部分 XXXXXXX对HSC生物学特性影响与机制 采用酶法分离大鼠HSC.新鲜分离的HSC体外培养48 h后作为静止期HSC用于下游实验或培养1 w后消化传代继续培养24 h后作为活化的HSC用于下游实验。 (1） XXXXXXX对HSC活化状态影响 XXXXXXXXX。 （2)XXXXXX对TGF效应影响 1XXXXXXXXXXXX。 (3）XXXXXXXX 大鼠HSC TGF受体XXXXXXX 信号通路影响 XXXXXXXXXXXXXX. 第五部
16、分 XXXXXXXXXXXX (1） XXXXXXXX 在肝纤维化大鼠体内的器官分布 XXXXXXXXXX。 （2） XXXXXXX 大鼠体内药代动力学 采用XXXXXXXX。 （3）XXXXXXX 在肝纤维化大鼠肝脏内分布 采用XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。 第六部分 XXXXXXX防治大鼠肝纤维化 （1）造模 采用胆总管结扎和CCl肝纤维化两种动物模型。 4（2)分组及处理 XXXXXXXXXXXXXX. （3）治疗效果检测 主要比较以下指标:XXXXXXXXXXXXXXX。 3.2技术路线 技术路线图,略,。 3.3可行性分析 3.3。1 立项依据有坚实的理论与实践基础。本
17、研究是参阅大量文献并结合自身以往深厚的肝纤维化防治研究基础特别是结合近四年国家自然科学基金资助研究成果在XXXX 化学合成及功能研究、低剂量XXX抗肝纤维化作用和机制的前期工作基础上提出的多途径、互补协同与靶向治疗肝纤维化的新探索.掌握了国内外在受体调节药物靶向、低毒性高效中药新剂型开发和以HSC的靶标的肝纤维化靶向治疗中的最新研究动态借鉴“双靶向”干预的最新研究成果并与自身实践相结合在理论上、实践上均有可靠基础. 3.3.2 相关实验技术成熟，实验结果可信。本研究使用的实验方法、动物模型和生物分子化学合成等多为国内外应用多年的经典方法并有自身实践基础。本课题组由掌握以上技术的成员组成相关技术
18、已应用于科研工作。 3。3.3 人员配备合理，具有扎实的相关工作基础和完善的实验设备及技术支持。申请人长期从事肝纤维化防治研究先后承担包括国家自然基金在内的各类科研项目15项指导或协助指导博士后、博士生及硕士生70余名。近四年主持了国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究(编号30170412,”和“人卵泡抑素防治肝纤维化的实验研究(编号170411)”的研究工作项目组主要成员参与并完成以上研究工作。实验设30计指导者、熟练技术人员及辅助人员等各司其职可保障研究有条不紊的进行。新华医院消化内科系上海交通大学医学院,原上海第二医科大学,国家级重点学科和“211”工
19、程重点建设学科的组成单位之一长期从事肝纤维化防治研究先后承担包括国家自然科学基金在内的各级各类科研项目20余项。2005年7月原上海第二医科大学与原上海交通大学合并组建新的上海交通大学.作为上海交通大学的附属单位将在科研究设备和技术上更方便的得到比以往更广泛的支持。 4 本项目的特色与创新之处 4.1 本课题首次尝试利用XXXXXXX构建HSC特异性受体调节药物靶向载体。将新型配体人工化学合成、受体调节药物靶向技术与新型脂质体载药技术三者结合应用于肝纤维化防治有很强的原始创新性。 4。2 本课题首次研究XXXXX生物小分子通过XXXXX与中药粉防己碱相联合多途径、互补与协同防治肝纤维化。本课题
20、是利用分子机制指导中西药联合应用、构建中药靶向制剂提高疗效降低副作用和多途径协同作用抗肝纤维化的全新尝试是在总结自身工作基础上进行的大胆设想与创新。 5 年度研究计划及预期研究结果 5.1 年度研究计划:略 2007.01-2007.05 2007。06-2008.12 2008.01-2008.05 2008。062009.10 2008.11-2009。03 2009。04-2009.10 5.2 预期研究成果 5。2。1 获得快速、有效和大量合成XXXXXXX和高药物包封率、高配体修饰率的稳定XXXXXXXX的技参数并合成足量研究相关产物。 5.2。2 体外研究证实XXXXXXXX。 5
21、.2.3 在体内XXXXXXXXX有效降低有效剂量、提高疗效和降低副作用。 5。2.4 研究证实XXXXXXX可成为抗肝纤维化药物新剂型开发的有效载体。 ，二,研究基础与工作条件 1 研究基础 1。1既往肝纤维化防治理论和技术。自1981年以来我们研究室长期从事肝纤维化防治研究先后对钙拮抗剂、钙调蛋白拮抗剂、大黄素、激活素、肾素-血管紧张素系统及卵泡抑素等在肝纤维化发生发展中的作用进行了系列的研究积累了较丰富的理论掌握了相关研究技术。承担了包括国家自然科学基金在内的各类科研项目20多项先后获省部级以上科技进步奖10项。 1.2粉防己碱抗肝纤维化研究工作积累。项目负责人率先在我国开展钙拮抗剂尤其
22、是中药粉防己碱对肝纤维化防治研究取得丰富的粉防己碱抗肝纤维化基础和临床研究成果在国内外期刊发表相关论文50余篇获省部级以上科技进步奖5项。近两年我们在上海市教委基金项目“粉防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究（编号02BK14)资助下完成了小剂量粉防己碱抗肝纤维化效果与机制的研究在国内外首次报道小剂量粉防己碱可通过影响TGF-Smads信号通路抑制HSC活化相关研究论文被SCI收录（收录号 IDS Number： 963XN）。该研究为指导粉防己碱在肝纤维化防治中应用有重要价值。，参见申请人简历及附件二、三, 1。3生物小分子化学合成及脂质体构建相关工作基础。近四年来申请人承担并完成了国家自然
23、科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究（编号 30170412)”化学合成了RGDM6P分子克隆构建pCI-RGDSmad7并成功通过脂质体进行基因转染通过体内外实验观察了RGD-M6P和pCIRGD-Smad7的生物学效应.细胞及动物学实验均证实pCI-RGD-Smad7和RGD-M6P可减轻ECM沉积并影响TGF-和整合素表达1强度和分布。主要研究工作由本项目组成员参与并完成。目前我们正在利用基金很少量结余款项进行合成RGD-M6P修饰SSL的工作.得益于此他,她，们分别熟练掌握了生物小分子的化学合成相关技术,多肽合成、固相化反应、纳米技术、高效分离技术等,、免疫
24、组织与细胞化学技术、RTPCR和定量PCR、蛋白印迹、高效液相分析、质谱分析、肝纤维化动物模型及生物信息学方法等与本课题相关的关键技术与方法，相关论文参见申请人简历,.由于以上的工作基础我们拥有丰富的生物分子合成经验成熟的生物分子构建技术和良好的人员与设备支持。已经构建成功的RGDM6P及相关技术要领可直接用于本课题.构思本课题的重要原因之一是探讨解决简单单一药物治疗中发现的诸多问题而开展的密切相关的细胞学、动物学实验基础也是本实验成功的重要保证。 2 工作条件 2.1 新华医院消化内科设有校属的上海交通大学医学院消化系疾病第三研究室。实验室拥有本项目研究相关的大部分生化、细胞生物学及分子生物
25、学等方面的各种仪器设备如倒置显微镜摄影设备、计数仪、CO培养箱、酶联免2疫测定仪、电转膜仪、低温冰箱、低温超速离心机及其它分子生物学设备等. 2。2 上海交通大学医学院,原上海第二医科大学,附属新华医院科研中心与设立在新华医院的“211”工程重点建设单位上海市儿科医学研究所为本项目开展提供了仪器、技术支持和信息服务平台。我们可免费使用相关设备如层流无菌室、NICOMP Particle Sizer Model 3700分质谱仪、高效液相色谱仪、定量PCR仪析系统、流式细胞仪和FlousS MultiImage图像分析仪等新华医院和学院均有SPF级的动物饲养条件。 3 申请人简历 李定国男194
26、6年9月出生.主任医师、研究员、教授和博士生导师.1981年和1989年分别获原上海第二医科大学医学硕士和医学博士学位。现任上海交通大学医学院消化系疾病第三研究室主任、上海交通大学医学院附属新华医院消化内科主任.兼任上海市内科学会委员和上海市消化病学会委员等职。 本项目负责人长期从事肝纤维化防治研究在抗肝纤维化中药筛选与机制研究、生物小分子合成、脂质体药物传递和基因转染、基因重组及基因治疗等方面有丰富研究经验.率先在我国开展钙拮抗剂尤其是中药粉防己碱对肝纤维化防治研究取得丰富的粉防己碱抗肝纤维化基础和临床研究成果在国内外期刊发表相关论文50余篇。先后承担包括国家自然基金在内的各类科研项目15项
27、指导或协助指导博士后、博士生及硕士生70余名获省部级以上科技进步奖10项。近四年主持了国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究(编号30170412，”和“人卵泡抑素防治肝纤维化的实验研究(编号30170411)”的肝纤维化防治研究工作，以上2项目均已经顺利结题，指导完成上海市自然科学基金项目“Smad7和uPA双基因共表达对实验性肝纤维化的影响(编号03ZR14050)”和上海市教委基金项目“粉防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究,编号02BK14，”.近五年发表的与本课题相关论文，第一作者或通讯作者,其中一篇与本课题设计密切相关的重要论著2005年发表于SC
28、I索引源期刊“Journal of Ethnopharmacology并被SCI收录,收录号 IDS Number: 963XN）,见附件二、三，: 1 李定国, 陈颖伟。肝纤维化研究现状及展望。上海第二医科大学学报 2005,25(2):101-6。，述评, 2 Chen YW， Li DG, Wu JX, Chen YW, Lu HM。 Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via upregul
29、ation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005，100（3）：299305.，论著SCI收录号 IDS Number： 963XN， 3 Chen YW， Wu JX, Chen YW, Li DG， Lu HM。 Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factorbeta signaling。 World J Gastroenterol 2005，11(19）:2922-6. ，论著， 4 陈源文, 李定国， 吴
30、建新, 陈颖伟, 陆汉明.粉防己碱对大鼠肝星状细胞跨膜信号转导的影响.中华肝脏病杂志 2005,13（8）:609-10.，论著, 5 陈源文, 李定国， 吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱上调Smad7表达抑制大鼠肝星状细胞活化。中国药理学通报 2005，21（5)：5637。，论著, 6 王志荣， 陈锡美， 李定国, 魏红山， 黄新, 展玉涛, 汪余勤, 陆汉明.粉防己碱抑制肝纤维化大鼠肝组织c-fos和cjun mRNA表达。上海医学 2003,26(5）:332-6。,论著, 7 王志荣, 李定国， 陈锡美， 魏红山, 黄新, 展玉涛， 徐芹芳， 陆汉明.联合应用粉防己碱与甘草酸抗肝
31、纤维化的实验研究.中华消化杂志 2003,23(7）:435-6。，论著, 8 王连升， 陈颖伟, 张建华， 李定国, 陆汉明。RGDM6P对原代肝星状细胞的影响。上海第二医科大学学报 2005，25(2）：1125。，论著, 9 杜学亮， 陈颖伟, 王连升， 徐芹芳, 李定国, 吴真.人工合成RGD小肽对肝星状细胞付泌细胞外基质的影响。放射免疫学杂志 2004，17(6）:433-5.,论著, 10 程计林， 周欣, 高志刚, 霍玉青， 徐芹芳, 李定国。外源性转化生长因子1与小鼠肝细胞Smad7 mRNA及蛋白表达的关系。中华医学杂志 2002,82（2)：111-3。,论著, 11 陈源文, 吴建新, 李定国， 陆汉明。转化生长因子-与转基因治疗肝纤维化.中华消化杂志 2002，22（10):621-3。,综述, 12 程计林， 周欣, 李定国， 魏红山， 黄新， 王志荣, 展玉涛， 张晶, 徐芹芳, 陆汉明.RGDS肽对TGF刺激肝星状细胞分泌细胞外
