1、硕士学位论文排版硕士学位论文絮凝-离心-微滤技术处理大豆乳清制取蛋白及其性质的研究SEPARATION AND THE PROPERTIES OF WHEY PROTEIN FROM SOYBEAN BY FLOCCULATION-CENTRIFUGATION-MICROFI-LTRATION 高长永 哈尔滨工业大学 2011年6月国内图书分类号：Q512.1 学校代码：10213国际图书分类号：600 密级：公开 工学硕士学位论文絮凝-离心-微滤技术处理大豆乳清制取蛋白及其性质的研究硕士研究生：高长永导 师：张兰威 教授申请学位：工学硕士学科：食品科学所 在 单 位：食品科学与工程学院答 辩
2、 日 期：2011年6月25日授予学位单位：哈尔滨工业大学Classified Index: Q512.1 U.D.C: 600 Dissertation for the Master Degree in EngineeringSEPARATION AND THE PROPERTIES OF WHEY PROTEIN FROM SOYBEAN BY FLOCCULATION-CENTRIFUGATION-MICROFI-LTRATION Candidate：Changyong GaoSupervisor：Prof. Lanwei ZhangAcademic Degree Applied for
3、：Master of EngineeringSpeciality：Food ScienceAffiliation：School of Food Science and EngineeringDate of Defence：June，25th, 2011Degree-Conferring-Institution：Harbin Institute of Technology摘 要大豆乳清是生产大豆分离蛋白的废弃物，其生物化学需氧量和化学需氧量值是我国废水排放标准的10倍。每年我国排放的大豆乳清量约为2亿m3，这些乳清直接排放不仅造成资源的浪费，而且严重污染环境。本研究针对社会公益要求和生产企业需要
4、，对大豆乳清处理提取乳清蛋白的技术及其性质做了深入研究。大豆乳清的预处理实验研究表明，采用3000g，15min的离心方法预处理大豆乳清是行之有效的，可以获得成分稳定的乳清，其蛋白质含量为1.4310.090 g/L，灰分含量为4.000.07 g/L。絮凝-离心法沉降大豆乳清蛋白实验中，通过对比14种絮凝剂对乳清蛋白的絮凝率、絮凝组分的选择效果，选出了絮凝剂LT，它对蛋白质絮凝率为90%；以及可选择性絮凝脂肪氧化酶和-淀粉酶的絮凝剂LL。为了确定这两种絮凝剂的复配可行性，研究了复合絮凝剂LT-LL对乳清蛋白的絮凝效果，实验表明复配絮凝剂的蛋白絮凝率为50%左右，与絮凝剂LT的蛋白絮凝率相比显
5、著降低，故两者不具有复配性。对单一絮凝剂LT絮凝乳清蛋白的絮凝条件的单因素和正交实验研究表明，絮凝剂LT的最佳絮凝条件为：体系pH 3.0，絮凝剂添加量为2.5 g/L，体系温度为25。经3000g，15 min离心后，蛋白质去除率为93.86%。絮凝-微滤法分离浓缩乳清蛋白中，研究了11种絮凝剂对蛋白质凝集体粒径的影响，选出了絮凝剂LT和絮凝剂LX，它们分别将凝聚体粒度由109 nm提高至436和443 nm。絮凝剂LX絮凝条件的研究表明，其最佳的絮凝pH范围为7-8，与乳清原始pH 4.5显著差异。絮凝剂LT添加量与乳清蛋白凝聚体粒径提高程度的研究表明，最佳添加量为0.02 g/L，此时凝
6、聚体粒度为436 nm。絮凝蛋白的微滤实验结果表明，膜分离最佳工艺条件为体系温度控制在40-50之间，压力为0.2 MPa，操作时间控制在70 min以内时，膜可保持较高的膜渗透通量，较低的透过液蛋白质浓度的状态。此时的膜渗透通量为319.83 L/(m2h)，透过液蛋白质浓度为6.21 mg/L。最后，研究了絮凝-微滤分离的乳清蛋白的性质。实验结果表明，在pH 3附近溶解度较好，为8.6%。其热变性温度为84.74。灰分含量为86.010.52%。脱盐方法的研究表明：与超滤法相比，透析脱盐法更适合应用于大豆乳清蛋白的脱盐中。本研究的絮凝-离心法和絮凝-超滤法均能有效分离制取乳清蛋白，为大豆乳
7、清废液及其他废水的处理提供了一定的理论和方法依据。关键词：大豆乳清蛋白；絮凝；离心；微滤；性质 AbstractDuring the production of soy protein isolates, an industrial organic wastewater called “soy whey” also was generated. Its biochemical oxygen demand and chemical oxygen demand were 10 times more than the wastewater discharge standards. Every yea
8、r, about 200 million m3 soy whey was discharged in our country. If those whey is direct discharged, both of the resource-wasting and environmental pollution must be huge. Owing to the requirements of social and the needs of companies, sepration methods and the properties of whey protein from soy whe
9、y were studied. In this study, whey soy protein (WSP) was pretreated by the method of centrifugation. The optimum technological parameter was 3000g, 15min. The protein retained consistensy was 1.431 0.090 g/L, and the ash was 4.000.07 g/L.In the experiments of whey soy proteins flocculation, by exam
10、ed fourteen flocculants flocculation rates and flocculation selectivities, flocculant LT was selected as its effective ability. And its flocculation rate was 90%. The flocculant LL also was chose for its selective flocculation ability of lipoxygenase and -amylase. Then the experiments of coagulant L
11、T-LLs ablitity showed that the flocculation rate of compound flocculants was 50%. But it significant lower than flocculant LTs. The research in the flocculation conditions of flocculant LT with WSP showed that the optimum technological parameters were existed. The system pH was 3.0 and the temperatu
12、re was 25. LTs addition level was 2.5 g/L. By flocculation in this parametrs and centrifugation in 3000g,15min, the protein removal rate was 93.86%.In the research of separation and concentration of WSP by the method of flocculation-microfiltration, eleven flocculants ability in increasing the size
13、of protein aggregates were studied. According to the results and the availability in membrane, flocculant LT and flocculant LX were selected. Both of them can increase the size form 109 nm to 436 and 443 nm . Through the experiment in LX, its the best flocculation pH range of 7-8 was found. Consider
14、ing soy wheys pH was 4.5, it was not chose as a suitable flocculant. After the research of the relationship between flocculant LT dosage and protein particle size, The optimum dosage was 0.02 g/L. In the followed membrane process, the optimum technological parameter was system temperature 40-50, pre
15、ss 0.2 MPa, and in 70 min, the membrane maintained a high flux, low protein concentration of the permeate. At this point the membrane flux was 319.83 L/(m2h)and the protein concentration was 6.21 mg/L.In study of WSP gathered by the method of flocculation- microfiltration, experimental results showe
16、d that WSP optimum solubility pH is 3, and the solubility was 8.6%; protein thermal denaturation temperature was 84.75; and the ash was 86.010.52%. In the followed research, we tested the desalination effects of two kinds of desalination methods. The results were that dialysis was more suitable than
17、 ultrafiltration for desalination.By doing this study, two methods of flocculation-centrifugation and flocculation-microfiltration were got. They can efficiently separate whey soy protein from the waste. And this study can provide a certain amount of theoretical and methodologiccal basis for the tre
18、atments of soy whey and other waster water too.Keywords: WSP; flocculation; centrifugation; microfiltration; properties 目 录摘 要 IAbstract III目 录 V第1章 绪 论 11.1 课题背景及研究的目的和意义 11.2 大豆乳清及乳清中的蛋白质 21.2.1 大豆乳清中的主要活性成分 21.2.2 大豆乳清蛋白 31. 3 絮凝法回收蛋白质的研究进展 61.4膜分离技术概述 71.4.1 膜分离技术简介 71.4.2 膜分离的原理 71.4.3 膜污染的流体动力
19、学研究 81.4.4 利用膜技术回收蛋白研究进展 91.5 蛋白质脱盐方法的研究进展 101.6 本论文的研究内容 11第2章 材料与方法 122.1 实验材料 122.1.1 主要试剂 122.1.2 主要仪器设备 132.1.3 实验原料 142.2 实验方法 142.2.1 蛋白质浓度的测定 142.2.2 灰分含量的测定 162.2.3 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 172.2.4 大豆乳清蛋白的粒度测定 172.2.5膜实验 172.2.6 大豆乳清蛋白性质的测定及脱盐方法的研究 18第3章 大豆乳清的预处理研究 203.1 引言 203.2 大豆乳清预处理条件的研究 203.
20、3预处理后主要物质含量的测定 213.3.1总蛋白质含量的测定 213.3.2灰分的测定 223.4 本章小结 22第4章 大豆乳清蛋白的絮凝-离心分离研究 234.1 引言 234.2 絮凝剂的选择 234.3影响絮凝剂LT絮凝效果的单因素研究 284.3.1 pH对絮凝效果的影响 284.3.2温度对絮凝效果的影响 294.3.3添加量对絮凝效果的影响 294.4 絮凝剂LT絮凝最佳工艺条件的确定 304.5 本章小结 32第5章 大豆乳清蛋白的絮凝-微滤研究 335.1 引言 335.2絮凝剂的选择 335.2 絮凝剂的絮凝条件研究 355.2.1 絮凝剂LT絮凝条件研究 355.2.2
21、 絮凝剂LX预絮凝条件研究 365.3 截留浓缩大豆乳清蛋白的微滤实验研究 375.3.1 微滤膜的选择 375.3.2 新膜初始水通量的测定 385.3.3 料液温度、连续工作时间对渗透通量和透过液蛋白质浓度的影响 385.4 本章小结 39第6章 大豆乳清蛋白的性质测定及脱盐方法研究 416.1 引言 416.2 大豆乳清蛋白的溶解度 416.3 大豆乳清蛋白的热稳定性 426.3 大豆乳清蛋白的灰分含量 426.4 大豆乳清蛋白的脱盐方法研究 436.5 本章小结 44结 论 45参考文献 46附录 51哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明 52哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书 52
22、致 谢 53第1章 绪 论1.1 课题背景及研究的目的和意义大豆在我国不但种植广泛，并且用于生产豆腐、豆豉、豆皮等食品的历史至今已有两千多年。近些年，我国科学技术得到了迅猛的发展，人们对饮食与健康之间的关系的认识也随之加深。对大豆成分的研究表明，大豆中蛋白质含量高于谷类和薯类食品2.5-8倍，是优质丰富的植物蛋白质来源。目前对大豆功能特性的研究显示，大豆具有降低血脂血糖、降血压、防癌抑癌、增强骨质、改善绝经综合症等8项功能1, 2。对大豆功能性成分的深入研究，也引起了大众对大豆综合开发利用的日益关注。1994年，我国提出了在城乡实施“大豆行动计划”的意见，由此拉开了我国大豆的综合开发、利用的序
23、幕。2006年，“双蛋白”概念和“双蛋白”战略在“第二届中国大豆食品产业圆桌峰会上”首次提出。与会专家提出，依托我国的国情，借鉴国外的先进理念，科学继承、发扬我国以优质植物蛋白为主要膳食蛋白质的传统饮食文化，实施两种不同来源蛋白质食品优势互补的食品科学发展战略3, 4。 大豆分离蛋白生产过程中，营养成分会不同程度的流失。这部分营养成分及生物活性物质主要有大豆乳清蛋白、大豆低聚糖、异黄酮、皂苷等。若以蛋白质溶解性为分类标准，大豆蛋白分为乳清蛋白和大豆球蛋白两类。其中，大豆球蛋白约占总蛋白含量的90%，包括大豆分离蛋白、组织蛋白、浓缩蛋白等蛋白质，这些蛋白质也是以往大豆蛋白质研究领域的重点。大豆乳
24、清蛋白约占大豆总蛋白的5%，即大豆乳清蛋白。这部分蛋白是生产大豆分离蛋白过程中豆粕碱提酸沉后，依旧溶解在清液的蛋白质的统称。这些物质通常以乳清液的为排放载体而排放，既造成了资源的浪费，也严重污染了环境。据统计，国内大豆分离蛋白企业每年的大豆废水排放量多达300万吨以上，随着经济的发展、企业的增多，排放量肯定会大幅增加。如不对乳清废水做处理，对环境的污染将不堪设想。近些年，科学技术的进步，人们环保意识的加强使得对大豆乳清进行相应处理，回收其中有效成分的工作迫在眉睫。本文通过对大豆乳清蛋白絮凝剂的筛选、絮凝条件的研究，确定了最佳的大豆乳清蛋白絮凝剂及其絮凝条件；通过絮凝剂与乳清蛋白的絮凝特性，选出
25、了能高效提高蛋白质凝聚体粒度的絮凝剂，并随后对其进行了微滤实验，得到了相应的膜动力参数；然后对截留液乳清蛋白的性质进行了研究。此研究的结果既有利于回收了乳清蛋白，又为减轻乳清排放造成的污染做了一定的贡献。1.2 大豆乳清及乳清中的蛋白质1.2.1 大豆乳清中的主要活性成分大豆乳清中大约包含1.5%的固形物。这些固形物中包括多种相当数量的活性成分，如乳清蛋白、大豆低聚糖等。下面将对这些主要成分进行简单的概述。1.2.1.1 大豆乳清蛋白（Whey soy protein）大豆乳清蛋白主要是大豆蛋白中的2S、7S组分，含有-淀粉酶、凝血素、磷酸酶植酸、胰蛋白酶抑制剂、细胞色素C等很多生理活性物质5
26、-8。各组成部分的分子量和等电点如表1-1所示。表1-1大豆乳清蛋白组成成分的分子量及等电点组分成分 相对分子量 等电点2SKunitz抑制剂 215004.5Bowman-Birk抑制剂 7985 4.2细胞色素C 12000 9.8-10.17S血球凝集素 120000* 5.81脂肪氧化酶 102000 5.68-淀粉酶 61700 5.85注：*由4个相同分子量为3000的亚基组成1.2.1.2 大豆低聚糖（Soybean oligosaccharides）大豆低聚糖（SOSB）是大豆中所含可溶性碳水化合物的总称，它是-半乳糖苷类，主要由水苏糖四糖、棉子糖和蔗糖等组成。其中，蔗糖占低聚
27、糖总量的39%左右，水苏糖占24%，棉籽糖则占8%9。大豆低聚糖具有降低血清胆固醇10、抗癌抗肿瘤11、促进钙的吸收、降血压、抗衰老、改善皮肤过敏等功效。如今，大豆低聚糖已被广泛应用于食品加工过程中，这部分食品主要有乳制品、软饮料、巧克力、粮油制品等。1.2.1.3 大豆异黄酮（Soybean isoflavone）大豆异黄酮主要包括5,7,4-三羟基黄酮、大豆甙元、大豆黄素，其结构和17-雌二醇很相似12。它们的结构见图1-1所示。也称“植物雌性激素”，作为生物活性最强的大豆提取物，受到了广泛深入的研究。它具有一定的雌激素功效13。国外学者的研究表明，大豆异黄酮具有防止骨质疏松的功能14,
28、15。并且，它还具有维持雌性激素水平、抗血管增生降低前列腺癌等活性16。也正是由于它具有的特性，使得其被广泛应用在保健领域17。图1-1 大豆异黄酮结构图1.2.1.4 大豆皂苷（Soy Saponins）大豆皂苷是一种分子量为1000左右的两性三萜酸性皂苷。之前一直因为其抑制生长的特性而被认为是豆制品加工中该被除掉的一种抗营养因子。近期研究表明，它具有增强免疫调节能力、抗癌、清除自由基等功效。它能与富含磷脂和胆固醇的癌细胞膜相互作用，影响癌细胞的生长，造成细胞凋亡18。另外，由于具有对健康有益的活性功能，大豆皂苷具有广泛的开发应用前景。比如，以其具有发泡和乳化性，现已被应用于食品当中19。1
29、.2.2 大豆乳清蛋白由表1-1可知，大豆乳清蛋白是多种蛋白的统称，主要由胰蛋白酶抑制剂、细胞色素C、大豆血球凝集素、脂肪氧化酶和-淀粉酶组成。下面将依次介绍这些蛋白质的性质，以说明对乳清蛋白进行回收利用的必要性。1.2.2.1 胰蛋白酶抑制剂（Trypsin Inhibitors）胰蛋白酶抑制剂也是大豆中的一种抗营养因子，是一种含有72-197个氨基酸残基的具有胰蛋白酶抑制作用的多肽或者蛋白质20,在大豆中约有7-10种胰蛋白酶抑制剂21。按照氨基酸序列的同源性可以分为两类：Kunitz类胰蛋白酶抑制剂(Kunitz trypsin inhibitors, KTIS)的活性中心为Arg63和
30、Ile64，分子内有两个二硫键(Cys39-Cys86,Cys138-Cys145)，相对分子量为20000。其结构为12个反平行带十字交叉构成的直径约为3-5nm的球体。它属于折叠蛋白，具有特殊的热稳定和化学稳定性。每个KTIS分子可以钝化一分子的胰蛋白酶22, 23，其结构见图1-2。它在大豆中的含量约为0.6%；另一类为Bowman-Birk类胰蛋白酶抑制剂（Bowman-Birk inhibitors, BBI），相对分子量为7985，由71个氨基酸组成，含有7个二硫键24, 25，能在两个活性位点同时抑制胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。BBI抑制胰蛋白酶的位点为赖氨酸16-丝氨酸17；抑制胰
31、凝乳蛋白酶的位点为亮氨酸44-丝氨酸4526，其结构见图1-3。它在大豆中约占1.4%。虽然胰蛋白酶抑制剂一直被认为是传统意义上的抗营养因子，但现在的研究表明，BBI具有抗癌作用，虽然抗癌的机理还不清楚27。同样低浓度的BBI可保护组织免受辐射、自由基损伤，并具有降低胆固醇的功效。 图1-2 Kunitz胰蛋白酶抑制剂结构 图1-3 Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂结构1.2.2.2 细胞色素C（Cytochrome C）细胞色素C是一种保守蛋白质，定位在线粒体内膜外侧，存在于所有含线粒体呼吸链的生物中。它是线粒体呼吸链中的一种重要电子载体。除了具有电子传递功能以外，近期实验研究发现，细胞色素C在细胞的凋亡和抗氧化方面也有重要的作用。临床上用于急救或辅助治疗各种原因引起的组织缺氧，如一氧化碳中毒，安眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉前处理及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧等，亦可用于脑缺氧、中毒性心肌损害、心肌炎、心肌代偿不全、心绞痛、心肌梗塞、肝炎、肾炎等28。细胞色素C从结构上看，分子形态近似球形
