1、牛奶图谱小组年终总结牛奶特征图谱小组2013年年终工作总结小组成员：杨永新 马露 陈静廷 一、牛奶图谱的建立1. 奶牛、水牛、牦牛和山羊乳中主要蛋白RP-HPLC图谱的建立试验通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定奶牛、水牛、牦牛和山羊乳中主要蛋白组分及其含量。试验分别采集奶牛乳样20份（北京），山羊乳样14份（陕西），水牛乳样20份（云南）和牦牛乳样20份（青海），于-80保存至测样，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定。有蛋白均在30min内检测完成，色谱峰出峰的顺序为-CN, -CN, -La, -CNA1, -CNA2, -LgB 和-LgA。在本试验中，奶牛、水牛和牦牛
2、乳中的-CN均出现两个色谱峰，并命名为-CNA1, -CNA2。结果显示，不同物种乳中主要蛋白组分含量存在一定的差异，牦牛乳中的-CN、-CN含量最高，显著的高于其他物种，而-CN的含量与水牛乳相似，-LgB的含量最高；水牛乳中-La含量最高，奶牛乳中的-LgA含量最高。通过PCA（PC1:54.34%; PC2: 28.97%）分析不同物种乳中主要蛋白组分结果显示，奶牛、水牛、牦牛和山羊均可较好的进行区别，且相应的载荷图也可以得出不同物种中相对应的含量较高的蛋白组分，与统计分析的结果相一致。RP-HPLC被认为是一种快速分离和鉴定乳蛋白组分的一种方法，在本试验中成功的分离和量化了奶牛、水牛、
3、牦牛和山羊乳中主要蛋白组分。不同物种（奶牛、山羊、水牛和牦牛）乳中乳蛋白组分含量存在较大差异，奶牛乳中-LgA显著高于其他物种，水牛乳中-La含量显著高于其他物种，牦牛乳中的-CN、-CN及-LgB含量显著高于其他物种，且可通过PCA的结果可较为明显的区分。在本试验条件下，建立了奶牛、山羊、水牛和牦牛乳的RP-HPLC特征图谱，且在RP-HPLC呈现不同的色谱图，为进一步区分不同来源乳，甚至掺假乳提供一定的理论基础。图1 奶牛、水牛、牦牛和山羊乳蛋白反相高效液相色潽图谱表1. 单一蛋白组分的校准方程的参数Protein fractionIntercept SEbSlope SER2-CN963
4、60.2811.75038.15.00.9993 -CN103789.82266.46003.661.20.9995 -CN5748.8358.8137.00.70.9991 -La59656.21918.73149.245.30.9990 -LgA33567.5836.23474.222.90.9992 -LgB95617.8729.55700.326.80.9990 a回归方程是基于6个数据点，每个平均两个注射.b 标准误.表2.回收率测定Protein fractionConcentration(g/L)Adding amount(g/L)Detectable amount(g/L)Re
5、covery rate(%)Average recovery rate(%)RSD(%)a-CN10.977.7316.1886.5393.658.5415.4924.3792.1123.2334.99102.31-CN12.988.6720.0882.7190.538.7217.3429.7890.3926.0140.9998.48-CN5.913.4110.6686.5192.336.476.8214.4892.0410.2318.8498.44a-La1.390.612.1189.9697.789.901.222.8194.781.833.88108.60-LgA2.021.23.398
6、8.3091.394.832.44.5189.423.66.0296.44-LgB1.081.272.5689.1891.152.032.543.7891.402.814.1092.86表 3.奶牛、牦牛、水牛和山羊乳中主要蛋白组分的含量（g/L）和相应的标准差.Protein fractionSpeciesMeanSD-CNcow11.81B0.120 goat9.48C0.258 buffalo11.53B0.136 yak16.14A0.246 -CNcow13.31C0.285 goat20.53B0.490 buffalo22.68A0.513 yak23.34A0.413 -CNc
7、ow6.24C0.173 goat5.56D0.053 buffalo7.35B0.109 yak9.80A0.150 -Lacow1.45B0.032 goat1.28B0.056 buffalo7.96A0.156 yak1.47B0.038 -LgAcow2.15A0.041 goat0.14B0.006 buffalo0.13B0.004 yak0.12B0.004 -LgBcow1.19C0.031 goat3.69B0.092 buffalo3.88B0.052 yak9.46A0.227 A-D肩标表示差异极显著(P 0.01).图 2. 奶牛、牦牛、水牛和山羊乳中主要蛋白组分的
8、含量（g/L）图3 奶牛、牦牛、水牛和山羊乳中主要蛋白组分含量PCA分析Lu Ma1,2, Deng Pan Bu1*, Yong Xin Yang1, Jing Ting Chen1, Xiao Min Xu1, and Jia Qi Wang1*.Separation and Quantification of Major Milk Proteins in Different Species by Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography. 改投-期刊待定2. 奶牛、水牛、牦牛、娟姗牛、骆驼、马和山羊乳中奇数碳链支链脂肪酸（
9、OBCFA）表达模式的确立试验通过气相色谱质谱技术（GC-MS）测定奶牛、水牛、牦牛、娟姗牛、骆驼、马和山羊乳中奇数碳链支链脂肪酸（OBCFA），分析不同物种乳中OBCFA的表达模式。试验分别采集奶牛乳样20份（北京），山羊乳样20份（河北），水牛乳样20份（云南）和牦牛乳样20份（青海），娟姗牛乳样20份（河北），骆驼乳样8份（新疆）和马乳样8份（新疆）于-80保存至测样，采用气相色谱质谱技术（GC-MS）测定。结果显示，在四种牛科类物种：奶牛、水牛、牦牛和娟姗牛乳脂肪中OBCFA组成中含量最高的均是iso C15:0 和C 15:0；而在山羊乳则是C15:0和 anteiso C17:0；
10、马和骆驼乳中则是iso C15:0和anteiso C17:0，均呈现一个物种特异性。且所有物种乳中anteiso C13:0的含量均最低。无论是OBCFA总含量还是各组分含量除了anteiso C17:0外，牦牛乳中含量最高，而anteiso C17:0的含量则略低于骆驼乳。马乳中的总OBCFA含量最低。表1. 不同物种乳中OBCFA组分含量 (g/100g FA)SpeciescowyakbuffalojerseygoatcamelhorseanteisoC13:00.0070.0002Ef0.0520.0012Aa0.0470.0018ABb0.0160.0007De0.0260.001
11、1Cd0.0420.0024Bc0.0090.0009EfisoC14:00.0740.0030Ee0.6820.0104Aa0.3350.0147Bb0.2510.0079Cc0.1710.0066Dd0.3210.0099Bb0.0630.0049EeanteisoC15:00.0490.0016Cc0.2950.0075Aa0.1710.0053Bb0.1730.00631Bb0.0800.0042Cc0.1850.0138ABb0.0040.0003CcisoC15:01.0420.0275DEe3.3480.0431Aa2.9010.1298Bb3.07070.1112ABab1.3
12、700.0363Dd2.2680.1287Cc0.8130.0871EeC15:00.6990.0198Ee3.3200.0439Aa2.1900.0477Bb1.9810.0303Cc1.9420.0563CDc1.7680.0659Dd0.3080.0153FfisoC16:00.1830.0057Dd1.2700.0312Aa0.4930.0192BCb0.53430.0234Bb0.4000.0406Cc0.5160.0282Bb0.1370.0112DdanteisoC17:00.6360.0222Ff2.2200.0304Bb1.0860.0215Ee1.4150.0665Dd2.
13、0000.0683Cc2.8920.1334Aa0.7840.0430FfisoC17:00.3480.0119Ff1.3620.0156Aa0.6160.0136Dd0.7890.0305Cc0.5350.0198Ee1.0210.0220Bb0.2130.0125GgC17:00.6160.0244Dd3.0200.0618Aa1.1390.0352Cc1.1980.0391Cc1.5030.0329Bb1.4120.0369Bb0.2800.0214Eea-g 肩标表示差异显著 ( P 0.05), A-G肩标表示差异极显著( P 0.01).表2. 不同物种乳中OBCFA含量 (g/1
14、00g FA)SpeciesOBCFASDJersey9.426903C0.198727buffalo8.978631C0.214429camel10.42455B0.343682cow3.655732E0.076905goat8.026277D0.123998horse2.610363F0.134965yak15.56929A0.138487A-F肩标表示差异极显著( P 0.01).图1. 奶牛、牦牛、水牛、娟姗牛、骆驼、马和山羊乳中OBCFA组分含量PCA分析通过PCA（PC1:79.09%; PC2: 11.39%）对不同物种乳中OBCFA各组分含量进行分析得出，马乳和奶牛乳在PC1上
15、聚为一组，牦牛乳在PC1上可以很好的与其它物种乳进行区分，而骆驼乳和山羊乳则可较好的在PC2上与其它物种进行区分，娟姗牛乳和水牛乳在PC2方向聚为一组。总体来讲，PCA可以很好的将牦牛乳和其它物种乳进行区分，而马乳、奶牛乳、骆驼乳和山羊乳的区分效果较好，但通过PCA无法将水牛乳和娟珊牛乳进行区分。图.2. 奶牛、牦牛、水牛、娟姗牛、骆驼、马和山羊乳中OBCFA组分含量Cluster分析(-1.19-1.19)通过Cluster聚类分析不同物种乳中OBCFA的结果得出，以上物种主要聚为两大类，其中四种牛科类：奶牛乳、水牛乳、牦牛乳和娟姗牛乳聚为一类，山羊乳也聚在这一类，但又独立聚一小类；而骆驼乳
16、和马乳聚为另一大类，具有一定的种属特异性，与统计分析的结果相一致。该结果与本课题组杨永新博士（2013）通过蛋白质组学技术分析不同物种乳清中蛋白组分而进行聚类分析的结果相一致。且通过聚类分析，除娟姗牛乳外，其他物种乳均可较好的进行区分。采用GC-MS技术对奶牛乳、水牛乳、牦牛乳、娟姗牛乳、山羊乳、骆驼乳和马乳中OBCFA进行测定得出，不同物种乳中OBCFA组分含量差异显著，牦牛乳中OBCFA总量和其组分除anteiso C17:0外，含量均最高。在四种牛科类：奶牛乳、水牛乳、牦牛乳和娟姗牛乳OBCFA中含量最高的是iso C15:0 和C 15:0；而在山羊乳则是C15:0和 anteiso
17、C17:0；马和骆驼乳中则是iso C15:0和anteiso C17:0，均呈现一个物种特异性。通过PCA和Cluster均可较好的区分奶牛乳、水牛乳、牦牛乳、娟姗牛乳、山羊乳、骆驼乳和马乳，且Cluster的结果与统计分析结果相一致，聚类效果具有一定的物种特异性。鉴于前人报道OBCFA组分有抗癌作用，在本试验条件下，通过GC-MS技术对奶牛乳、水牛乳、牦牛乳、娟姗牛乳、山羊乳、骆驼乳和马乳中OBCFA含量的测定，为乳中OBCFA的实际应运提供一定的数据基础，为乳脂肪的进一步研究提供一定基础信息。Lu Ma1,2, Deng Pan Bu2, Yong Xin Yang2, Jing Tin
18、g Chen2, Xiao Min Xu2, Sheng Guo.Zhao2, and Jia Qi Wang2*. Odd-and branched-chain fatty acids profiles of cow, yak, bualo, Jerseys, goat, camel and horse milk fat. Food & Function.（投稿）3. 奶牛、水牛、牦牛、娟姗牛和山羊乳中常量元素和微量元素的比较分析试验通过电感耦合等离子体质谱技术（ICP-MS）测定奶牛、水牛、牦牛、娟姗牛和山羊乳中常量元素和微量元素（Na，Mg，K，Ca，Mn，Fe，Co，Zn，Se），分析
19、比较不同物种乳中常量元素和微量元素含量的差异性。试验分别采集奶牛乳样20份（北京），山羊乳样20份（河北），水牛乳样20份（云南）和牦牛乳样20份（青海），娟姗牛乳样20份（河北）于-80保存至测样，采用电感耦合等离子体质谱技术（ICP-MS）测定。结果显示，不同物种乳中常量元素（K、Ca、Na、Mg）和微量元素（Mn、Fe、Co、Zn、Se）的含量差异显著。常量元素中的K和Ca的含量在奶牛、水牛、牦牛、娟姗牛和山羊乳中均较Na和Mg高，微量元素中的Fe和Zn的含量较高；通过PCA分析结果可知，水牛乳可以很好的与其它物种乳进行区分。采用ICP-MS技术比较分析奶牛、水牛、牦牛、娟姗牛和山羊乳中
20、常量元素和微量元素（Na，Mg，K，Ca，Mn，Fe，Co，Zn，Se），结果显示，不同物种乳中Na，Mg，K，Ca，Mn，Fe，Co，Zn和Se的含量差异显著，且常量元素中的K和Ca的含量在奶牛、水牛、牦牛、娟姗牛和山羊乳中均较Na和Mg高，微量元素中的Fe和Zn的含量较高。为进一步评价不同物种乳营养品质提供一定的数据基础。表1 优化的微波消化程序StepPower(W)Gradient temperature time (min)Temperature ()Holding time (min)1160010906216001014010316001019020表 2 ICP-MS仪器条件和
21、数据采集参数ParameterExperimental conditionsNebulizerConcentric NebulizerSpray ChamberQuartztwo-channel Scott Spray ChamberSpray ChamberTemperature2 CRF Power1550WSmpl Depth8 mmSample uptake rate0.15 ml/minCarrier Gas flow rate0.9 L/minPlasma Gas flow rate15.0 L/minAuxiliary Gas flow rate0.25 L/minHe Gas5
22、 ml/min表3 不同物种乳中常量元素含量（mg/L）Speciescowyak buffaloJersey cattlegoatNa318.0717.63Cc319.0410.50Cc380.9412.57BCb390.1016.58Bb488.8327.04AaMg120.443.32Ccd110.913.51Cd182.008.72Aa130.903.58Cc154.775.94BbK1320.2926.30Bc1361.6022.40Bbc918.2616.86Cd1412.5235.75Bb1546.0658.93AaCa1350.3845.18B1046.9756.95C1821
23、.5333.36A1373.8732.50B1379.5151.60B图1不同物种乳中常量元素含量（mg/L）表4 不同物种乳中微量元素含量（ug/L）Speciescowyak buffaloJersey cattlegoatMn73.803.18A46.272.36C39.312.25C38.651.81C60.283.12BFe1591.2291.21Aa1182.72140.17ABb776.7930.10BCc535.7543.30Cc439.8820.78CcCo0.970.05A1.020.07A0.370.03B0.960.07A0.320.02BZn7352.35379.02
24、Aa5814.94295.69Bbc6323.35214.35ABb5409.81178.69Bc4144.73264.62CdSe18.451.22B12.630.52C27.341.19A18.110.66B14.340.88C图2不同物种乳中微量元素含量（ug/L）图3不同物种乳中元素含量PCA分析结果准备撰写文章：Lu Ma1,2, Deng Pan Bu1, Yong Xin Yang1, Jing Ting Chen1, and Jia Qi Wang1*. Detection and comparison of trace and miner elements in differ
25、ent species milk by ICP-MS.（期刊待定）4. 奶牛乳清中特征性microRNA鉴别试验通过高通量测序技术检测牛奶与羊奶乳清中的microRNA，找出各自特征性的microRNA，并进一步通过qRT-PCR确定；2) 通过对牛奶特征性的microRNA的检测，确定羊奶中掺入牛奶的最低检出限；3) 通过测序，进一步检测新鲜乳样（牛奶、羊奶）与反复冻融乳样（牛奶、羊奶）中microRNA种类及表达丰度的区别。试验分别采集奶牛乳样30份（北京），山羊乳样30份（河北），分离鲜乳和反复冻融乳样的乳清，提取其中的microRNA，送检测序。图1 分离乳清方法（H.Izumi et
26、 al，2012）目前本试验正在进行中准备撰写文章：Lu Ma1,2, Xue Mei Nan1,Deng Pan Bu1, Yong Xin Yang1, Jing Ting Chen1, and Jia Qi Wang1*. Identification and Quantification of microRNA in fresh milk whey of goats （期刊待定）Lu Ma1,2, Xue Mei Nan1,Deng Pan Bu1, Yong Xin Yang1, Jing Ting Chen1, and Jia Qi Wang1*. An novel approac
27、h to detect cow milk mixing in goat milk - specific microRNA identification（期刊待定）5. 分析奶牛、牦牛、水牛、山羊和骆驼乳清蛋白的定量表达模式本研究旨在分析奶牛、牦牛、水牛、山羊和骆驼乳清蛋白的定量表达模式。离心分离奶牛、牦牛、水牛、山羊和骆驼的乳清蛋白，采用iTRAQ蛋白质组技术鉴定并量化。采用iTRAQ蛋白质组技术鉴定并量化了211个奶牛、牦牛、水牛、山羊和骆驼的乳清蛋白。用GO数据库注释对113个鉴定蛋白的分子功能、细胞组分和生物学过程进行了归类（图 1）。用主成分分析解释了奶牛、牦牛、水牛、山羊和骆驼乳清蛋
28、白组表达模式存在的显著差异。聚类分析方法依据117个差异表达的乳清蛋白将上述物种聚类为三类，1)奶牛、牦牛和水牛聚为一类；2) 奶牛、牦牛、水牛和山羊为一类；3)骆驼为一类（图 2）。结果表明乳清酸性蛋白和醌氧化还原酶是骆驼乳的特征性分子，双糖链蛋白聚糖是山羊乳的特征性分子，未命名蛋白（AC：F1MK50）是牦牛乳的特征性分子，凝聚素和原胺氧化酶分别是水牛和奶牛乳的特征性分子（表1）。研究结果可用于揭示奶牛、牦牛、水牛、山羊和骆驼乳清蛋白定量表达模式，有利于鉴定上述物种乳的掺假，同时，基于上述物种生理差异为生产特定乳清蛋白提供了依据。表1. 乳清差异表达蛋白的主成分分析SpeciesAcces
29、sion No.Protein namecamel milkP15522glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1P00710alpha-lactalbuminP09837whey acidic proteinQ28452quinoneoxidoreductaseQ9GK12peptidoglycan recognition protein 1O97723lactalbumin (Fragment)Q9TUM0lactotransferrinGoat milkA5JST2serum amyloid A proteinP21809biglycanQ8SQ82Polymeric immunoglobulin receptor (
