1、朱玉贤分子生物学题库整理分子生物学整理2013/12/10根据每份PPT后的老师给的题目整理的，据说考试不超过那个范围，大家认真复习，若有错误的地方，请积极批评指正！ 第一份PPT1. 分子生物学：是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上正式揭示生物界的奥秘，有被动地适应自然界转为主动地改造和重组自然界的基础学科。2. 生物大分子（ biomacromolecule ）：主要包括核酸（DNA和RNA）、蛋白质、多糖等，其主要特征是由小分子的构件分子（如：核苷酸、氨基酸、单糖等）组成，具有较复杂的空间结构，而且空间结构与其生物活性密切相
2、关。 3. DNA重组技术（又称基因工程）是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。4. 结构分子生物学：研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的学科。5. 基因组（Genome）：是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部DNA分子的总和。6. 基因组计划（ genome project）：以获得某物种基因组全序列为主要目标的科学计划。7. 基因组学（genomics）：是指研究基因组结构和功能的科学，包括基因组作图、核苷酸序列测定、基因定位及基因功能分析等。8. 结构基因组学（structural genomics）：以
3、全基因组测序为目标，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。9. 功能基因组学（functional genomics）：以基因功能鉴定为目标，根据结构基因组学提供的信息，以高通量、大规模的实验方法，借助计算机分析，系统地对基因功能进行诠释。10. 生物信息学是以生物大分子为研究对象，以计算机为工具，运用数学和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门科学。1. 什么是分子生物学？其研究对象是什么？分子生物学：是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自
4、然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。 研究对象：生物大分子（ biomacromolecule ）：主要包括核酸（DNA和RNA）、蛋白质、多糖等，其主要特征是由小分子的构件分子（如：核苷酸、氨基酸、单糖等）组成，具有较复杂的空间结构，而且空间结构与其生物活性密切相关。2. 试举出5例分子生物学发展史上的重要科学事件1 Charles Darwin进化论：物竞天择，适者生存2 施旺细胞学说：动植物都是由细胞组成的。3 Gregor Mendel经典遗传学：遗传因子4 Morgan基因学说5 Watson和CrickDNA双螺旋模型：里程碑3. 什么是DNA重组技术？有何应用？DNA重组技
5、术（又称基因工程）是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。应用：1 基础理论研究中的应用基因组测序基因定位基因功能研究基因表达和调控研究2 多肽类（如激素、抗生素、酶类和抗体等）产品的生产微生物基因工程与多肽类产品的生产转基因动物与蛋白药物的生产转基因植物与蛋白药物的生产3 转基因动物与人类器官移植4 物种改良转基因动植物、工程微生物4. 什么是结构分子生物学？结构分子生物学是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。内容：结构测定、结构运动变化规律探索、结构与功能关系手段：X-射线衍射晶体学（蛋白质晶体学）、二维或多维核磁共
6、振研究液相结构、电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法。第二份PPT分子生物学研究法核酸：是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)SDS裂解法：将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁 细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇 沉淀、洗涤质粒DNA。荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA 大得多，电泳迁移率低。紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲 液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RN
7、A的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。玻棒缠绕法：两个关键步骤，一是基因组DNA沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面；二是将 DNA沉淀缠绕在带钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转移至pH8.0的TE 缓冲液中。压碎与浸泡法：将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱 缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。碱裂解法：在NaOH提供的高pH（12.012.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。（尽 管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠绕紧密而不易解链，只要不
8、在 碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。）酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法：以含4mmol/L的异硫氰酸胍与0.1mmol/L的-巯基乙醇 的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通 过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。变性 ：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏， DNA由双螺旋变成单链过程。增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。融解温度（Tm）：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温 度或融解温度。（爆发式：热变性是在变性温
9、度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到 熔点时的融化现象，故名融解温度。狭窄性：变性温度范围很小。）复性：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象， 它是变性的一种逆转过程。退火：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。核酸分子杂交:两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合 成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。（杂交的本质：就是在一定条件下使 互补核酸链实现复性。）核酸探针：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后 可用特殊方法检测的 已知被标记的核酸分子。cDNA(complementar
10、y DNA)：是指与mRNA互补的DNA分子。固相分子杂交：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的 杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。原位杂交：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交 并对其检测的方法基因芯片(gene chip)：又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray），是指 集成了大量DNA片段的玻璃片或纤维膜等载体。问答：1、简述核酸纯化的原则和要求。原则：保持核酸碱基序列的完整性。 尽量清除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度要求：在整个操作过程中应尽量避免各
11、种有害因素对核酸的破坏。 1、温度不要过高(0-4) (高温破坏氢键) ； 2、控制pH值范围(pH4-10) (极端酸碱破坏磷酸二酯键) ； 3、减少物理因素对核酸的机械剪切力； 4、保持一定离子强度。核酸纯度的要求 1、核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂； 2、其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度； 3、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应 去除DNA。2、说明核酸凝胶电泳技术的原理和要点。原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率
12、，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，带负电荷，在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，迁移率与核酸分子大小成反比。要点：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。电泳鉴定方法：荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光。3、为何沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法？ 改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。4、简述核酸鉴定的要点。 1、核酸浓
13、度鉴定 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外 线，其最大吸收波长为260nm。 荧光光度法：核酸在嵌入EB后，发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的 含量呈正比。 2、核酸纯度鉴定 紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE 缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示 不纯。 荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子 较RNA大得多，电泳迁移率低核酸纯度鉴定 3、完整性鉴定 琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果
14、为依据。 A、基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状。 B、完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值， 如有改变则提示有RNA的降解。 C、若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。5、什么是酚抽提法？什么是碱裂解法？酚抽提法：以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理 后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。裂解液成分的作用：EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞膜稳定性。SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并使其变性
15、沉淀，同时变性DNase。无DNase的RNase：可高效水解RNA而避免DNA的消化。蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质。酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性。pH 8.0的Tris缓冲液：保证抽提时DNA进入水相，防止DNA变性。碱裂解法：在NaOH提供的高pH（12.012.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA6、简述RNA提取的要点。 RNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中；RNase分子很难失去活性，而且容易复性，在RNA的制备过
16、程中，排除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步分离总RNA它以含异硫氰酸胍，-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的条件下，用酚/氯仿抽提细胞裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA7、什么核酸变性、核酸复性和融解温度？分别受哪些因素影响？ 核酸变性：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受 到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程 影响因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。如：加热，极端的pH 有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等） 核酸复性：指变性 DN
17、A 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构 的现象，它是变性的一种逆转过程。 影响因素：1、温度和时间 2、DNA浓度 3、DNA分子大小和复杂度 4、离子强度 融解温度：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链 温度或融解温度。 影响因素：1、DNA分子大小和碱基的组成 2、溶液的离子强度 3、pH值 4、变性剂8、什么是核酸分子杂交？其本质是什么？ 核酸分子杂交：两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。 本质：在一定条件下使互补核酸链实现复性。9、什么是核酸探针？有哪些
18、类型？其设计需要遵循哪些原则？ 核酸探针：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的 已知被标记的核酸分子。 类型：基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 探针设计原则： 1、探针长度：一般要求在1050bp。 2、 GC含量为4060。 3、 探针分子中应避免互补序列。 4、避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或 -CCCC-。 5、借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较。10、理想的探针标记物应具有什么特点？ 检测物要灵敏、特异、稳定、简便。 标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂 交特异性、稳定性和Tm值。
19、标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。 标记物对检测方法无干扰。11、简述核酸分子杂交技术的一般流程。 探针制备及标记（同位素或非同位素） 待测核酸样品制备（分离，纯化） 杂交（液相，固相，原位杂交） 杂交后处理（去掉非特异杂交分子） 显示结果（显色，发光，放射自显影） 结果分析12、有哪些常用的核酸分子杂交技术？其检测对象分别是什么？13、什么是固相分子杂交？其优点是什么？ 是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的杂交液中， 进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。 优点：未杂交的游离探针通过漂洗可容易除去，膜上的杂交分子容易检测，还能防止 靶D
20、NA的自我复性，所以被广泛应用。14、请比较Southern印迹杂交和Northern印迹杂交的相同点和不同点。相同点：杂交流程相同，探针种类和标记方法相同，检测方法相同不同点：Southern印迹是与酶切后的电泳DNA片段杂交，Northern印迹杂交是应用DNA 探针检测特异mRNA的一种膜上印迹技术。15、什么是原位杂交？其特点是什么？ 原位杂交：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进 行杂交并对其检测的方法。 特点：原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点之外，并可精确定位，16、如何进行核酸分子杂交条件的优化？ 1、探针的选择 检测单个碱基改变选用寡
21、核苷酸探针。 检测单链靶序列选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针。 长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体。 100bp左右的探针适合原位杂交。2、探针的标记方法在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和价廉的HRP显示系统等 。3、探针的浓度 随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加4、杂交最适温度 若反应温度低于Tm 1015，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配 对减少。 一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在65进行，当含50
22、%甲酰 胺时，在42进行。5、反应时间和洗膜温度 杂交时间短了，反应无法完成；长了引起非特异结合增多。一般杂交20 h左右。 杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm值512进行 。17、什么是基因芯片？其突出特点是什么？有何应用？ 基因芯片(gene chip)：又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）， 是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纤维膜等载体。突出特点：建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段 应用：基因表达水平的检测 基因突变和多态性的检测 基因芯片在药物筛选中的应用 预防医学领域的应用 基因芯片在疾病诊断中的应用第三份P
23、PT名词解释：one-step RT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR荧光定量PCR：是通过对PCR扩增反应每个循环结束时产物荧光信号的检测，对起始模板 进行定量分析的技术。实时荧光定量PCR:是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光阈值：CR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 Ct值：C代表Cycl
24、e，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数。PCR-限制性酶切片段多态性（PCR-RFLP）：不同的限制性核酸内切酶能识别特异的DNA序 列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大 小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息。（用途：传染病病原体 基因分型、人类基因变异研究。）单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）：本法就是将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为 单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA 分子在凝胶 中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关
25、，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此， 电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。PCR-ELISA：引物采用双标记，即一个引物5端标记便于PCR产物固定的功能基团（如生 物素），另一个引物5端标记便于PCR产物检测的基团（如地高辛、荧光素等）。非特异性扩增：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特 异性扩增带与非特异性扩增带。荧光染料法：SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的 SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加 完全同步。复合探针法（complex probes）
26、基本原理：首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp），5端 接一荧光分子，另一为淬灭探针（15bp），3端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探针 5端杂交。问答:1、简述聚合酶链反应（PCR）的原理和反应体系。原理：模拟体内DNA半保留复制过程，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应，由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。反应体系：模板（template） 引物（primer） DNA 聚合酶（DNA polymerase） dNTP PCR buffer 2、PCR引物的设计需要遵循哪些原则？1、长度1530 b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。2、
27、引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在45 55%左右。3、引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；两个引物之间尤其在 3 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体4、物的碱基顺序与非扩增区域同源性小于70%或连续互补碱基少于8个。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。5、引物的3末端与模板DNA一定要配对。另外 3末端的末位碱基最好选T、G、C，而不选A（引物3末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异）。6、只要与模板DNA结合的引物长度足够，引物的 5 末端碱基最多可以有10个碱基不与模板DNA匹配，并不影响PCR反应进
28、行。 3、简述PCR的一般方案。 1、50 ul PCR反应体系的组成 样品DNA 0.11ug； 正链引物（25umol/L）1.0ul； 负链引物（25umol/L）1.0ul； dNTP （各2.5mmol/L）4.0ul； 10PCR缓冲液 5.0ul； MgCl2（25mmol/L）3.0ul； Taq DNA聚合酶12.5u； 蒸馏的去离子水补至50ul。 2、对照：阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。 3、PCR仪工作参数的设置：94 3060sec，553060sec，723060sec，循环30 次，最后72延伸5min。 4、PCR产物的保
29、存：PCR产物于4保存。4、请分别说明假阳性、非特异性扩增、假阴性、引物二聚体、无扩增产物、拖尾等现象出现的原因及应采取的对策。 假阳性原因：PCR产物是最主要的污染源。 含有靶DNA序列的质粒的污染。 阳性对照的污染。 标本之间的交叉污染。 在采集标本时，其他污染源带来的污染。 Taq聚合酶中带有细菌DNA，当PCR扩增片段为保守的rRNA序列时,易造成假阳性 对策：1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及 加样枪头等均应一次性使用。3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。非特异性扩增原因：1、引
30、物特异性差 2、模板或引物浓度过高 3、酶量过多 4、Mg2+ 浓度偏高 5、退火温度偏低 6、循环次数过多对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR 2、适当降低模板或引物浓度 3、适当减少酶量 4、降低镁离子浓度 5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6、减少循环次数 假阴性原因：1、标本处理的原因 处理标本时，靶DNA丢失。 处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。 标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA） 2）PCR试剂问题 Taq DNA聚合酶失活。Mg2+浓度过低或是没有加。 3）PCR扩增过程中的问题 PCR扩增仪故障。PCR扩增反应液没有加液体石
31、蜡油。 4）PCR产物鉴定中的问题 电泳时没有加溴化乙锭。电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。 凝胶浓度过低，使扩增带跑散。 对策：依原因，自己总结引物二聚体的原因有：1、两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是 引物3端有互补区。 2、引物模板比例太高，可增加模板用量。 3、退火温度过低。4、热循环次数过多。对策：增加模板用量。提高退火温度。减少热循环次数。减少引物3端有互补区碱基配对无扩增产物的原因：模板含有抑制物，含量低。Buffer对样品不合适。引物设计不当或者发生降解。退火温度太高，延伸时间太短。 对策：纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。 更换Buffer或调整浓度。降低退火温度、延长延伸时间。 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物。拖尾产生原因：模板不纯、Buffer不合适、退火温度偏低、酶量过多、 dNTP、Mg2+浓度偏高、循环次数过多 对策：纯化模板、更
