1、杜中细胞生物学实验指导y 细胞生物学实验指导王幼群 陈立群 杜 中编写中国农业大学生物学院细胞生物学教研组二OO九年一月目 录 实验一 光学显微镜技术 1 实验二 叶绿体的分离与荧光观察5 实验三 DNA提取 8 实验四 Feulgen反应 9 实验五 Brachet反应11 实验六 PAS反应显示糖元和其它多糖物质 12 实验七 光镜下植物细胞骨架的制片技术及观察14 实验八 细胞膜的渗透性 15 实验九 细胞融合17 实验一 光学显微镜技术一、实验目的：了解普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜和微分干涉显微镜的构造、工作原理和使用方法。学习测微尺的用法并测量细胞的大小。二、实验原理(含
2、在实验方法中)三、实验用品：普通明视野光学显微镜、万能显微镜（暗视野、相差、微分干涉、荧光显微镜）、镜台测微尺、目镜测微尺、载玻片、盖玻片、吸管等四、实验材料：培养的大肠杆菌、洋葱、石蜡切片、硅藻装片、马铃薯淀粉、小肠横切片，夹竹桃叶横切片等五、实验方法（一）普通明视野光学显微镜的使用和细胞大小的测量1、原理和构造 明视野显微镜是最常用的一种光学显微镜，其主要由光学放大系统（目镜、物镜），照明系统（光源、聚光器）和机械支架系统三部分构成。如下图所示。 目镜：位于镜筒上端，最靠近观察者的眼睛。常见的有5X, 10X和15X。 物镜：又称接物镜，其质量直接与观察效果和图像质量相关。常见的有4X，1
3、0X，20X，40X，100X等。外观上看，放大倍数越高的物镜，其长度越长。每个物镜上都有性能指标，如“40/0.65 160/0.17”说明该物镜放大倍数为40倍，数值孔径为0.65，要求的镜筒长度为160mm，盖玻片厚度不能超过0.17mm，油镜上标有“油”或“oil”字样。不同的物镜处于工作状态时（物像清晰），物镜最下端与盖玻片之间的工作距离称为工作距离。物镜的放大倍数与工作距离成反比，当使用高倍镜时，物镜与标本之间的工作距离小，因此要注意防止镜头碰触载片，以免损坏镜头。2、使用方法1) 将电源开关开到ON的位置， 放入标本，用10倍的物镜对焦；2) 调节光瞳间距，使左、右两个视场像合二
4、为一；3) 调节屈光度以适应观察者的视力，调节方法随镜的不同而不同； 4) 柯拉照明调节：5) 观察标本，使选用的物镜进入光路，并对标本对焦；6) 将孔径光阑缩至物镜数值孔径的60%80%或合适的范围。7) 注意：当物镜或标本更换时，需重新调节视场光阑和孔径光阑。8）观察自己做的石蜡切片，洋葱表皮细胞水封片，小肠横切片，夹竹桃叶横切片等3、测微尺的使用 目镜测微尺是一块圆形玻片，中心刻有一尺，长510mm，分成50100格。每格的实际长度因不同物镜的放大率和不同镜筒长度而异。镜台测微尺是在一块载玻片中央，用树胶封固一圆形的测微尺,长1或2mm,分成100或200格，每格的实际长度0.01mm(
5、10m)。当用目镜测微尺来测量细胞的大小时，必须先用镜台测微尺核实目镜测微尺每一格的长度 。方法如下:1) 将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。调焦至能看清镜台测微尺的分度。2) 小心移动镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使两尺左边的一直线重合,然后由左向右找出两尺另一次重合的直线(如图所示)。3) 记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格等于多少m。4) 取下镜台测微尺，换上需要测量的玻片标本，用目镜测微尺测量标本。5) 选取一洋葱表皮细胞，测量细胞的大小。 0 1 2 3 测定目镜测微尺每格
6、实长的图解 上尺：目镜测微尺；下尺：镜台测微尺 镜台测微尺的格数目镜测微尺每格的微米数 = 10 目镜测微尺的格数 例如 图中镜台测微尺1格=目镜测微尺6格,代入公式得：目镜测微尺每格=1/610m=1.66m 7）计算:根据测量结果计算各种细胞及细胞核的体积。椭球形:V=4ab2/3 a-长半径 b-短半径 圆球形:V=4/3r3 r-半径 圆柱形:V= r2h r-半径 h-高（二）暗视野显微镜1、原理和结构特点 在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。暗视野显微镜就是利用此原理设计的。它的结构特点
7、主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于12波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004m以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2m)所不具有的特性，可用以观察细胞的轮廓、鞭
8、毛、纤维等。 2、使用方法 1) 把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。 2) 选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以一般用显微镜灯照明。 3) 在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明光线于聚光镜上面进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。 4) 升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置，则应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。 5) 选用与聚光器相应的物镜，调节焦距,操作方法与普通显微镜相同，找到所需观察的物像。 6) 在暗视野显微镜下观察大肠杆菌临时封片。（三）相差
9、显微镜 1、原理和结构特点 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染
10、色标本。 相差显微镜(图23)与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。相板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。调轴望远镜是用来进行合铀调节的。相差显微镜在使用时，聚光镜下面环f状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效
11、能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。 2、使用方法 相差装置为多功能系列显微镜中的附属装置与普通显微镜配合使用。1) 相差装置的调换安装 卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。 2) 调焦 打开光源，旋转集光器转盘，将“o”对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。 旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽
12、与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为40X时应用X40标示孔的光阑。 3) 合铀调整 拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜内内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，图24，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换。合抽调整完毕，抽出望远镜，换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相
13、差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑和重新合抽调整。使用油镜时，集光器上透镜表面与载玻片之间要同时加上香柏油。 4) 在相差显微镜下观察洋葱表皮细胞和硅藻装片（四）微分干涉显微镜1、原理和结构特点：用的是平面偏振光，从起偏镜出来的偏振光，经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过渥拉斯顿棱镜后，将这两束光汇合，从而样品中厚度上的微小区别就会转化成明暗区别，增加了样品反差并且具有很强的立体感。浮雕的效果。2、使用方法：1) 起偏器和棱镜到位。2) 聚光器对应物镜倍数进行调节3) 在微分干涉显微镜下观察洋葱表皮细胞，马铃薯淀粉粒六、观察与结果：1、比较普通明视野光学显微镜、
14、暗视野、相差、微分干涉显微镜的观察效果；2、分别标定4倍、10倍、40倍物镜下，一格目镜测微尺所代表的长度；3、绘制洋葱表皮细胞形态图，并测量一个细胞的长、宽。实验二 叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的： 1、通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。 2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,初步掌握荧光显微镜的使用方法。 二、实验原理:将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度,也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中,同一时间内,密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心
15、时间,就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小 、密度先后分批沉降在离心管底部,分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后,在3000r/min的条件下离心5min,即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在05的条件下进行;如果在室温下,要迅速分离和观察 。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入
16、激发态,从激发态回到基态时,就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光),这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光,称为自发荧光(或直接荧光),如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光,但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光,这种荧光称为次生荧光(或间接荧光),如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时,将受到许多因素的影响,如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。 三、实验用品:(一) 试剂:0.35mol/L氯化钠溶液, 0.01% 吖啶橙(
17、acridine orange)。(二) 用具：普通离心机 普通光学和荧光显微镜 研钵 纱布 玻璃漏斗 烧杯(100ml) 载玻片 盖坡片 台秤等 四、实验材料: 新鲜菠菜 五、实验内容和方法: (一)叶绿体的分离 1、选取新鲜的嫩菠菜叶,冼净擦干后去除叶梗及粗脉,称20g剪成12cm小块, 加入40ml 0.35mol/L NaCl溶液在瓷研钵中充分研碎。 2、将匀浆用6层纱布过滤于100ml烧杯中。 3、取滤液5ml在1000转/min下离心2min。弃去沉淀。 4、将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液,沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。 5、将沉淀用0.35mol/L
18、NaCl溶液悬浮。 (二)叶绿体的观察 取叶绿体悬浮液一滴滴于载片上,加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜 下观察。光镜下观察，注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。取叶绿体悬浮液一滴滴在无荧光载片上,再滴加一滴0.01% 吖啶橙荧光染料加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。六、 作业:绘制叶绿体的图形,并鉴定叶绿体是否纯净,分析其原因。 七、附录:离心机使用过程中g与rpm的换算 在离心分析中,有时用离心力(g)表示某种组分所需要离心力大小,而有时用每分钟转数(rpm)。标准的表示方法是用g,因为每分钟转数因离心机旋转时半径不同
19、会有差异, 二者可以用下列测算表或公式换算： 1)离心力(g)与离心机转速测算表r为离心机转轴中心与离心套管底部内壁的距离；rpm(revolution per minute)为离心机每分钟的转数；RCF(relative centrifugal force)为相对离心力，以地心引力，即重力加速度的倍数来表示，一般用g表示。 利用上表，已知离心机r和g就可求出rpm；反之，r和rpm已知，也可求出g。例如，在r标尺上取已知的r半径值和在g标尺上取已知相对离心力值，这两点间线的沿长线在rpm标尺的交叉点即为rpm。 注意，若已知的g值处于g标尺的右边，则应读取rpm标尺的右边数值，否则反之。 2
20、) 相对离心力与离心机转速换算公式: g=1.1210 -5(rpm)2 r 实验三 DNA的提取一、实验目的：通过本实验了解核酸提取的基本操作及原理。二、实验的用品：（一）试剂：1研磨缓冲液含0.45M NaCl，0.045M柠檬酸三钠（即3SSC），0.1M EDTA，1% SDS（十二烷基硫酸钠）PH7.0。25M高氯酸钠溶液。3氯仿。4异戊醇。595%的预冷乙醇。60.1SSC溶液（0.015M氯化钠加上0.0015M柠檬酸三钠盐溶液，PH7.0）710SSC溶液（1.5M氯化钠加上0.15M柠檬酸三钠盐溶液，PH7.0）。8RNA酶溶液：RNA酶在0.15M氯化钠溶液（PH5.0）中
21、溶解，并在 80水浴中保温10分钟，以灭活可能染的DNA酶。然后冷却，在低温下保存备用。（二）实验用具：恒温水浴锅、研钵、磨口三角瓶、离心机、细口吸管、移液管、烧杯等。三、实验材料：韭菜、玉米幼苗或豌豆幼苗四、实验方法和步骤：1称取韭菜叶或室内萌发的玉米幼苗或豌豆幼苗（事先洗净，除去水分）20g，剪碎后放在研钵内，加入30ml的研磨缓冲液，然后剧烈研磨，使之成为浆状物。（量浆状物的体积为V1）2将这种浆状物倒入一个磨口三角瓶内，加等体积的氯仿异成醇 （24：Iv/V）混合液，加上瓶塞，剧烈摇晃30秒钟，以脱除组织蛋白质。3在室温下离心（4000rpm）5分钟，这时混合物会形成三层，用细口吸管小
22、心地吸取上层含有核酸的水溶液（量含有核酸的水溶液体积为V2），弃去中间的细胞碎片，变性蛋白质层及下层的氯仿。4将收集的水溶液倒入一个在70水浴中预热的三角瓶中，并在70下继续保温34分钟（不要超过4分钟），以灭活组织内DNA酶，然后迅速取出三角瓶，放在冰水浴中冷却到室温。5加入5M高氨酸钠溶液（4：1 V2/V），使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1M。6再次加入等体积（V2）的氯仿-异戊醇（24：1 v/V）混合液，并在带塞的三角瓶内摇晃30秒钟。7将此乳浊液在室温下离心（4000rpm）5分钟后，并收集上层含核酸的水溶液。（量含核酸的水溶液的体积为V3）8将收集的水溶液置于烧杯内，然后用滴管慢慢
23、地加入二倍体积V3的95%的预冷过的乙醇于水溶液表面上，用玻璃棒轻轻搅动，此时核酸将迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上（此时当DNA不能形成或不完全形成纤维状沉淀时，可采用离心法收集絮状沉淀物。）9将核酸沉淀物在烧杯壁上轻轻挤压以除去乙醇，然后溶解在适量的0.1SSC溶液中。待完全溶解后，加入此溶液十分之一体积的10SSC溶液，使之最终成为1SSC溶液。10按照（8）的步骤，再次用乙醇沉淀核酸，并且按（9）的步骤将核酸溶解，即得到DNA的粗制品。11加入RNA酶溶液使其最后作用的浓度为50-75g/ml，并在37下保温30分钟，以除去RNA。12加入等体积的氯仿-异戊醇溶液（24：1 v/V），在
24、三角瓶内摇晃30秒，再次除去残留蛋白质及所加的RNA酶。然后，按照（7）的方法离心并收集上层水溶液。13按照（8）再次沉淀DNA，并按照（9）的程序将其溶解，即可得到纯化的DNA溶液。实验四 Feulgen反应一、 实验目的：掌握 Feulgen反应的原理和关键步骤，观察DNA在细胞中的分布。二、实验原理： 经弱酸(1mol/L HCl)水解,DNA上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开,使脱氧核糖的一端形成游离的醛基,这些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)反应,形成紫红色的化合物,使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生,是由于反应产物的分子内含有醌基,醌基是一个发色
25、团,所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理,抽提去细胞中的DNA而呈现阴性反应,从而可以证明Feulgen反应的专一性。 三、实验用品：(一) 试剂 1、Carnoy固定液: 取3份95%酒精加入1份冰醋酸。 2、1mol/L HCl：取比重1.18的浓HCl 82.5ml,加水至1000ml。3、 Schiff试剂 先将200ml蒸馏水煮沸,由火上取下,加入碱性品红1g,充分搅拌,以有助于溶解。待溶液冷却到50时,过滤到磨口棕色试剂瓶中。加入1mol/L HCl 20ml,冷却到25时加入1g偏亚硫酸钾(K2S2O5)或偏亚硫酸钠(Na2S2O5)充分振荡后盖紧瓶塞,放于暗处过夜
26、。次日取出,试剂呈淡黄色或近于无色,加中性活性炭一匙,约0.5g,剧烈振荡1min,过滤后即得无色品红。 无色品红配成后须塞紧瓶塞。外包黑布或黑纸,贮存在冰箱或黑暗低温处。 4、亚硫酸水溶液(漂白液)取10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml,蒸馏水100ml和1mol/L HCl 5ml,混合后摇匀。塞紧瓶塞。此溶液在使用前配制,否则会因SO2的逸出而失效。 (二)用具: 恒温水浴锅 显微镜 镊子 刀片 载玻片 盖玻片等 四、实验材料:玉米根尖 五、实验步骤：1、 取0.51cm长的根尖,在Carnoy固定液中固定224小时。固定时在冰箱中进行效果较好。2、 取出固定材料 ,用50%酒精、30%酒精,
27、蒸馏水各冲洗5分钟,以除掉材料上的醋酸。3、 水解:用1mol/L的冷HCl过洗材料一次,然后放入温度稳定在60的1mol/L HCl中 ,水解1014分钟 ,取出材料后再用1mol/L冷HCl过一次。4、 染色:将水解后的材料放入Schiff试剂中染色30分钟 ,此时根尖部分 会出现紫红色。5、 用SO2水漂洗三次,每次5分钟,使细胞质的紫红色退掉。漂洗后的材 料放入蒸馏水中。 6、将材料移到载玻片上，滴加45%的醋酸，盖上盖玻片压片。7、 镜检。 对照片方法一：材料按步骤1、2处理后，将其放入5%三氯乙酸中90水浴15分钟，主要把DNA抽提掉，然后按步骤47制片观察。方法二：材料不经1mo
28、l/L HCl水解，直接放在Schiff 试剂中染色，然后按步骤57制片观察。六、 作业：用彩色笔绘出反应结果的细胞图,并说明呈紫红色部分是何种化学 物质？为什么？ 实验五 Brachet反应一、 实验目的：掌握Brachet反应的原理和步骤,观察DNA和RNA在细胞中的分布。二、 实验原理: DNA和RNA在结构上有很多相似之处,但在聚合程度上却有很大差别:DNA的聚合程度较高，而RNA聚合程度较低。在Brachet反应中,采用两种碱性染料甲基绿(methyl-Green)和派罗宁(pyronin)对标本进行染色处理。在染色过程中甲基绿对高聚合的DNA分子有亲合力，DNA被染成绿色；而派罗宁
29、对聚合程度较低的RNA分子有亲合力，RNA被染成红色。三、 实验用品:(一) 试剂1、 Unna试剂的配制 甲液:5%的派罗宁(pyroninG)水溶液 2 ml 2%的甲基绿水溶液 6 ml 蒸馏水 16 ml 乙液: 1mol/L pH4.8的醋酸盐缓冲液的配制方法为: A液: 6ml 冰醋酸 + 100ml 蒸馏水 B液: 13.5g醋酸钠 + 100ml 蒸馏水 取A液40ml加B液60ml即为pH4.8的乙液。乙液以现配为好。 甲液和乙液分别保存在4冰箱中备用。用时甲、乙两液混匀即成Unna试剂。2、 丙酮3、 正丁醇4、 二甲苯(二) 用具: 显微镜 染色缸 镊子 载玻片 盖玻片等
30、四、 实验材料: 玉米根尖半薄切片五、 实验内容和方法:1、将载有玉米根尖半薄切片的载玻片浸入Unna试剂中，染色20 分钟。2、 切片用双蒸水清洗 5 秒钟，以洗去多余的染液,但冲洗时间不宜过长,否则派罗宁会被洗掉。然后用滤纸将片子上的水分吸干。3、切片浸入丙酮溶液分色20秒钟。4、切片移入正丁醇和二甲苯混合液（1:1）中20秒钟。5、在纯二甲苯中透明10分钟。6、用加拿大树脂封片。7、显微镜下观察。对照片方法一：切片经5%三氯乙酸90水浴处理15分钟。再经70%乙醇洗片刻，然后按步骤17制片观察。方法二：切片用0.1%RNA酶室温处理10-15分钟。蒸馏水洗,吸干,然后按步骤17制片观察。六、作业:用彩色笔绘出反应结果的细胞图,并注明不同颜色的部位表示有什么物质存在？为什么？七、注意事项:1、 Unna反应也称Brachet反应()。利用Unna反应所得红色显示RNA存在，并不具有专一性，如果只使用派罗宁染色，核也可以染成红色。只有和甲基绿混染，两者发生竞争，核才能被甲基绿染成绿色。2、 派罗宁可以加热助溶。3、 甲基绿因批号
