1、临床生物化学检验与分子诊断学临床生物化学检验与分子诊断学自编实验指导（供五年制医学检验、卫生检验、国境卫生检疫等本科专业使用）广东医学院临床生物化学教研室2010年12月实验一 生物化学检验实验基本操作 1实验二 Hanes作图法测定兔血红细胞过氧化氢酶的Km值 6实验三 凝胶过滤法分离蛋白质 8实验四 PCR扩增DNA 11实验五 分子诊断学实验基本操作及样品蛋白定量 17实验六 Western blot技术：SDS-PAGE 18实验七 Western blot技术：电转移 21实验八 质粒DNA的转化 23实验九 质粒DNA的制备 28实验十 DNA的限制性内切酶酶切分析 34实验十一
2、RT-PCR法钓取小鼠肝脏-actin基因 38实验十二 全血基因组DNA提取 41实验十三 核酸定量 43实验一 生物化学与分子生物学实验基本操作一、实验记录及实验报告的书写 生物化学与分子生物学实验是在生物化学与分子生物学理论及有关理论指导下的实践。实验目的在于经过实践掌握科学观察的基本方法和技能，培养科学思维、分析判断及解决实际问题的能力，培养尊重科学事实和真理的学风和科学态度。当然，通过实验还可以加深和扩大对生物化学与分子生物学理论的认识。 为了达到实验的目的，要求学生在实验前进行预习，通过预习对实验的内容、目的要求、基本原理、基本操作及注意事项有初步的了解；要求学生在实验中合理组织安
3、排时间，严肃认真地进行操作，细致观察各种变化并如实做好实验结果的记录；还要求学生在操作结束后认真进行计算或分析，写好实验报告。（一）实验记录 实验记录应及时、准确、如实、详尽、清楚。 “及时”是指在实验中将观察到的现象、结果、数据及时记录在记录本（或实验指导合适位置）上。回顾性的记录容易造成无意或有意的失真。 实验结果的记录不可掺杂任何主观因素，不能受现成资料及他人实验结果的影响。若出现“不正常”的现象，更应如实详尽记录。 表格式的记录方式简练而清楚，值得提倡使用。如无专用的记录本，可分项记录于实验指导中相应的操作项目之下。记录时字迹必须清楚，不提倡使用易于涂改及消退的笔、墨做原始记录。 完整
4、的实验记录应包括日期、题目（内容）、目的、操作、现象及结果（包括计算结果及各种图表）。使用精密仪器进行实验时还应记录仪器的型号及编号。（二）实验报告 实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。 完整的实验报告应包括实验名称、实验日期、目的要求、实验原理、试剂、仪器设备、操作方法、实验结果、讨论等多项内容。 其中，目的要求、原理、设备、试剂及操作方法等项只要求作简明扼要的叙述，不必也不应将实验指导原版抄录一遍。但对实验的条件、操作要点等实验成败的关键环节应作清楚描述。 实验结果首先是如实记录实验中观察到的现象及各种原始数据，还应包括根据实验要求整理、归纳数据后进行计算的过程及计算结果，
5、包括根据实验数据及计算做出的各种图表（如曲线图、对照表等）。 讨论部分不是对结果的重述，而是对实验结果、实验方法和异常现象进行探讨和评论，以及对实验设计的认识、体会及建议。 一般要有实验结论。结论要简单扼要，以说明本次实验所获得的结果。如在临床生化检验项目中，可评价样本检出值与相应正常值之间的异同及其临床意义。二、仪器操作（一）刻度吸量管： 1选择：使用前应根据需要选择适当的吸量管，其总容量最好等于或稍大于取液量，同时必须看清楚吸量管的刻度读数，以免弄错。 2执管：用拇指及中指持住吸量管的上部，用食指堵住管口及控制流量，刻度数字要向着自己。切忌用大拇指堵住管口，控制流量。 3量取溶液：左手持洗
6、耳球，将吸量管的尖端插入所量取试剂液面下1cm处。用洗耳球的下端出口对准吸量管上口，将液体轻轻吸上，眼睛注视上升液面，当液面上升至所需取量稍高一些刻度时，立即用右手食指按紧管口。 4调准刻度：吸管从溶液中取出后（如标准溶液或粘性较大的液体）都必须用小滤纸片将吸管尖端外部溶液擦干。然后用食指控制流量，使液面缓慢下降至所需刻度时（此时，液体弯月面底部、刻度和视线同在一水平线上），右手食指立即按紧吸管上口，使液体不再流出。 5放出溶液：将吸量管转移至盛所取溶液的容器内，让吸管尖端接触受器内壁，但不能插入受器内原有液体之中，以免污染吸管及试剂。稍稍松动右手食指，使液体自然流出。放液后吸管尖端残留的液体
7、是吹出或不吹出，则视选用吸量管种类要求而定。（二）微量移液器：1使用方法：（1）将吸嘴（Tip头）装在吸液杆上，应套牢避免间隙。（2）依据所需容量旋转“手轮”，使“数轮”显示所需值。（3）轻轻地将推动按钮下压，使推动按钮从“起始位置”推移到“第一停点位置”。（4）手持移液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度为23 cm停留23秒后缓慢放松按钮,即回到“起始位置”，溶液吸入后稍停即可将吸嘴移出液面。（5）将移液器吸嘴置于排液容器内。使吸嘴尖紧贴容器内壁，按压推动按钮至“第一停点位置”，稍停继续按压至“第二停点位置”。同时将吸嘴在容器内壁往复移动几次，排尽溶液。松开按钮移出容器。（6）移液完毕，按压卸尖
8、按钮将吸嘴脱卸。2使用注意事项：（1）必须根据设计容量选用适当型号的移液器，调整“数轮”的读数不得超过其标称的容量范围，否则使螺旋拧出壳体造成计数结构损坏。（2）吸不同类型的溶液应更换吸嘴，以防止试样之间的交叉污染。（3）新吸嘴在使用前应吸、排溶液几次，浸渍吸嘴以消除测量误差。（4）移液器吸液后严禁倒置、平放，以免溶液流入内腔，损坏活塞。（5）移液器使用完毕，要将“数轮”调到其标称的最大值，否则时间久会使内腔的弹簧变形，导致读数出现较大的误差。（6）长时间不用或刚从箱中取出的新移液器应轻轻用手将推动按钮上下按压几次，再进行正常使用。（三）离心机：1检查各开关是否处于零位，放平机器。2注意离心机
9、的金属（或塑料）离心套管必须完整。管底应垫好软垫（棉花或胶垫）。3离心前将两支装有标本的离心管放入离心套管内，在天平称量，使之重量平衡（要求相差小于0.1g）以免因两侧重量不均造成事故。然后把两支平衡好的离心管连同离心套管一起分别置于离心机对称位置上，以保持平衡。4将离心机盖好。接上电源，开启开关，调节速度旋钮，使电动机的转速逐步加快至所需转速。切不可将转速一下调至最大，以免引起剧烈振动、损坏电机或使离心管破碎。5离心完毕，将调速旋扭逐步降低至零，关上开关，除去电源，任其自行减速，待离心机停稳后方可取出离心物。切勿用手或其他物件强行减速。6使用完毕，必须用干布擦净离心套管内的液体。如有酸、碱沾
10、污，应用水冲洗后再擦干，以免金属离心管被腐蚀、生锈而损坏。7在使用中如发现声音不正常，应立即切断电源，待检查修复后再使用。（四）紫外可见分光光度计： WFZ UV2100型紫外可见分光光度计有透射率、吸光度、已知标准样品的浓度值或斜率测量样品浓度等测量方式，可根据需要选择合适的测量方式。该光度计设有开机自检功能，自检后波长自动停在546nm，测量方式自动设定在透射率方式（T），并自动调100T和0%T。 在开机前，需先确认仪器样品室内是否有物品挡在光路上，光路上有阻挡物将影响仪器自检甚至造成仪器故障。 无论选用何种测量方式，都必须遵循以下基本操作步骤。1连接仪器电源线，确保仪器供电电源有良好的
11、接地性能。2接通电源，至仪器自检完毕，显示器显示“546nm 100.0”即可进行测试。3用键设置测试方式：透射率(T)，吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和己知标准样品斜率（F）方式。4用波长设置键，设置测定波长。每当测定波长改变时，必须重新调整0A/100%T。UV-2100型光度计特别设计了防误操作功能：当波长被改变时，第一排液晶屏会显示“BLA”字样，提示下步必须调0A/100%T，否则仪器将不会继续工作。5根据设置的测定波长，选择正确的光源。光源的切换位置在335nm处。正常情况下，仪器开机后，钨灯和氘灯同时点亮。为延长光源灯的使用寿命，仪器特别设置了光源灯开关控制功能，测定
12、波长在335nm-1000nm时，应选用钨灯。6打开样品室盖，将盛有溶液的比色杯分别插入比色杯槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第一个槽位中。仪器所附的比色杯，其透射率是经过配对测试的，未经配对处理的比色杯将影响样品的测试精度。比色杯透光部分表面不能有指印、溶液痕迹，被测溶液中不能有气泡、悬浮物，否则也将影响样品测试的精度。7将参比样品推（拉）入光路中，按“0A/100%T”键调0A/100%T，此时液晶屏显示的“BLA”直至“100.0”或“0.000”为止。8当仪器显示器显示出“100.0”或“0.000”后，将被测样品推（拉）入光路，此时液晶屏显示被测样品的透射率或吸光度值，接
13、着拉动拉杆使第二、第三比色杯对准光路，按相同的方法读取数值。9测定完毕，将每个开关复原或关闭。取出比色杯洗净晾干。注意事项：1分光光度计为贵重的精密仪器、要防震、防潮、防光和防腐蚀。 防震：仪器应放在固定的平稳台上，不要随意搬动，旋转旋钮时，不可用力过猛，以防损坏机件。 防潮：光电池受潮后，灵敏度下降，甚至失效。光电池附近应放置硅胶，仪器应放在干燥的地方。 防光：光电池平时不应受光照射。使用时要防止强光照射，防止长时间的连续照射。 防腐蚀：使用时要防止酸碱等物质侵入机件内部。盛装待测液时，达到比色杯3/4左右即可，不宜过多，以防溶液流出杯外。移动比色杯架拉杆时动作要轻柔，以防溶液溅出、腐蚀机件
14、。2不可用手、滤纸和毛刷等摩擦比色杯的光滑面，移动比色杯时，应手持比色杯的磨面。比色杯用完后立即先用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净、晾干。每台分光光度计比色杯为本台专用，不可与其他分光光度计的比色杯互换。实验二 Hanes作图法测定兔血红细胞过氧化氢酶的Km值【原理】本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：2H2O22H2O+O2 H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。2KMnO45H2O23H2SO4 2MnSO4K2SO45O28H2O求出反应前后H2O2的浓度差并计算出反应速度。用Hanes作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。Hanes作图法：将米氏方
15、程式变换为S/V=Km/Vmax + S/Vmax 形式，计算出相关数值后，以S/V为纵坐标，S为横坐标作图，直线在横轴上的截矩即为Km。【试剂】 10.05 mol/L草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100105 烘12 h。冷却后，准确称取0.67 g，用水溶解倒入100 ml容量瓶中，加入浓H2SO4 5 ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。 2约0.02 mol/L KMnO4储存液 称取KMnO4 3.4 g，溶于1000 ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。 30.004 mol/L K
16、MnO4应用液 取0.05 mol/L草酸钠标准液20 ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4 1 ml，于70 水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004 mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。 4 0.08 mol/L H2O2液 取约20% H2O2（AR）用0.004 mol/L KMnO4标定出准确浓度后，稀释至所需浓度。50.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。取0.2 mol/L Na2HPO4溶液610 ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液390 ml，均匀混合，可得pH7.0的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液10
17、00 ml.625% H2SO4 溶液7稀释血液 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1 ml，用蒸馏水稀释至10 ml，混匀。取此稀释血液1.0 ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2 mol/L)稀释至10 ml，得1:1000稀释血液。【操作步骤】取干燥洁净50 ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。加入物(ml)12345H2O2(约0.08 mol/L)0.501.001.502.002.50蒸馏水3.02.502.001.501.00 室温下摇匀，每瓶依次加入1:1000稀释血液0.5 ml，边加边摇，37 保温准5 min，按顺序向各瓶加25% H2SO4 2.0 ml，边加边摇，使酶促
18、反应立即终止。最后用0.004 mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量(ml)。 注意事项1硫酸的浓度较大，小心不要溅出。2作图应该用坐标纸，标明有关参数。3滴定操作：（1）使用滴定管前要先检查滴定管是否漏水或有堵塞。（2）滴定管使用前要润洗（加KMnO4至刻度线24 ml处）。（3）使用时，不能左右推动活塞（要以环指顶住管壁，拇指、食指和中指控制流量。（4）加滴定液时，液面要稍高于0，尔后排除尖端气体。（5）读数时，视线要与弯月面平行。实验三 凝胶过滤法分离蛋白质【原理】凝胶是不溶于水，在水中却有较大膨胀度和较好的分子筛功能的一类化合物。目前主要有葡聚糖凝胶（商品名为S
19、ephadex），天然琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-Gel），其后还发展了凝胶的各种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖（CM-Sephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖（DEAE- Sephadex）等种类。凝胶过滤就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种色谱技术，当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛作用，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用，本实验高铁血红蛋白分子量大，不易渗入网络，被排阻在凝胶颗粒之外，因而所受到阻滞作用小，先流出色谱床。高铁氰化钾(K3Fe(CN)6分子量小，能渗透到网络的内部，洗脱流
20、程长，因此所受到的阻滞作用大，后流出色谱床，这样就可以达到分级分离的目的。在含有血红蛋白(Mw64 500)加入过量的高铁氰化钾(K3Fe(CN)6，Mw327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的目的。【试剂】 1抗凝全血 2四氯化碳(CCl4) 3生理盐水 4交联葡聚糖G-25(细粒) 50.1mol/L磷酸缓冲
21、液(pH7.0) 60.4% K3Fe(CN)6 【操作步骤】 1凝胶准备 称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60ml溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。 2装柱 取玻璃层析柱(25cm1.5cm)一支，垂直装好。加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液约2cm左右高，将平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至离柱上端管口约5cm左右时为止。床面上覆盖3ml缓冲液，
22、关闭出口，使层析柱稳定510min后，打开出口，用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。 3样品处理 （1）血红蛋白溶液的制备 取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3 000r/min离心5min，弃去上清液，重复洗3次。最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加1/2体积CCl4，用力振摇3min，3 000r/min离心5min。吸取上层澄清的血红蛋白液备用。此溶液中Hb浓度约为10%(置4暂存，一周用完)。 （2）样品 血红蛋白液3滴加K3Fe(CN)6 8滴和蒸馏水2滴混合，制成MetHb混合样品。 4上样、洗脱 打开
23、平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口。吸取混合样品0.5ml左右，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加入，切勿搅动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同上加入12倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液，但注意切勿搅动床面凝胶，然后人工添加洗脱液(保持液面距柱床面距离不少于2cm)进行洗脱。 5分部收集 用小试管，以5滴/min，10滴/管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱下来后(一般收集到67管)，关闭出口。6测定 将每管收集液加入蒸馏水
24、2ml，混匀，在425nm处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图谱。7回收凝胶 加入12倍柱床体积的洗脱液洗柱，将凝胶倾出至原来盛胶的烧杯中，加约2cm高磷酸缓冲液浸泡。【注意事项】1装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。2流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。3上样时一定要靠近凝胶柱表面、沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面。样品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层。4收集要及时，不能等红褐色物质流出之后再收集。5尽量保持各管收集的液量一致。6洗脱过程中要防止凝胶柱洗脱液流干。7洗脱完成后凝胶要回收，
25、勿丢弃。实验四 PCR 扩增DNA【原理】PCR即聚合酶链式反应，它是近年来发展起来的一种体外特异性DNA 扩增技术。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法，该技术可用于：与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段；利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。 基因的体外突变 在PCR技术建
26、立以前，在体外对基因进行各种突变是一费时费力的工作。现在，利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板DNA的含量要求很低，是DNA和RNA（RNA需要先反转录成为cDNA）微量分析的最好方法。理论上讲，只要存在一分子的模板，就可以获得目的片段。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分3步：变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要
27、复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达21067拷贝。蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶。它是由两个催化亚基(或)和两个调节亚基()构成的不均一四聚体。通过RT-PCR可从人的肿瘤细胞中扩增出人的CK2亚基cDNA，通过与pT7
28、-7载体定向克隆并经测序确证得重组人蛋白激酶CK2亚基cDNA质粒（pTCKB，3087 bp）。本实验利用此重组质粒pTCKB作为DNA的扩增模板，加入人蛋白激酶CK2亚基cDNA的上游和下游引物和4种dNTP底物，在Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。理论上扩增的PCR产物大小为672bp。【试剂与器材】1上游引物: 5 AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT 3，其序列含人蛋白激酶CK2亚基cDNA编码区起始的20个核苷酸，其5端含NdeI酶切位点。浓度为 5 pmol/l即5 mol/L，25l反应液中加12.5 pmol。2下游引物: 5 AAGGATCCAA
29、GCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGG 3，与人蛋白激酶CK2亚基cDNA编码区最后21个核苷酸互补，其5端含Hind酶切位点。浓度为5 pmol/l即5 mol/L，25l反应液中加12.5 pmol。3DNA模板：重组人蛋白激酶CK2亚基cDNA质粒(pTCKB，3087 bp)，浓度为1ng/l，25l反应液中加5ng。410buffer浓度（购买Taq酶有配套的Buffer）: 500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-Cl，pH9.0，1% Triton-X 100510MgCl2 即25 mmol/L。6dNTP 2.5 mmol/L 分别取等体积的1
30、0 mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP四种混合即成7Taq DNA聚合酶（国产或进口）：浓度为5 U/l，50l反应液中加1 U,临用前用消毒双蒸水稀释为0.5 U/l。8消毒三蒸水96载样缓冲液 0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油。10SYBRGreen I荧光染料 为避免溴化乙锭（EB，此试剂为强致癌物）的污染，本实验指导中所有涉及DNA的染色均用SYBRGreen I荧光染料（参看后面所附的知识介绍）代替传统的EB染料。从试剂公司购买的SYBRGreen I原液是无水DMSO配制的10 000倍浓缩液，将浓缩液用DMSO稀释50倍后，取60l加入1
31、 ml 6载样缓冲液中，每5l DNA样品加1l含SYBRGreen I荧光染料的载样缓冲液，电泳后可直接于紫外分析仪上观察结果，激发光最好用254 nm紫外光以获得最高灵敏度。上述SYBRGreen I荧光染料的10 000倍浓缩液及用DMSO稀释50倍的稀释液须避光保存于-20 ，含SYBRGreen I荧光染料的6载样缓冲液须避光保存于4 。11含SYBRGreen I荧光染料的6载样缓冲液 配制方法见上，也可参考实验十一。1250TAE 电泳Buffer 12.2 g Tris，2.85 ml 冰醋酸，10 ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50 ml。13DNA Marker 14各种国产或进口移液器(10，20，100l)15消毒的0.2ml PCR管，10l，100l tips16小型离心机17PCR仪18水平电泳槽和电泳仪19紫外
