1、生物工程下游技术教案第四章第四章 萃 取一、 本章基本要求：（1）掌握溶剂萃取法的基本理论、工艺过程以及基本的计算；（2）掌握双水相萃取的一般方法；（3）掌握反胶束溶液形成的条件及反胶束萃取的适用范围；（4）掌握超临界的萃取原理；（5）了解溶剂萃取法所用设备；（6）了解影响双水相萃取的因素；（7）了解SC- CO2萃取流程在及在生物、食品工业中的应用。二、教学的重点和难点：重点：超临界的萃取原理；反胶束萃取蛋白质的基本原理及影响反胶束萃取蛋白质的主要因素；双水相萃取理论及影响因素；溶剂萃取过程的理论基础及萃取剂的选择。难点：超临界的萃取原理；反胶束萃取蛋白质的基本原理；双水相萃取理论；溶剂萃取
2、过程的理论基础三、主要教学设计（方法、手段等）：本章第一次课对本章的内容做一大致介绍，以一张萃取的分类图表示。每次课之前5分钟对上次的内容进行复习，以加深学生印象。对本章的内容主要是用讲述的形式，中间以提问的形式加强有力互动和提高学生的注意力，每小节给予一定的思考题。四、学时分配：1. 溶剂萃取和浸取（4学时）2. 双水相萃取法（2学时）3. 反胶束萃取法（2学时）4. 超临界CO2萃取（2学时）五、参考资料及补充习题：思考题：1、何谓溶剂萃取？其分配定律的适用条件是什么？3、何谓乳化液？乳化液稳定的条件是什么？常用去乳化方法有那些？4、在发酵工业中，去乳化有何实际意义？ 5、类固醇萃取：含有
3、6.8mg/l类固醇的水溶液被二氯甲烷提取,已知类固醇的平衡常数为170,萃取中水与溶剂的比例为82,问提取后有机相的浓度是多少?类固醇被提取的收率是多少?6、比较溶剂萃取与浸取的异同点？7、生物萃取与传统萃取相比的特殊性。8、描述浸出的基本过程？9、溶剂萃取、反萃取、浸取、乳化、分离因素、表面活性剂10、已知弱酸和弱碱在水相中的电离平衡Kp，由下图试推导出K和K0、KP的关系式可经理论推导如下：K=K0H+/（ KP +H+）（弱酸）K=K0KP /（ KP +H+）（弱碱）11、某澄清的发酵液中含260mg/l放线菌D,现用醋酸丁酯进行多级萃取。已知平衡常数K=57.0，料液流量450升/
4、时，有机相流量20升/时。为达到此抗生素收率为98%的要求，需要多少级的萃取过程？1、何谓双水相萃取？2、双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两种？3、为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分离？4、影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，PH是如何影响双水相萃取的？5、用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分布在下相，为什么？什么是反胶团？反胶团的微小界面和微小水相具有哪两个特异性的功能？为什么说反胶团萃取技术对于活性蛋白质的分离是一条具有工业应用前景的新技术？（优点）反胶团的制备方法？影响反胶团萃取蛋白质的主要因素反胶团萃取的特点
5、？1、超临界流体、拖带剂、临界温度、临界压强2、SC-CO2为何有较好的物质萃取能力？3、SC-CO2的萃取工作区为何通常选在临界点附近？4、SC-CO2的优点？5、超临界流体的萃取（Supercritical Fluid Extraction, SFE）原理？ 生物工程下游技术 课 程 教 案教 案 内 容教学设计第一节 溶剂萃取和浸取一、溶剂萃取的概述二、工业萃取方式和理论收得率三、乳化和去乳化四、萃取设备简介五、浸取一、溶剂萃取法概述溶剂萃取：利用一种溶质组分（如产物）在两个互不混溶的液相（如水相和有机溶剂相）中竞争性溶解和分配性质上的差异来进行分离操作的。如抗生素、有机酸、维生素、激素
6、等。优点：比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快；比蒸馏法能耗低；生产能力大、周期短、便于连续操作、容易实现自动化。萃取操作不仅可以提取和增浓产物，还可以除掉部分其它类似的物质，使产物获得初步的纯化。一、溶剂萃取法概述溶剂萃取法+新型分离技术超临界流体萃取、反胶团萃取、双水相萃取广泛用于天然物质、胞内物质（胞内酶、蛋白质、多肽、核酸）的分离提取。一、溶剂萃取法概述1、溶剂萃取的应用生物产品溶剂萃取的典型应用主要在二个方面:从发酵培养液中萃取化合物（产物）萃取的目标产物是在微生物细胞发酵期间或者微生物细胞生长时产生的，但是也不完全如此，被萃取的产物释放在发酵培养基中，溶剂萃取过程的
7、主要目的是将化合物从细胞释放的其他类似物中有效地分离出来。从生物液或生物转化液中萃取产物，在这种情况下，是利用不同纯化度的细胞或酶来进行生化反应，使底物转化为目标产物，其溶剂萃取过程与发酵液中的萃取情况不同，它是从未反应的底物中分离反应得到的产物。一、溶剂萃取法概述溶液萃取过程2、溶液萃取过程实验室液液萃取过程（见课件图）溶剂萃取法的萃取原理是以分配定律为基础的。溶剂萃取法是利用液体混合物各组分在某有机溶剂中的溶解度的差异而实现分离的。在溶剂萃取中，被提取的溶液称为料液，其中欲提取的物质称为溶质，用以进行萃取的溶剂称为萃取剂。经接触分离后，大部分溶质转移到萃取剂中，得到的溶液称为萃取液，而被萃
8、取出溶质的料液称为萃余液。生物萃取与传统萃取相比的特殊性 组分与相复杂 传质速率不同（质量的传递受可溶的和不溶的表面活性组分影响） 相分离性能不同（不溶性固体和可溶性表面活性剂的存在，对相分离的速率产生重大的不利影响） 产物的不稳定性萃取的基本概念萃取：是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。 反萃取：溶质从萃取剂转移到反萃剂的过程。物理萃取和化学萃取：物理萃取的理论基础是分配定律（相似相溶，萃取剂和溶质间不发生化学反应）；化学萃取利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生脂溶性的复合分子实现溶质向有机相的分配。在溶剂萃取分离过程中，当完成萃取操作后，为进一步纯化目标产物或便
9、于下一步分离操作的实施，往往需要将目标产物转移到水相。这种调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的操作就称为反萃取（Back extraction)萃取过程的理论基础：不同溶质在两相中分配平衡的差异。在常温下为常数；的单位通常用mol/L或质量单位/mL 3、萃取过程的理论基础分配定律K-分配系数应用前提条件：（1） 稀溶液（2） 溶质对溶剂之互溶度没有影响（3） 必须是同一分子类型，不发生缔合或离解分配定律推导（见课件）弱酸青霉素在水相存在电离平衡，不符合应用条件（3） 设有机溶剂相的青-COOH浓度为C1。水相中青-COOH和青COO-的总浓度为C2（电离平衡），目前的测定方法不能单独测
10、出水相中游离酸的浓度。所以k表观分配系数表示（K=C1/C2）。弱酸or弱碱性溶质的分配定律K和K0、KP的关系式可经理论推导如下：K=K0H+/（ KP +H+）（弱酸）K=K0KP /（ KP +H+）（弱碱） 由此可见，溶质在不互溶两相中的分配与萃取剂（决定K0）有关，也与水相的性质（如H+ ）有关。分离因素（）如果原来料液中除溶质A以外，还含有溶质B，则由于A、B的分配系数不同，萃取相中A和B的相对含量就不同于萃余相中A和B的相对含量。如A的分配系数较B大，则萃取相中A的含量（浓度）较B多，这样A和B就得到一定程度的分离。萃取剂对溶质A和B分离能力的大小可用分离因素（）来表征：C浓度，
11、下标1、2分别代表萃取相和萃余相，A，B为溶质。4、水相条件的影响（1）pH值 影响表观分配系数。对选择性也有影响。如青霉素在pH2时，醋酸丁酯萃取液中青霉素可达12.5%，而在pH3时萃取，可降低至4%。（2）温度（一般在室温或低温进行） 影响生化物质的稳定性；分配系数K。（3）盐析 无机盐类如硫酸铵（如提VB12时）、氯化钠（如提青霉素时）一般可降低产物在水中的溶解度而使其更易转入有机溶剂相中。（4）带溶剂 （指能和产物形成复合物，使产物更易溶于有机溶剂相中，且复合物在一定条件下易分解），如青霉素可与脂肪碱（如四丁胺）形成复合物溶于氯仿中二、工业萃取方式和理论收得率工业上萃取操作包括三个步
12、骤：（1）混合 料液+萃取剂形成具有比表面积很大的乳浊液产物（料液）产物（萃取剂）。（2）分离 乳浊液萃取相+萃余相（3）溶媒回收 从萃取及萃余相（有少量有机剂混溶）中分离并回收有机剂。故须有混合器（如搅拌混合器）、分离器（如碟片式离心机）和溶剂回收装置（如蒸馏塔）。1、单级萃取单级萃取流程示意图（见课件图）单级萃取计算2、多级错流萃取多级错流萃取设备（三级）特点：每级均加新鲜溶剂，故溶剂消耗量大，得到的萃取产物平均浓度较稀，但萃取较完全。例：利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌D，pH=3.5时分配系数K=57。采用三级错流萃取，H=450L/h，三级萃取剂流量之和为39L/h。分别计算L1=L
13、2=L3=13L/h和L1=20，L2=10，L3=9L/h时的萃取率。 H为料液流量。解：萃取剂流量相等时E=1.65，由上式可得1-3=0.946。若各级萃取剂流量不等，则E1=2.53，E2=1.27，E3=1.14，由上式得1-3=0.942多级逆流萃取在多级逆流萃取中，在第一级中加入料液，并逐渐向下一级移动，而在最后一级中加入萃取剂，并逐渐向前一级移动。特点：料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故称为逆流萃取。在逆流萃取中，只在最后一级中加入萃取剂，故和错流萃取相比，萃取剂之消耗量较少，因而萃取液平均浓度较高。工业上除非特殊理由，否则应采用多级逆流萃取。 多级逆液萃取计算公式推导对
14、n-1级有对第n级就有Q1=E-1/（En+1-1）Qn+1未被萃取的分率:n= Q1 / Qn+1 =E-1/（En+1-1）例子：设上例中操作条件不变（L=39/h），计算采用多逆流萃取时使收萃取率为99%时所需的级数。H为料液流量。解：可得E=KL/H=4.69；因为收率为99%，即n=1%，由上式可得n=2.74，故需3级操作。三、乳化与去乳化1、乳化：一种液体（分散相）分散在另一种不相混溶的液（连续相）体中的现象。2、乳浊液的形成当将有机溶剂（通称为油）和水混在一起搅拌时，可能产生两种形式的乳浊液。一种是以油滴分散在水中，称为水包油型或O/W型乳浊液；另一种是水以水滴分散在油中，称为
15、油包水型或W/O型乳浊液。见课件中图3、乳浊液的稳定条件和乳浊液的类型乳浊液稳定性和下列几个因素有关：界面上保护膜是否形成；液滴是否带电；介质的粘度。其中以第一个因素最重要。如上所述，表面活性剂分子聚集在界面上，在分散相液滴周围形成保护膜。保护膜应具有一定的机械强度，不易破裂，能防止液滴碰撞而引起聚沉。介质粘度较大时能增强保护膜的机械强度。4、HLB（亲憎平衡值）表面活性剂的亲水与亲油程度的相对强弱，在工业上常用HLB数来表示。它最早由经验得来，现在有一些经验公式用来计算，也可用实验方法测定。HLB数即亲水与亲油平衡程度，HLB数越大，亲水性越强，形成O/W型乳浊液，HLB数越小，亲油性越强，
16、形成W/O型乳浊液。5、去乳化1）生物类料液引起的乳化现象 原因：蛋白质是一种天然乳化剂；种类：大多形成W/O型2）去乳化的方法物理法（加热、稀释、吸附等）；化学法（加电解质中和离子型乳浊液的电荷）；过滤或离心分离破乳法；顶替法（加入表面活性更大，但因其碳链较短难以形成坚固的保护膜的物质，取代界面上的乳化剂，如戊醇）；转型法（如在O/W中加入亲油性乳化剂，使乳化液有生成W/O倾向，但又不稳定，从而达到破乳化的目的）。四、萃取设备简介1、单级萃取设备：混合器（搅拌）分离器（离心机）缺点：因料液和萃取剂不互溶，会形成乳浊液，自然分层时间很长。2、多级萃取设备萃取塔不是用混合器和分离器组合（投资大，
17、操作繁琐）（1）脉动筛板塔过程轻相：底上 重相：上下分相散：液体分布器（如喷嘴）分散成细液滴进入连续相。强化混合：底部连脉动器，使塔内液作往复运动，类似搅拌作用，使分散相细碎而均匀。特点：适合于处理量较小（A-B 相分离（2）A-AA-A 凝聚复合5、两水相体系类型两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）6、相 图（见课件中图）理解：双结线(TKB)；结点(T/B)；临界点(K)；系线(TB)上相（T，轻相）；下相（B，重相）当
18、M点下移时，系线长度缩短，两相差别减小，到K点时，系线长度为0，两相差别消失而成为一相。双结线的位置和形状与相对分子质量有关。（见课件图）Dex的分子量越高，相分离所需的浓度越低；两种聚合物相对分子量相差越大，双节线越不对称。7、杠杆定律由于相的密度与水的密度相近，上式常被简化，因此相体积比可由相图上的线段比估算，如下式。VT/VB=BM（B点与M点之间的距离）/MT（M点与T点之间的距离）二、物质在两相中的分配1、表面自由能的影响分子或粒子在溶液中的分配，总是选择两相中相互作用最充分或系统能量最低的那个相。根据相平衡时化学位相等的原则，可以得出分配系数K服从Brownstedt方程式：M为物
19、质相对分子质量； 为系统的表面特性系数；k 为波尔兹曼常数；T为温度从上式可知：因大分子物质的M值很大，的微小变化就可引起分配系数很大的变化。因此，利用不同的表面性质（表面自由能），可以达到分离大分子物质的目的。2、表面电荷的影响理解道南电位注意：表面自由能可用来量度表面的相对憎水性，改变成相聚合物的种类。聚合物的平均分子量和相对分子质量分布，都能影响相的疏水性。3、影响分配的因素(1)双水相中聚合物（组成和浓度）的影响 Dextran 分子量（粘度高，价格）。 PEG分子量 密度，密度差，粘度，粘度差，表面张力。 上述参数随聚合物浓度变化。 如在PEG/Dex双水相体系中，PEG分子量的减少
20、，会使蛋白质在两相中的分配系数明显增大。如课件中图。PEG平均分子量对分配率的影响：聚合物的疏水性对酶等亲水性物质的分配产生较大影响。因为PEG分子量增加，两端羟基数目减少，疏水性增加，使亲水的蛋白转向另一相。Dex的平均分子量对分配率的影响（见课件中图）。（2）体系中无机盐离子的影响（如下表）无机盐离子在两相中的分配不同，会导致两上中的电位差。如课件中图，当pH6.9时，溶菌酶带正电，卵蛋白带负电，对照上表和式（7-6）知，KCl-KNa+，有电位关，U2-U10，导致带正电荷的溶菌酶迁移到1相，其K值增大，而带负电荷的卵蛋白迁移到2相，其K值减少，两者达到较好的分离。（3）体系pH值的影响
21、a) 蛋白质离解基因的离解度改变蛋白质的电荷改变分配系数。b) 缓冲物质磷酸盐的离解度改变电位差分配系数。c) pH的微小变化会使蛋白质的分配系数改变2-3个数量级。如课件中图：测定蛋白等电点的方法交错分配法： 对不同的盐系统，其等电点的分配系统应相等，两条pH和分配系统关系的曲线必交于一点（即为蛋白质的等电点）。（4）体系温度的影响影响相图分配率蛋白质的生物活性。临界点附近，温度对分配率的影响较大，远离临界点时，影响较小。聚合物的多元醇或多糖结构对蛋白质有保护作用，增加了蛋白质的稳定性，故可在室温一操作，且一般温度变化不大。如课件中图。分离上、下相的温度上升不多，说明无冷却系统的室温操作是可
22、行的。（5）体系中微生物的影响影响：上下相体积、胞内蛋白的分配系数。是由细胞破碎程度引起的。因PEG是一种絮凝剂和沉淀剂，故在这个体系中，细胞物质的絮凝和在不同相中的分配同时发生。从而改变了物质的溶液解曲线。三、双水相萃取工艺流程 1、双水相系统的选择a) 相系统应易于静置沉降或离心沉降法进行分离。b) 对胞内蛋白萃取，就使碎片分配于下相中，来增大两相的密度差，达到快速分离，降低操作成本和操作时间。c) 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质的差别，来选择性的萃取目标产物。如调pH、添加盐、提高成相系统的浓度（系线长度）双水相萃取过程放大较容易，一般10mL
23、刻度离心管内结果即可直接放大到产业化规模。具体的实验步骤：a) 配制一系列不同浓度、pH值及离子强度的双水相，每个双水相改变一个参数。b) 加入料液后，再加水使整个系统的质量达到5-10g。离心管封口后充分混合。（反复倒置或涡旋混合器）c) 在1800-2000g下离心3-5min，分相。d) 分别吸出上下相，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性，计算分配系数。e) 分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系统。2、相平衡与相分离相平衡：双水相系统的表面张力很小，相间混合所需能量很低，通过机械搅拌很容易分散成微小液滴，达到相平衡所需时间很短，一般只需几秒钟。相分离：重力沉降（静置分层）或
24、离心沉降法。沉降速率符合Stokes定律。双水相相间的密度差很小。且萃取系统的黏度很大。重力沉降分离细胞碎片需10h以上，且难完全分离；如除去细胞碎片后再进行双水相萃取，测相分离容易得多。如课件图。3、多步萃取（如课件图，经三级萃取可很好的将目标产物分离）4、大规模双水相萃取双水相放大后，溶质的分配系数和相体积比保持不变，溶质的浓度随匀浆液的加入量线性增大。见课件中图连续双水相萃取。四、双水相萃取技术的应用目前广泛应用于蛋白质的分离与纯化。1、胞内酶提取：一般是破碎细胞（匀浆液粘度大，碎片很小）离心分离碎片（能耗大，且碎片不易清除干净）破碎细胞双水相萃取（易除去碎片，同时使酶得到精制）因其他的体系较贵，目前应用最多的是PEG/盐体系。酶主要分配在上相，碎片在下相或界面上，收率能达到90%；料液中湿细胞浓度可达30%，分配系数在3-20之间。如课件中表几种典型双水相提取酶蛋白的例子。例子：以甲酸脱氢酶（FDH）的分步提取纯化来进一步说明胞内酶的提取。（见课件中图）2、核酸的分离及纯化特点：盐组成的微小变化引起分配系数的急剧变动。有活性的DNA与无活性的DNA的分配系数差别较大。可通过10级逆流分配平衡将两者几乎完全分开，如课件中图。3、人生长激素、-干扰素的提取用PEG40006.6%/磷酸盐14%体系从大肠杆
