1、项目整体管理全套资料项目整体管理全套资料(全套资料，可以直接使用，可编辑 优秀版资料，欢迎下载）项目整体管理“整体管理的基本任务就是为了按照实施组织确定的程序实现项目目标，将项目管理过程组中需要的各个各成有效形成整体。1、制定项目章程 项目章程是正式批准项目的文件。该文件授权项目经理在项目活动中动用组织的资源。（1）制定项目章程：依据合同（如果适用）：如果项目是为外部而进行的，则来自顾客采购组织的合同属于依据。项目工作说明书；对于外部项目,工作说明书属于顾客招标文件的一部分。事业环境因素；在制定项目章程时,任何一种以及所有存在于项目周围并对项目成功有影响的组织事业环境因素与制度都必须加以考虑.
2、组织过程资产：在制定项目章程及以后的项目文件时，任何一种以及所有用于影响项目成功的资产都可以作为组织过程资产。任何一种以及所有参与项目的组织都可能有正式或非正式的方针、程序、计划和原则，所有这些的影响都必须考虑.组织过程资产还反映了组织从以前项目中吸取的教训和学习到的知识，如完成的进度表、风险数据和实现价值数据。组织过程资产的组织方式因行业、组织和应用领域的类型而异。（2)制定项目章程:工具与技术项目选择方法项目管理方法项目管理信息系统专家判断（3）制定项目章程：成果项目章程2、制定项目初步范围说明书项目范围说明书确定了项目的范围，即需要完成的诸种事项。项目与产品的目标产品或服务的要求与特性产
3、品验收标准项目边界项目要求与可交付成果项目制约因素项目假设项目的初步组织初步识别的风险进度里程碑初步工作分解结构量级费用估算项目配置管理要求审批要求（1）制定项目初步范围说明书：依据项目章程项目工作说明书事业环境因素组织过程资产（2）制定项目初步范围说明书：工具与技术项目管理方法系项目管理信息系统专家判断(3)制定项目初步范围说明书：成果项目初步范围说明书3、制定项目管理计划 制定项目管理计划过程包括将确定、协调与综合所有部分计划所需要的行动形成文件，使其成为项目管理计划。项目管理计划的内容因项目的应用领域和复杂程度而异。这一过程的结果使项目管理计划通过整体变更控制过程得以更新与修改.项目管理
4、计划确定了执行、监视、控制和结束项目的方式与方法。(1）制定项目管理计划：依据项目初步范围说明书项目管理各过程事业环境因素组织过程资产（2）制定项目管理计划：工具与技术项目管理方法系项目管理信息系统专家判断（3）指定项目管理计划:成果项目管理计划4、指导与管理项目执行指导与管理项目执行过程要求项目经理和项目团队采取多种行动执行项目管理计划，完成项目范围说明书中明确的工作。（1)指导与管理项目执行:依据项目管理计划批准的纠正措施批准的变更请求批准的缺陷补救行政收尾程序（2）指导与管理项目执行：工具与技术项目管理方法系项目管理信息系统(3）指导与管理项目执行:成果可交付成果请求的变更实施的变更请求
5、实施的纠正措施实施的预防措施实施的补救措施工作绩效信息 按常规收集有关为了完成项目工作而进行的项目活动工作状态的信息和数据，属于执行项目管理计划的一部分。工作绩效信息包括但不限于：表明进度绩效的状态信息已经完成与尚未完成的可交付成果已经完成与尚未完成的计划活动已经开始与已经完成的计划活动 质量标准满足的程度批准与已经开始的计划活动的估算绩效过程中的计划活动实际完成百分比吸取并已记录且转如经验教训知识库的教训资源利用的细节5、监控项目工作 监视和控制项目工作过程是监视和控制启动、规划、执行个结束项目所需的各个过程。采取纠正或预防措施控制项目的实施效果。监视是贯穿项目始终的项目管理的一个方面。监视
6、包括收集、测量并散发绩效信息，并评价测量结果和实施过程改进的趋势。连续的监视使项目管理团队能够洞察项目的状态是否正常，并识别任何可能要求给以特别注意的方面。监控项目工作过程的对象是：对照项目管理计划比较项目的实际表现评价项目的绩效,判断是否出现了需要采取纠正或预防措施的迹象，并在必要时提出采取行动的建议分析 、跟踪并监视项目风险,确保及时识别风险，报告其状态，执行适当的风险应对计划建立有关项目产品以及有关文件的准确和及时的信息库,并保持到项目完成为状态报告、绩效测量和预测提供信息支持为更新当前的费用和进度信息提供预测在实施批准的变更时进行监视（1）监控项目工作：依据项目管理计划工作绩效信息否决
7、的变更请求(2）监控项目工作:工具与技术项目管理方法系项目管理信息系统实现价值技术 专家判断（3）监控项目工作：成果推荐的纠正措施推荐的预防措施预测推荐的缺陷补救请求的变更6、整体变更控制 整体变更控制包括下列变更管理活动确定是否需要变更或者变更是否已经发生对妨碍整体变更控制的因素施加影响,保证只实施经过批准的变更 审查和批准请求的变更控制申请变更的流程,在发生变更时管理批准的变更仅允许被批准的变更纳入到项目产品或服务之中，维护基准的完整，并维护项目产品或服务有关的配置与规划文件审查与批准所有的纠正与预防措施建议根据批准的变更控制与更新范围、费用、预算进度和质量要求，协调整个项目的变更。例如，
8、提出的进度变更通常会影响到费用、风险、质量与人员配备将请求的变更的全部影响记录在案确认缺陷补救根据质量报告并按照标准控制项目质量（1）整体变更控制：依据项目管理计划请求的变更工作绩效新鲜推荐的预防措施推荐的纠正措施推荐的补救缺陷可交付成果(2）整体变更控制:工具与技术项目管理体系项目管理信息系统专家判断（3）整体变更控制:成果批准的变更请求否决的变更请求项目管理计划（更新）项目范围说明书（更新)批准的纠正措施批准的预防措施批准的缺陷补救确认的缺陷补救可交付成果7、项目收尾（1）项目收尾：依据项目管理计划合同文件事业环境因素组织过程资产工作绩效信息可交付成果（2）项目收尾：工具与技术项目管理方法
9、系项目管理信息系统专家判断（3)项目收尾：成果行政收尾程序合同收尾程序最终产品、服务或成果组织过程资产（更新)正式验收 ：顾客或赞助人已经正式确认，顾客的要求以及项目产品、服务或成果的技术规定已经满足.项目档案:项目活动产生的文件，如项目管理计划；范围、费用、进度和质量基准；项目日历；风险登记册;规划的风险应对行动，以及风险后果项目收尾文件:项目收尾文件包括表明项目已经完成,完成的项目可交付成果移交,诸如某运营单位等其他人的正式文件。当项目尚未完成就提前终止时，这份正式文件就指明项目终止的原因，并履行正式程序，将取消项目的已完成与未完成可交付成果移交他人。历史信息:历史与吸取的教训信息转移到吸
10、取的教训知识库,供将来的项目使用.病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求.1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1。1。1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体,与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面,Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分
11、裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。1。1。2特点1） 直接包装成为假病毒颗粒,对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞).2） 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。3） 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。4） 无需任何转染试剂，操作简便。5） 可以根据客户需要制备多种标记。1。1.3慢病毒包装简要流程：1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3） 培养
12、48hrs 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4） 病毒的纯化和浓缩。 5） 分装、 80 保存. 6） 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。1.2、腺病毒1。2.1原理腺病毒（Adenovirus，Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。1。2.2特点1） 几乎可以感染所有类型的细胞2） 可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒3） 病毒
13、滴度高,产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。4） 腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单.5) 感染细胞时，不整合到染色体中,不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。腺病毒包装简要流程1） 构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体2) 采用 PacI 消化纯化的质粒.3) 消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。4) 将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒.5) 分装,-80保存。1.3、慢病毒和腺病毒的比较慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较病毒表达系统慢病毒表达系统(Lentivirus）腺病毒表
14、达系统（Adenovirus）病毒基因组RNA病毒双链DNA病毒复制自主复制自主复制是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适用于难转染的原代细胞（如神经细胞)及体内实验感染分裂和不分裂细胞表达风度中水平表达高水平表达表达时间慢(13天）快（12天）滴度滴度最高可达10*8pfU/ml滴度最高可达1011pfU/ml克隆容量可插入不超过8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、构建目的基因到载体2.1构建
15、手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体,酶切，并测序鉴定2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定2。2质粒载体2。2。1概念能够进行自主复制的环状DNA双链结构,包括真核生物的细胞器(主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子2.2.2特征质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等.有些质粒称为附加体(episome），这类质
16、粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制.通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中,通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒,以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。3。1大肠杆菌感受态细胞的制备1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37振荡培养过夜。2）取0。4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中,37振荡培养23h3）菌液转移到50ml离心
17、管中，冰上放置10min4）4离心10min(4000r/min）5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min7）4离心10min（4000r/min）8）倒出上清液,用冰浴的0。1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞,200ul一份，4保存3。2质粒DNA的转化1）取200ul新鲜制备的感受态细胞,加入质粒DNA2ul混匀,冰浴30min2)离心管放到42保温90s3）冰浴2min4)每管加800ulLB液体培养基，37培养1h（150r/min）5)取适当体积(100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基
18、上，正置30min6）倒置平皿37，1216h，出现菌落3。3质粒提取步骤1）取14ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清2）加250ul溶液/RNaseA（溶液为细胞悬浮液)混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。3）加入250ul溶液（细胞裂解液)，轻柔的反复颠倒混匀56次。室温放置12min，使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。4）加入350ul溶液（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀.5）12000室温离心10min，收集上清。6)将上清置于DNA纯化柱中，静置12min。7）12000转离心1min
19、，弃滤液.8）加入500ul溶液PB(洗涤液）12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。9）加入500ul溶液W（去盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。10）12000转离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体.11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50100ul溶液Eluent（为无菌的双蒸水，PH为8。08.5），室温放置2min。12)12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒DNA，质粒于-20保存.质粒提取步骤:吸取液体培养基于1。5ml离心管中12000转离心1min,弃上清，吸取培养基重复
20、离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于20加250ulBufferS1悬浮细菌,悬浮均匀-加250ulBufferS2温和充分的上下翻转46次混合均匀，使菌体裂解加350ulBufferS3温和上下翻转12000离心10min取上清液转移到专用的制备管（2ml）12000转离心1min，弃滤液加500ulBufferW112000转离心1min，弃滤液-加500ulBufferW212000转离心1min，弃滤液，重复一遍-将制备管置回2ml离心管12000转离心1min-将制备管移入新的1.5ml离心管中，加6080ulEluent或离子水，室温1min12000转离心1min
21、移去制备管，将有质粒的离心管于4或是20保存4、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装)4.1名词解释293T细胞是由293细胞派生， 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体,可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。4.2共转染的操作步骤第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度第二天：1。 500ul 无血清培养基稀释2ug 表达质粒+1。5ug psPAX2+1。
22、5ug pMD2。G 2。 500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体20003. 5min后,将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min 4。 从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。5。 6-10h后，移除含有DNA脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10FB（从此刻开始算时间）。第三天：1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上第四天：1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。2.3000 rpm 离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀.3.12000转离心浓缩细胞、分装80C贮存。4。滴度测定目的基因检定
23、，并出具检测报告。4。3病毒包装的原理质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA）,但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒,其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒,通过 lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中,宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组
24、中,完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖,故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。5、慢病毒感染细胞5。1流程图5.2感染步骤1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜2）感染：将7080铺满12孔板中的培养液吸除,换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。3） 24h左右可换液,48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看.5。3荧光显微镜的操作流程打开荧光器(30min内不能关闭，否则影
25、响显微镜寿命),细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈,先用自然光观察视野内细胞，再关闭光,开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率。图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。（针对leica)5。4注意事项内容1.病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。2。感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度,在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基.3。在不明确细胞感染复数情况下,可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。4。在加病毒后一般24h左右可换液,48小时即可看荧光,具体时间根据细胞状态来看。6、感染后的细胞检测方法6.1荧光初步检测若有荧光,则表示
26、病毒感染成功,但并不能确定目的基因是否整合到细胞中,待进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。6。2RNA的提取及RTPCR检测6.2。1原理因为真核细胞DNA含有很多非编码区,真核生物的DNA转录成为RNA之后,经过剪切和拼接,去掉这些非编码区，才能形成真正的mRNA,，是否表达真核生物的基因并表达相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RTPCR这条途径来测定RNA提取步骤加1mlTrizol，吹打后移至1.5ml无菌的离心管中;加100ul氯仿剧烈振荡30s混匀,12000转15min，可看到明显分层;取上层透明液体至新的1。5ml离心管中,加等体积的异丙醇，混匀静置10min，12
27、000转离心10min,弃上清，加1ml70乙醇,12000转，离心10min，弃上清,风干剩余液体，最后加DEPC水溶解RNA,电泳，粗步判定RNA纯度。6。2。3RT-PCR步骤：RT是一个逆转录的过程，用前一天提取好的总RNA，在加入引物，模版和酶,并在PCR仪的温度设置下，RNA可逆转录为cDNA.PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下进行复制成双链DNA.(具体步骤省略）6.3蛋白提取及Western检测westernBloting：蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做 SD
28、S 聚丙烯酰胺凝胶电泳,使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。 第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上, 用得最多的材料是硝酸纤维素膜（NC 膜）和 PVDF 膜, 蛋白转移的方法多用电泳转移 （转移电泳） ，它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶(AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示
29、抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中.集团公司人力资源管理体系搭建的整体规划结合自身多年的人力资源管理经验以及对企业的人力资源工作现状的观察、了解，认为随着企业高速发展、规模不断扩大、管理升级由人事管理向现代人力资源管理转变将势在必行.因此,如何有效的定位人力资源管理在企业管理中位置？如何使人力资源管理在企业运营中的流程化管理、制度化管理、信息化管理、文化管理的建设方面发挥至关重要作用？如何规范企业人力资源管理行为，提高人力资源管理水平？将成为人力资源管理工作下一步需要思考、迫切解决的问题。一、定位：通过HR体系搭建整体规划，明确企业中远期人力资源管理的发展目标,指导企业管理升级
30、。二、指导原则:1、务实、循序渐进、贴合企业自身实际的推进人力资源体系的搭建。2、围绕人力资源“一点两面三机制展开人力资源管理升级工作。一点：部门内部团队建设.两面:组织、职位管控体系;人力资源管理体系。三机制：流程化管理、制度化管理、信息化管理。三、工作内容：1、 内部团队建设 1.1定位:搭建部门内部汇报、监控管理平台，培育内部竞争、学习的氛围，提升团队专业技能，为各部门提供专业服务与支撑，为集团人事战略、战术实施提供平台，为员工搭建沟通渠道，解决人力资源管理专业运行问题.1。2项目内容:部门岗位职能定位，修订、改进工作表单,量化岗位工作目标，规范内部流程、制度，包括工作流程，工作手册，工作细则，表单记录，程序文件，职位说明书，岗位年度目标，重点工作计划，部门内部培训课程，人力资源内部审核管理，人力资源记录管理等. 2、组织、职位管控体系:2.1 定位：在确认自身战略，充分考虑集团的管
