1、各种酶活性测定方法各种酶活性测定方法各种酶活性测定方法第一 超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材
2、料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。（三）试剂1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：
3、1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白
4、；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml（2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml3ml0.5%TBA和5%TCA混合后在100度水浴煮沸15min迅速冷却，10000r/min离心10min用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液 A(0.2mmol/L的HAc溶液)6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中
5、 B(0.2mmol/L的NaAc溶液)13.6gNaAc.3H2O（2）0.25%愈创木酚溶液125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液1ml 0.25%愈创木酚溶液xml酶液（5min值为500-800即可）0.1ml 0.75%H2O2溶液迅速巅到混匀把A460调零并开始计时1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O21ml H2O2定容至
6、100ml方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零(2)50ul酶液3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）0.2ml 0.3% H2O2迅速颠倒混匀，开始计时1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。2010年06月22日 星期二 19:331 叶绿素含量测定：80的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80的丙酮
7、液为空白。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P3536）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.8649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO412H2O + 2.65285g NaH2PO42H2O, 定容到4L。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导，P134）。取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的
8、离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。2.1丙二醛（MDA）的测定：20三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124）；0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶
9、解）；0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA振荡沸水浴上反应30min冷却（至少30min）比色（OD600、OD532、OD450）。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导，P124）2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA
10、-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。2.3过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO412H2O + 3.042975g NaH2PO42H2O,定容到1000ml。0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。2
11、ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P121）比色时加酶液，混合后即刻计时。2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量（ml）00.10.20.40.60.81.0H2O（ml）1.00.90.80.60.40.20冰乙酸（ml
12、）2222222显色液（ml）3333333脯氨酸含量（l）012468100.5ml酶液（对照用0.5ml 80乙醇代替）（做三个重复） + 1ml冰乙酸 + 1.5ml显色液混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。2.5可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的植物生理学实验指导）牛血清白蛋白：配成100g/ml和1000g/ml。90乙醇：90ml乙醇 + 10ml蒸馏水。？ 85（W/V）磷酸：170ml磷酸 + 30ml蒸馏水。考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90乙醇中，加入85（W/V）磷酸200ml，用蒸馏水定容到2L。常温下可保存一
13、个月。标准曲线的制作：配制0100g/ml血清白蛋白血液管号123456100g/ml牛血清白蛋白(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水量(ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量（ml）00.020.040.060.080.10配制01000g/ml血清白蛋白血液管号789101112100g/ml牛血清白蛋白(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水量(ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量（ml）00.20.40.60.81.00.1ml 酶液（做三个重复） + 5ml考马斯亮蓝G-250混匀，放置2min后在595nm下比色。2.6过氧化氢酶（CAT）的测
14、定：0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500ml。1 ml 0.3%H2O2溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液，测定240nm处OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P121）2.7 抗坏血酸（ASA）的测定：（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P125）5 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到500ml。10 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g三氯乙酸，用蒸馏水定容到250ml。150mmol/
15、L NaH2PO4（pH 7.4）溶液的配制：100ml。44 H3PO4溶液的配制：250ml。4 2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml。3 FeCl3溶液的配制：100ml。首先标制作准曲线。粗酶液的提取：取低温保存的鲜样，称0.5g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入15m 5三氯乙酸（TCA）溶液（最好是较冷的三氯乙酸（TCA）溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟，上清液为粗酶液，用于抗坏血酸（ASA）含量的测定。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P125126）测定：0.2ml 粗酶液 + 0.2m
16、l 150mmol/L NaH2PO4（pH 7.4）溶液 + 0.2ml H2O，混匀（振荡），至少30秒后，再依次分别加入：0.4 ml 10三氯乙酸（TCA）溶液 + 0.4 ml 44 H3PO4溶液 + 0.4 ml 4 2,2-二联吡啶溶液 + 0.2ml 3 FeCl3溶液，混合后在37水浴中保温60min，测定OD525处的值。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P125126）2.8 谷胱甘肽的测定：4g新鲜材料 + 2ml 0.3mol/L醋酸汞 + 2ml 30醋酸钠后研磨匀浆，转移到离心管中，以蒸馏水冲洗残渣，并以玻璃棒搅拌，净置10min，使之充分沉淀，离心后
17、弃去上清液，沉淀以水（每次10ml）在摇动情况下冲洗2次。向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20的碘化钾溶液，混匀，离心。上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中，沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液，用1mmol/L KIO3滴定，直至出现不消失的蓝色为止。1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽。（参考现代植物生理学实验指南，中国科学院上海植物生理研究所编）。2.9天冬酰胺合成酶（AS）的测定：2.10 天冬酰胺转氨酶（AspAT）的测定：3 硝酸
18、还原酶(NR)的测定采用离体法：（1g样）（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P2729）亚硝酸钠标准溶液（1g/ml）：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml，再吸5ml定容到1000ml。0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO412H2O + 2.4965g NaH2PO42H2O，加蒸馏水定容到1000ml。3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。1 磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。0.2 a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml，贮于棕
19、色瓶中。0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液。0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液：Na2HPO412H2O 8.8640g + NaH2PO42H2O 0.0570g，加蒸馏水定容到1L。提取缓冲液：1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液。2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液（临用前配制）。首先标制作准曲线:取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂，即配成02.0g
20、的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮（g）为横坐标（x），光密度值为纵坐标（y）绘标准曲线或建立回归方程。各试剂加入顺序管 号1234567亚硝酸钠标准液(ml)00.20.40.81.21.62.0蒸馏水(ml)2.01.81.61.20.80.401 磺胺溶液(ml)44444440.2%-萘胺(ml)4444444每管含NO2- (g)00.20.40.81.21.62.01g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆，转移到离心管中于4、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸还原酶(NR)的测定。0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液 + 0.4mlNADH溶液后混匀（对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替），在25水浴中保温30min。保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.2 a-萘胺溶液，显色反应15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算。
