1、生物碱的高效液相色谱分离分析和制备方法有机化学论文化学论文生物碱的高效液相色谱分离分析和制备方法-有机化学论文-化学论文文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印 摘 要：生物碱是天然产物中药用活性较好的一类化合物, 在分离科学与技术领域, 生物碱的分离一直是一个研究热点和难点问题。近年来, 随着高效液相色谱填料和分离方法的发展, 生物碱的分离分析和纯化制备有了长足的进步。该文主要针对碱性化合物的峰形拖尾问题, 综述了高效液相色谱理论的发展和色谱分离技术的进步, 以及近年来新型色谱填料和分离方法在生物碱分离分析和纯化制备中的应用, 并对其前景进行了展望。 关键词：生物碱; 拖尾; 制备
2、色谱; 正交分离; Abstract：Alkaloids are a class of natural compounds with good pharmacological properties.In the field of separation science and technology, alkaloid separation has always been a hot and difficult problem.In recent years, with the development of high performance liquid chromatography (HPLC)
3、 materials and separation methods, great progresses in alkaloid analysis and preparation have been achieved.In this article, the theoretical development and technological advances with respect to peak tailing problems of basic compounds are summarized, and the applications of HPLC in natural alkaloi
4、d analysis and preparation are discussed.The further development of HPLC separation on alkaloids is also looked forward. Keyword：alkaloids; peak tailing; preparative HPLC; orthogonal separation; 生物碱是天然产物中药用活性和成药性较好的一类化合物, 据统计, 美国FDA批准的1 000多种小分子药物中, 碱性药物的比例超过60%1。在目前已发现的天然产物中, 生物碱在总数上虽然只占16%, 但在具有重要
5、药理活性的天然产物中占50%, 是天然产物新药开发中最具潜力的一类化合物2。 从19世纪初开始, 植物化学家就一直致力于生物碱的纯化制备, 通过溶剂萃取、硅胶柱层析、结晶等植化手段获得了大量生物碱, 并开发出众多的碱性药物2,3,4。但由于传统技术的局限, 对生物碱分离纯化往往收率很低, 特别是含量较低的成分极易丢失, 还有许多结构类似的生物碱, 也因为分离度不够而无法获得纯品。高效液相色谱是在传统柱层析基础上, 采用细颗粒的球形硅胶基质键合固定相和高压泵输液方式发展起来的具有柱效高、分离能力强、重复性好、速度快等系列优点的现代色谱分离方法, 目前已成为药物分析、食品科学、生命科学等学科和产业
6、领域不可或缺的重要分析工具5。随着分析型高效液相色谱的普及, 制备型高效液相色谱也得到了越来越多的发展6。在天然产物领域, 制备型高效液相色谱被广泛应用于黄酮、皂苷、生物碱等成分的纯化分离7,8,9, 特别是在结构类似物的分离中起到了重要作用, 直接推动了许多新化合物的发现10,11,12,13,14。 然而相比于其他类型天然产物, 生物碱的分离往往会出现峰形拖尾和载样量特别低的情况, 不仅在传统硅胶柱上死吸附严重, 在高效制备填料上也依然是令人头疼的问题15,16。由于峰形拖尾, 生物碱往往峰宽较宽, 峰高较矮, 检测灵敏度较差, 而提高进样量又会导致色谱峰拖尾加剧, 柱效迅速下降, 相邻的
7、成分更易被拖尾峰包裹, 这些问题给生物碱的分离分析和纯化制备带来了许多困难。 针对像生物碱这样的碱性化合物的特殊色谱保留行为, 研究者们从流动相和固定相上作了一系列探索并取得了一定进展。本文将主要从碱性化合物的高效液相色谱峰形拖尾的形成机理和相应改善方法, 以及实际应用, 生物碱的分离分析和纯化制备进展等方面进行综述。 1、 碱性化合物峰形拖尾的内在机理讨论 在过去几十年中, 许多研究者对碱性化合物的色谱峰拖尾行为展开了研究并提出了相应的观点, 其中主要有硅醇基理论、带电溶质相互排斥理论和多位点吸附理论。 1.1、 硅醇基理论 硅醇基理论17是最早用于解释碱性化合物在硅胶基质固定相上拖尾现象的
8、理论。该理论认为, 硅胶基质表面残留的酸性硅醇基与碱性化合物之间的离子交换作用, 是导致碱性化合物拖尾的主要原因。在C18等反相填料的键合过程中, 由于空间位阻的存在, 硅醇基往往不能完全反应, 即使采用短链硅烷试剂进行封尾, 仍有大量硅醇基未反应15。特别是在早期色谱填料制备过程中, 使用了Type A类硅胶基质, 存在较多的金属离子残留, 会进一步激发硅醇基的酸性, 进而导致碱性化合物拖尾18。为此, 色谱填料和色谱柱生产厂商通过改进球形硅胶基质的生产工艺, 并发展了多种封尾技术19,20。随着高纯硅胶 (纯度99.99%) 和封尾技术的普遍应用, 硅醇基的活性 降低, 如Neue等21以
9、锂离子 (Li+) 的保留为指标对Waters公司的多种硅胶基质及其C18键合色谱柱的硅醇基酸性进行评价时发现, 在pH 3.07.0范围内, 高纯硅胶基质反相色谱柱 (Symmertry C18和XTerra MS C18) 对锂离子均无保留, 说明其阳离子交换作用在酸性条件下几乎可以忽略。但在实际应用中, 即使在此类高纯硅胶色谱柱上开发碱性化合物的分析方法, 仍经常需在流动相中添加磷酸盐等缓冲盐或其他试剂来改善峰形。另外, 研究发现在不含硅醇基的聚合物色谱柱上, 离子化碱性化合物依然出现了拖尾和易过载现象22 (图1) , 而且在硅胶基质的反相色谱柱上, 强酸性化合物也会表现出与碱性化合物
10、类似的峰形拖尾和展宽现象23, 表明生物碱的峰形拖尾显然还存在硅醇基以外的因素。 图1 中性化合物和碱性化合物的典型色谱载样行为差异22 Fig.1 Distinct overloading behaviors of neutral and basic compounds on typical RPLC22 1.2 、带电溶质相互排斥理论 为进一步探究生物碱拖尾的机理, 研究者们提出了带电溶质相互排斥理论23并采用单分子层Langmuir吸附模型作进一步验证和阐述24。该理论认为, 相比于中性化合物, 带有同种电荷的溶质在固定相表面存在相互排斥作用, 使得固定相表面能够被吸附的位点数量减少,
11、从而导致了其载样量的下降。这种理论能够在一定程度上解释碱性化合物在聚合物色谱柱的色谱保留行为, 以及强酸性化合物在硅胶基质反相色谱保留行为。按照该理论, 样品在非离子形态时具有最高的载样量, 而在离子状态时载样量会下降。然而, 此前的热力学研究表明离子化合物与中性化合物的总吸附容量接近25, 这与单分子层的Langmuir模型矛盾, 因此, 离子型化合物的拖尾还存在其他因素。 1.3、 多位点吸附理论 多位点吸附模型26,27是更准确严谨的解释离子型化合物拖尾的理论, 相比于带电溶质相互排斥理论的单分子层吸附模型, 该理论认为固定相表面还存在其他吸附能量不同的位点, 这一方面解释了此前离子型化
12、合物与中性化合物热力学容量相近的结果, 另一方面提供了离子型化合物的动力学解释。该理论的主要观点是, 碱性化合物的保留是多种吸附能量不同位点的共同作用结果, 碱性化合物总是先占据数量较少的高能吸附位点, 当高能吸附位点饱和后, 才会去占据数量较少的低能吸附位点。相比于中性化合物, 离子型化合物间的高低能位点间的能量差更大, 由此可能导致离子型化合物传质均一性较差, 并最终反映在色谱分离上更易出现过载和拖尾的现象。这些不同能量的吸附位点与他们所处的化学环境相关, 其中少量的高能位点位于C18链内层, 而大量的低能位点存在于C18链表层。该理论通过吸附等温线的测定, 推导出了合适的吸附模型, 并从
13、大量的色谱柱案例得到了验证, 较为可靠, 但到底为何会产生这种多位点的吸附, 目前仍未有明确的结论, 主要归因于材料表面的不均一性28。该理论主要由Guichon等26,27,28提出并反复验证, 但国内关注者较少, 国际上也较少有人据此提出相应的解决方案。按照该理论, 降低生物碱对高能位点的吸附, 是改善拖尾的一种手段。 综上所述, 碱性化合物在硅胶基质色谱柱上的特殊保留行为机理存在较复杂的因素, 相关的机理探讨仍在不断完善中。 2、 改善生物碱拖尾的方法 基于上述碱性化合物峰形拖尾问题的机理探讨, 研究者们从流动相和固定相两方面提出了一系列改善措施, 这些方法同样在生物碱的分离分析和纯化制
14、备中得到了很好的应用。 2.1、 流动相方面 为减少硅醇基和碱性化合物的离子交换作用, 可以使用低pH值流动相以抑制硅醇基的电离, 或使用高pH值流动相抑制生物碱的电离29;也可加入有机胺改性剂 (如三乙胺30) 竞争占据离子化硅醇基, 从而阻断碱性化合物与硅醇基间的相互作用。此外, 还可通过添加高浓度缓冲盐31,32、离子对试剂33或离子液体34, 以缓和溶质间的相互排斥, 减少溶质与硅羟基的相互作用。这些添加剂的使用对分析水平上峰形的改善起到了一定的作用, 但高浓度缓冲盐、离子对试剂和离子液体会导致更长的柱平衡和柱清洗时间, 增大基线噪音, 还会腐蚀仪器, 影响数据质量。更重要的是, 单纯
15、改变流动相条件, 并不能完全解决制备水平上的峰形拖尾问题, 如低pH值流动相虽然抑制了硅醇基的电离, 但会促进生物碱的电离, 当载样量增加时, 峰形依然会发生拖尾;此外, 高pH值流动相虽可抑制生物碱的电离, 但会造成硅胶的溶解, 因此还需配合耐碱性的色谱柱。 2.2、 固定相方面 通过改进固定相结构来克服碱性化合物拖尾是近些年研究的热点。随着硅胶制备工艺的发展, 基于高纯硅胶的色谱柱逐渐占据了主流。利用这类低硅醇基活性的色谱柱对碱性化合物进行分析, 峰形优于早期硅胶。此外, 通过一定程度的封尾或极性基团修饰, 还可以进一步屏蔽活性硅醇基, 从而获得更好的峰形。这类色谱柱的代表如Waters公
16、司的Symmetry Shield RP18等。然而, 这一类色谱柱通常只能在分析水平获得较好的峰形, 载样量有限, 且其pH值耐受范围有限。 为满足碱性化合物在高pH值条件下分析的需求, 各色谱柱厂家发展了一些更为先进的制造技术。如Agilent公司采用双封尾技术, 研制了Zorbax Extend C18色谱柱, 可在碱性条件下较好地屏蔽硅醇基;Merck公司的Lichrospher RP-select B色谱柱, 采用高密度键合方式, 降低硅醇基暴露在流动相中的几率;迪马公司的Spursil C18色谱柱, 在硅胶制造的最后阶段, 在其表面移植了一层硅胶-有机层, 从而保护了内部的硅醇基
17、, 也可在碱性条件下使用。除此之外, Waters公司还提出了有机-无机杂化硅胶的概念, 并推出了系列色谱柱, 显着延长了色谱柱在碱性条件下的使用寿命, 代表性色谱柱如XBridge系列35,36。 需要指出的是, 高pH值耐受色谱柱的发展, 虽然一定程度满足了弱碱性及中等碱性化合物的分离和制备, 但由于碱性非常强的化合物 (如季铵型生物碱等) 即使在碱性条件下仍可保持正离子状态, 而硅醇基由于在碱性条件下电离出负电荷, 从而使生物碱与硅醇基间的离子交换作用加剧, 导致碱性化合物的峰形反而更差37。 图2 XCharge C18色谱柱的表面化学结构39 Fig.2 Chemical struc
18、ture of the XCharge C18 column surface39 近年来, 研究者们还设计了一些表面正电荷修饰的色谱柱, 如Waters公司研制的表面带电杂化色谱柱CSH系列38, 以及本课题组设计的XCharge C18色谱柱39,40 (图2) 。这类色谱柱改善碱性化合物峰形的机理在于色谱柱表面正电荷与碱性化合物溶质间的静电排斥作用, 阻止了碱性化合物向硅醇基的靠近, 从而改善了峰形19。也可用多位点吸附理论对其进行解释:表面正电荷的存在通过离子排斥作用, 使碱性化合物不能接近在内层的高能吸附位点, 而倾向于在C18链上的低能吸附位点吸附, 从而使吸附和脱附变得均一同步,
19、峰形也得到了改善41。相比于其他种类色谱柱, 表面正电荷色谱柱优势明显:首先, 它们对大多数类型碱性化合物均有较好的分离效果, 即使是电荷性较强的季铵型生物碱, 也可获得较好的峰形;其次, 无需使用高浓度缓冲盐或离子对试剂, 在低离子强度的挥发性缓冲盐或者简单的酸性条件即可获得较好的峰形, 适合质谱分析;此外, 在高载样量条件下, 碱性化合物也能保持优异的峰形, 十分适合制备。利用该类型色谱柱XCharge C18对富含季铵型生物碱的延胡索提取物进行分析, 在简单的甲酸体系下, 即可获得优异的峰形, 而同条件下采用其他色谱柱分离时, 峰形依旧较差 (图3) 。尽管通过调节流动相添加剂如三乙胺或
20、缓冲盐, 生物碱在其他类型色谱柱也能达到较好的分离效果, 但是这些添加剂往往不适合质谱分析, 或者对载样量改善有限, 不适合制备。 图3 延胡索提取物在不同反相色谱柱上的色谱图比较40 Fig.3 Comparison of chromatograms of Corydalis yanhusuo extract on different reversed phase columns40 a, b:XCharge C18column;c:Zorbax Eclipse 5m XDB C18;d:Atlantis 5m T3 C18;e:XBridge 3.5m C18;f:Xterra 5m C1
21、8;g:inspire 5m C18;h:spursil EP 5m C18;i:TSKgel 3m ODS-100 V;j:self-made 5m C18/C1;mobile phase:0.1%formic acid water (A) -CAN (B) ;gradient for XCharge C18:0-30 min, 0%-30%B;gradient for commercial columns:0-30 min, 5%-35%B;30-40 min, 35%-60%B;injection volume: (a, c-j) 50L and (b) 100L;flow rate:1
22、.0 mL/min;column temperature:30;UV detection:254 nm 为了提供不同的选择性, 包括本课题组在内的研究人员, 还发展了离子交换色谱42,43、反相/离子交换混合色谱44。与传统的反相色谱相比, 离子交换色谱和反相/离子交换混合作用色谱也能够为生物碱的分离提供良好的峰形和较高的载样量。这一类色谱柱的不足之处在于使用时通常需加入高浓度缓冲盐, 会增加制备后处理的工作量。 3、 生物碱的高效液相色谱分离分析方法 目前, 生物碱的高效液相色谱分析方法主要包括反相色谱、离子交换色谱、亲水作用色谱以及相应的多维色谱。 3.1、 反相色谱法 反相液相色谱是分析
23、生物碱的最常用方法, 该法依靠固定相和流动相间的疏水作用对中等极性和弱极性化合物进行分离。可供生物碱反相分析的固定相和流动相体系众多, 因此要注意它们间的相互配合以达到最优的分离效果。如使用常规C18色谱柱对生物碱进行分析, 则需要调节流动相添加剂以改善生物碱的峰形。邹翔等45采用Diamonsil C18色谱柱, 添加三乙胺并用磷酸调至pH 3.0, 分析了白屈菜不同器官中生物碱的种类及质量占比, 获得了较好的线性关系、精密度和回收率。此外, 近些年来, 离子液体用作流动相添加剂来改善生物碱峰形多有报道, 如朱益雷等46以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐为流动相添加剂, 采用Ultimate
24、 XB-C18色谱柱, 测定了香连丸中小檗碱、药根碱和巴马汀3种主要季铵型生物碱含量, 并获得了比三乙胺更好的结果。 当采用耐碱性的色谱柱时, 流动相的pH值则可以调节至更高水平。林宏英等47采用Zorbax Extend-C18色谱柱, 以醋酸铵为添加剂, 并用氨水调至pH 8.0, 质谱法鉴定了13个生物碱成分, 并比较了川乌加热前后生物碱的变化, 具有较高的准确度和灵敏度。 采用表面正电荷色谱柱并配合简单的低离子强度添加剂是近年来发展起来的一种新的分析方法。采用本课题组自主研发的XCharge C18色谱柱, Long等48在0.1%甲酸的条件下, 采用HPLC/CAD对贝母中异构体生物
25、碱进行定量分析, 获得了良好的对称因子和灵敏度。Qing等49利用XCharge C18色谱柱对博落回生物碱进行液质联用分析, 获得了良好的峰形, 将该方法应用于不同基源药材的区分, 也获得了较好的结果。Le等50采用XSelect CSH C18色谱柱, 在10 mmol/L甲酸铵条件下, 对白毛莨中的生物碱进行了LC-ESI MSn分析, 取得了良好的峰形, 共鉴定出28个生物碱, 其中包括一个新化合物和21个首次在该植物中被鉴定出来的化合物, 该结果体现了优异的色谱峰形对质谱鉴定的重要性。 3.2、 离子交换色谱法 与中等极性和弱极性生物碱相比, 强极性生物碱在反相模式下的保留更差, 分
26、离更加困难, 可采用阳离子交换 (SCX) 色谱法进行分析。刘琼等51选用Spherisorb SCX色谱柱, 以不同离子浓度和pH值的磷酸盐溶液为流动相, 分别对麻黄碱类、鲜益母草胶囊中的水苏碱、使君子药材中的胡芦巴碱、半夏露糖浆中的麻黄碱与伪麻黄碱进行了分析。本课题组Long等43,52评价了盐种类、盐浓度、pH值和乙腈浓度对几种强极性生物碱在SCX色谱柱上的峰宽和对称性的影响, 并对其保留机理进行了讨论。 图4 亲水作用色谱对唐古特山莨菪馏分的分析55 Fig.4 Analysis of alkaloid fractions from S.tangutica by hydrophilic
27、 chromatography55 mobile phase:acetonitrile (A) -100 mmol/L NH4Cl (pH 6.8) (B) -water (C) ;wavelength:210 nm;flow rate:1 mL/min;column temperature:30;gradient:0-30 min, 90%-80%A, 10%B, 0%-10%C 3.3、 亲水作用色谱法 亲水作用色谱能有效保留反相色谱中保留较差的强极性化合物, 目前已被广泛应用于强极性生物碱成分的分析中。Taujenis等53用HILIC-MS/MS测定了烟草中4种生物碱, 获得了较好的定
28、量下限、回收率和准确度。卓荣杰等54采用Atlantis HILIC Silica色谱柱分析了葫芦巴药材中的葫芦巴碱, 获得了良好的分离效果和定量结果。本课题组龙珍55利用自制的亲水柱TE-Cys对山莨菪中强极性馏分进行了分析, 样品得到了较好的保留和较好的峰形 (图4) 。 图5 SCX/XCharge C18二维体系分离分析山莨菪生物碱馏分59 Fig.5 Analysis of alkaloid fractions from S.tangutica by SCX/XCharge C1859 XCharge C18conditions:acetonitrile (A) -0.1%formi
29、c acid (B) ;gradient:0-30 min, 5%-15%A, 95%-75%B;SCXconditions:acetonitrile (A) -100 mmol/L sodium dihydrogen phosphate (pH 2.8) (B) -water (C) ;wavelength:210 nm;flow rate:1 mL/min;column temperature:30;gradient:0-20 min, 15%-50%A, 30%-30%B, 55%-20%C 图6 XCharge C18色谱柱 (150 mm4.6 mm, 5 m) 上延胡索生物碱样品的
30、4个代表性制备色谱图38 Fig.6 Four representative preparative chromatograms of the crude alkaloids sample on the XCharge C18 column (150 mm4.6 mm, 5 m) 38 conditions:ACN (A) -0.1%aqueous formic acid (B) ;gradient:0-30 min, 5%-15%A;30-40 min, 15%-60%A;flow rate:1.0 mL/min;UV wavelength:320 nm;column temperature:30 ;ioading amount:10 mg;injections:5th, 10th, 15thand 20th from top to down 3.4、 多维色谱法 由于天然产物组成复杂, 单维色谱中, 大量的重叠峰会给定性定量带来不利的影响。相比于一维色谱, 二维色谱能够为复杂体系提供更好的峰容量和更高的分辨率, 是复杂体系分离分析的重要工具56。在已有的生物碱分离体系中, 表面正电荷色谱柱凭借分
