1、新农药的研究与开发 新农药的研究与开发 正如绪论中所述：我们强调有害生物综合治理(IPM)，提倡尽量采用非化学防治的办法，但就当今社会的需求和科学的发展而言，在目前及今后一个相当长的历史时期，化学防治在IPM中仍然占主导地位。因此，近年来国内外农药的产量和产值都呈上升趋势。 农药是动态发展的特殊商品，新品种总要不断地取代老品种，以适应农业生产的发展和社会的需求。特别是八十年代以来，全社会对农药的属性提出了更为苛刻的要求，简单说来就是：生物活性高，对非靶标生物安全，和环境相容性好。因此，新农药的研究与开发始终是农药科学和农药企业发展的原动力。对我国来说，新农药的研究与开发还有更重要的意义：建国以
2、来，我国已经研制、投产了200多个农药品种，但仿制多于创制。在国际上不断加强知识产权保护和我国即将加入世界贸易组织的新形势下，也根据修改后的中国专利法规定保护农药化合物专利的要求，我国农药发展的战略必须由仿制转向创制，进行新药的研究与开发。 新农药的研究与开发是一项复杂的系统工程，涉及化学、化工、生物、农学、医学和环境科学等众多学科，需要多学科的专家分工协作，按照严密组织的工作程序，进行系统的研究和试验。新农药的研制过程大体上可分为“研究”与“开发”两个阶段。在研究阶段，主要目的是从大量的化合物中筛选出新的农药活性化合物，发现先导化合物，经结构优化，筛选开发的候选化合物。在开发阶段，则主要是对
3、候选化合物进行开发试验和安全性评价，最后选定农药新品种，进行工业化开发并商品化。有关新农药研究与开发的具体内容分述如下。第一节 化学合成与工艺研究一、 先导化合物的发现和优化 选定正确的先导化合物，是新农药研究与开发的核心环节。创制一个新的农药品种要耗费几千万至一亿美元的巨额资金，但这些经费大部分花在后期的开发阶段。如果在前期研究阶段能正确选定先导化合物，则有可能用相对少的人力和资金投入，就能使新农药开发成功；相反，如果选错了先导化合物，则会导致后期开发失败而造成人力和资金的巨大浪费。因此，发现和选定先导化合物对于提高开发成功率和节约开发成本有重大意义。所谓先导化合物(lead compoun
4、d)，是指通过生物测定，从众多的候选化合物中发现和选定的具有某种农药活性的新化合物，一般具有新颖的化学结构，并有衍生化和改变结构的发展潜力，可以用作起始研究模型，经过结构优化，开发出受专利保护的新农药品种。发现先导化合物的主要途径有： (一)经验筛选 这种途径的基础是直接针对作物的害虫、病原物和杂草，活体筛选供试化合物的可能活性。用这种方法发现的活性化合物完全是依靠机遇，化合物活性和生化机制是不可预测的，因此称随机筛选(random screeming)。例如除虫脲和其它苯甲酰苯基脲类化合物是以敌草腈和敌草隆化学结构为基础设计的除草剂结构而合成的，然而在活性筛选中却意想不到地发现了它独特的杀虫
5、活性。近年来，经验筛选的重点放在具有新颖化学结构的化合物方面，特别是(1)在分子中引入过去农药分子中少见的元素，如氟、硅、锡等原子或基因，特别是含氟基团的引入，往往可明显提高活性，近年来获得很大成功。(2)新型杂环化合物。由于杂环化合物结构多种多样，潜力很大，有些杂环可能有独特的作用机制和意想不到的生物活性，近年来同样获得很大成功。 经验筛选的优点是思路广阔，发现新颖化学结构及新型生物活性的机会较多。缺点是工作量大，相对成功率很低，特别是进入80年代以来，靠经验筛选发现新的先导化合物是越来越因难了。尽管如此,这种方法仍是目前采用的创制新农药的基本方法。 (二)类推合成 类推合成即对已经开发的活
6、性先导化合物进行衍生合成，开发新的农药品种或发现新的二次先导化合物，这样合成出来的化合物就是“模仿分子”(me-too molecules)这种途径在磺酰脲类除草剂、三唑类杀菌剂、有机磷类杀虫剂、拟除虫菊酯类杀虫剂的开发中获得普遍成功。这种办法最省时省力、投资小、收益大，但很难发现有新的作用机制的新型先导化合物。 (三)天然产物模型 天然产物作为一种途径即从天然存在的化学品中获得具有生物活性的先导化合物。如从沙蚕中获得杀虫先导化合物沙蚕毒素，然后进行类推合成开发出杀螟丹、杀虫双、杀虫单、杀虫磺、杀虫环等。最有名的当然是从天然除虫菊中发现除虫菊素这样的杀虫先导化合物，然后类推合成，开发出当今几十
7、个高效拟除虫菊酯类杀虫剂。天然产物毒扁豆碱通常认为是合成稳定的氨基甲酸酯类杀虫剂的先导化合物，从而经设计改造合成了西维因、速灭威、异丙威、害扑威、克百威和涕灭威等。 从天然产物模型发现先导化合物有利的一面是天然产物可提供多种新颖独特的分子结构，筛选的范围较广，成功率较高；可提供多种新型的作用方式，以杀虫活性物质为例，除对昆虫的毒杀作用外，还可能有忌避作用，抗产卵作用，拒食作用，干扰生长发育，影响行为控制等作用；天然产物本身有较好的环境相容性。但也有不利的一面，许多天然产物的化学结构过于复杂，用作先导化合物进行模拟合成或结构优化时难度较大；许多天然产物在生物体内含量甚微，显示的生物活性不高，增加
8、生物筛选的困难，容易漏筛；许多天然产物多以多组分混合物形式存在，相当一部分对光和热不稳定，给有效成分的分离和结构鉴定带来因难。但总体来说，天然产物模型是发现先导化合物的重要途径，近20年来一直是农药化学研究的热门课题。 (四)生物合理设计 这是诱人的一个领域，其理论基础是生物化学，就杀虫剂而言，即昆虫生物化学。生物合理设计就是以靶标生物体生命过程中某个关键的生理生化作用机制作为研究模型，人为地设计合成干扰此作用机制的化合物，从中筛选出先导化合物，然后进行结构优化开发。生物合理设计的主体思维可分为三步： 第一步：以杀虫剂为例，研究目标昆虫的某一生化途径(biochenical pathway)，
9、该途径的末端产物对昆虫来说是生命攸关的，如果干扰这一途径中的某一个环节，昆虫将死亡。 第二步：研究如何干扰上述的那个环节，即研究干扰的机制。昆虫的生化途径几乎都和许多酶系有关，如果抑制了某种酶，则这一生化途径就会中断，昆虫将死亡。 第三步：根据研究清楚的靶标，人为地设计这种酶的抑制剂，合成筛选出的杀虫剂就是生物合理设计的杀虫剂。 由于人们对昆虫许多重要的生化过程尚不完全清楚，因此迄今为止，这一领域尚没有重大突破，但可以预料，今后农药研究的重点将转向这一领域，特别是采用“计算机辅助分子设计”（CAMD）技术，将有长足的进步。下面是一些例子： 乙酰胆碱是昆虫重要的神经递质，是由乙酸和胆碱在昆虫体内
10、合成的，这一生化过程涉及一种重要酶系，即胆碱乙酰化酶，如果抑制了该酶的活性就可能造成乙酰胆碱耗尽，神经传导中断，昆虫就会死亡。因此，胆碱乙酰化酶的抑制剂就可能成为杀虫剂，经过大量合成筛选，也找到了一些抑制剂，但迄今尚末开发出实用化品种。 昆虫形成的新表皮需迅速鞣化（硬化），否则昆虫必将死亡。昆虫正常的表皮鞣化过程需要有一系列的酶系，特别是多巴脱羧酶的参与，如果抑制了这种酶，则昆虫不能鞣化新表皮，昆虫必将死亡。目前人们正在筛选多巴脱羧酶的抑制剂，至今也没有商品化产品问世。昆虫羽化激素是一种昆虫神经肽，对昆虫整个生活史中的蜕皮、变态起重要作用。在昆虫体内生物合成羽化激素需要有多种酶系的参与，如果能
11、筛选出适合的酶抑制剂，则从这些酶抑制剂可能开发出新的杀虫剂。 图111 先导化合物的产生、展开、优化程序 上述四种途径不是孤立的，而是相互联系的。事实上无论采用何种途经发现先导化合物后，必然要经过系统的结构修饰，获得一系列类似化合物, 这个过程称为先导优化（lead optimigation）, 从中筛选出可供产品开发的候选化合物。同时在优化过程中，由于一次先导化合物经过较大的结构改变，包括分子骨架的改变，可能产生二次先导化合物。这样反复进行多次结构改造，产生更高层次的先导化合物，这个过程称为先导展开（lead development)。这样，从一个原始的先导化合物就可展开产生多个层次的先导化
12、合物，进而优化获得多个候选化合物，使产品开发成功的机会大为增加。先导化合物的产生、展开、优化可用图11- 1来表示。二、 小试研究和中试研究在先导化合物发现及优化阶段，化学合成的目的是尽快获得化合物纯品提供作生物筛选，并不计较合成反应的收率多少和成本高低，而在小试研究（laboratory research）阶段，其目的在于选择适合于选定化合物工业生产的合成路线，工艺条件和设备，尽可能提高质量和收率，并提出分析方法，三废治理措施等，结合药效，急性和亚急性毒性试验结果，为中试研究提出依据。小试中的化学合成及工艺研究包括下列内容： （）选择合成路线。对某一选定化合物的主要合成路线进行分析和试验，通
13、过原料来源，设备条件，能量消耗，反应收率，成本等综合比较，选出工业上合理的工艺路线和合成方法，并完成探索性合成试验。 （）合成条件优化。对影响质量和收率的各主要因素，原料配比，加料顺序，催化剂种类和用量，反应物料的浓度，反应温度和压力，反应时间及必要的宏观动力学研究等进行优选确定优化反应条件，并多次实验证实。 （）测定和合成反应有关的理化数据，如热量，粘度等，为设备选型及进一步的工业性试验提供依据。 （）制定原料、中间体、产品的分析方法。 （）进行物料能量衡算，初步评价其经济效益。 （6 ）提供适量合格产品进行田间药效试验评价和安全性评价。 中试研究是在小试研究的基础上进行的，包括下列内容：（
14、1） 验证小试结果。（2） 根据工程放大的需要，建立一定规模的中间试验装置(全流程或单元操作)，考验工艺流程的合理性和操作条件的可靠性，测定物料平衡、热量平衡及制定过程控制方案。（3） 主要设备材质选择和设备选型。（4） 较长周期稳定和连续运转。（5） 三废治理方案。（6） 原材料、中间体及产品的分析方法和建立产品质量标准。（7） 产品应用研究。（8） 中试技术及中间评价。（9） 基础设计与最终评价。 新农药研究开发程序可简单归结为：小试研究（基础研究） 概念设计 中间试验（过程研究） 基础设计（工业规模）。 第二节 生物筛选与作用机理一、 生物筛选在新农药研究与开发中的意义 生物筛选（bio
15、logical screening)的含义是：采取一定的可重复的方法和步骤，用一定剂量的候选化合物处理供试生物材料，根据供试生物材料的反应并经过特定的统计分析后，选出有效化合物供进一步商品化开发，或作为先导化合物进一步研究。 生物测定工作贯串于新农药研究与开发的始终，其意义在于：要从众多的供试化合物中发现先导化合物，必须依赖生物筛选提供的各化合物的生物活性信息；在先导优化及分子设计，特别是构效关系研究中必须要依赖生物筛选提供定量活性资料（毒力）；对候选化合物也必须依赖生物筛选结果对其是否有商品化开发价值作出评价。此外，生物筛选还可提供毒理学数据，而这些毒理学数据反过来又给新农药研究与开发提供新
16、的思路。因此，生物筛选是新农药研究与开发的重要组成部分，生物筛选的成败关系到新农药研究与开发的成败。在国外，一些大的农药公司都有专门的生物筛选部，配备有现代化的生物筛选设备和训练有素的专业技术人员。三、 供筛选的生物材料 生物筛选有两种模式，即定向筛选和广泛筛选。定向筛选有预定目标，即针对特定的有害生物进行筛选。如防治棉铃虫药剂筛选，防治白粉病药剂筛选，卫生杀虫剂筛选等。广泛筛选，又称普筛，是一种没有限定和预期目标的筛选。在新农药研究与开发工作中，尤其是在前期的研究阶段，生物筛选主要是普筛。但是普筛并不是漫无目的地盲目筛试，而是根据供试化合物的分子结构，理化性质和类似化合物已有的生物活性资料综
17、合分析后选定若干种生物材料，而且这些生物材料的选择还应参考下述两个原则： 在室内人为环境条件下，应用较简便快速的繁殖技术，可保证全年定时大量供应，不受季节性限制。 应是广泛发生危害的主要农林有害生物，具有重要的经济意义而且在分类地位上有一定代表性。 不同的国家和地区，不同的农药公司都有各自选定的生物材料，而且一经选定，不会轻易变动。 (一）昆虫和螨类： 我国经常采用的种类是： 粘 虫 Leucania separata Walker 棉铃虫 Helicoverpa armigera (Hbner) 玉米螟 Ostrinia furnacalis Guenee 二化螟 Chilo suppres
18、salis (Walker) 小菜蛾 Plutella xylostella (Linnaeus) 褐飞虱 Nilaparvata lugens Stal 棉 蚜 Aphis gossypii Glover 豆 蚜 Aphis craccivora Koch 米 象 Sitophilus oryzae (Linn.) 朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus (Boisduval) 杂拟谷盗 Tribolium confusums Jacqulin du Val 家 蝇 Musca domestica Linnaeus 淡色库蚊 Culex pipiens pallens Co
19、quillett (二)植物病原菌 我国经常采用的植物病原菌是：稻瘟病菌 Piricularia oryzae Car. 水稻纹枯病菌 Pellicularia sasakii (Shirai) Ito. 小麦条绣病菌 Puccinia striiformis West.甘薯黑疤病菌 Ceratocysis fimbriata Ell. et Halsted 马铃薯晚疫病菌 Phytophthora infestans (Mont.) de Bary番茄早疫病菌 Alternaria solani (Ellis et Martin) 柑桔青霉病菌 Penicillium italicum We
20、hmer苹果黑星病菌 Venturia inaegualis (Cke.) Wint.棉花炭疽病菌 Colletotrichum gossypii Southw.黄瓜霜霉病菌 Pseudoperonospora cubensis (Berk.et Curt.)花生褐斑病菌 Cercospora arachidicola Hori番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea Pers (三)杂草 我国常用的种类是: 野燕麦 Avena fatua L. 稗 Echinochloa crus-galli (L.) Beauv 看麦娘 Alopecurus aequalis sobol. 苋 Am
21、aranthus tricolor L. 荠 菜 Capsella bursa-pastoris (L.) Medic 播娘蒿 Descurainia sophia (L.) Schur 藜 Chenopodium album L.三、筛选方法(一)初筛 初筛在室内进行，包括离体测试和盆栽测试。初筛一般只设计供试化合物的1 3个剂量(浓度)作用于供试生物，初筛观察供试化合物有无生物活性，何种生物活性，大致的活性强度。 1.杀虫活性初筛方法 国外目前采用三种方法进行杀虫活性初筛： ()饲料混毒法：将待测样品和试虫人工饲料或半人工饲料混合(一般设计1000g/g和100g/g两个剂量)，接入初孵幼
22、虫饲养7天，其间观察试虫的反应症状如存活、爬行、取食、蜕皮、个体大小等)，并分别于接虫后1天,3天和7天检查死亡率，第7天称重活虫体重，并与对照比较。 (2)叶片浸叶饲虫法：叶片浸药饲虫法的基本原理是将待测样品溶于丙酮或甲醇等溶剂，再以水稀释，或将样品作成乳剂以水稀释(一般设计5000g/ml、1000g/ml和100g/ml三个剂量)，将试虫喜食的叶片浸入35秒后取出晾干，饲喂3龄幼虫3天，其间观察记载试虫的反应(如存活、取食、爬行、蜕皮等)。上述两种方法中，药剂(样品)主要随试虫取食而进入昆虫消化系统，然后进入血淋巴，但也有部分药剂可能由于试虫爬行取食和载毒饲料接触而穿透表皮进入昆虫体内，
23、即以胃毒为主触杀为辅。在饲料混毒法中，试虫为初孵幼虫，个体差异小，一般较敏感；在叶片浸药饲虫法中，试虫为3龄虫，个体大，易于观察。 (3)微量筛选法(microscreening)：在高1.5cm,直径1.0cm的小杯中，加入1ml含供试样品的水，放入1头2龄蚊幼虫，4h后在双目解剖镜下检查试虫的反应。这个方法的特点是快速，灵敏，样品在g级亦可测试，特别适合于活性初筛。 2.杀菌活性初筛方法 杀菌活性初筛采用两类方法，即离体测试和活体测试(盆栽试验)。离体试验通常采用抑制孢子萌发法和抑制菌丝生长法，初筛时供试化合物的浓度一般设计为10g/ml,100g/ml。离体试验简单，快速，适合微量样品(
24、如mg级样品)的初筛，但离体试验和大田病害防治的实际差距太大，病害防治是药剂、寄主植物、病原菌、环境构成的一个系统，而离体试验只有药和病原菌。特别是对于像乙膦铝这类杀菌剂，它在离体条件下不表现杀菌活性，必须和寄主植物发生作用后(激发寄主植物产生防御素)才表现杀菌活性。如果采用离体测试，必然“漏筛”，因此必须采用盆栽活体测试。盆栽试验都在现代化的大型温室中进行，采用全方位的机动喷雾系统施药。盆栽初筛中供试化合物的浓度一般设计为g/ml和500g/ml。、除草活性初筛 目前国外除草活性初筛大多数采用盆栽测试。英国杂草研究组织（WRO）进行除草活性初筛时采用供试作物和杂草各种：矮小法国豆、羽衣甘蓝、
25、四季黑麦草；野燕麦、匍匐冰草、两栖蓼。采用个剂量（0.75kg/ha,1.5kg/ha和2.25kg/ha),药剂处理采用芽前土表处理，混土处理，芽后茎叶处理和淹水条件下用滴管将药剂滴入土壤中四种处理方法。 （二）复筛 经过初筛后，绝大多数供试化合物被淘汰掉，少数化合物进入复筛阶段。复筛是以低于初筛的浓度对初筛中保留下来的有效样品作进一步的测试，一般采用5个浓度，求出LD50、LC50或ED50、EC50,并和常用的商品农药对照，以评价是否可进入田间小区试验。 （三）田间小区药效试验 田间小区药效试验是在田间条件下对室内复筛，特别是盆栽试验结果的进一步考核和筛选。复筛（包括盆栽）都是在室内人工
26、控制条件下进行的，尽管现代化温室可以模拟田间一些条件，但毕竟和田间条件有较大区别。影响药效的因素有3个大的方面：1药剂，虽然室内测试和田间测试的药剂本身可以完全相同，但施药操作时喷洒的均匀度，复盖度，沉积率，是不会相同的。2生物，包括有害生物，特别是昆虫，室内测试时试虫的龄期、大小，敏感度都比较一致，而在田间，无法做到龄期一致，敏感度更不可能相同；室内种植的杂草和田间状态下的杂草其群落组成，对药剂的抵抗能力相差很大；即使是农作物，室内，田间同样差异很大。3环境条件，田间的温度、湿度、光照、风力是一个不断变化的连续过程，再好的计算机控制技术也难以将室内的环境条件模拟得和田间环境条件完全一样。因此
27、，只有通过多点田间小区药效试验才能确证一个化合物是否有可能商品化。 我国在田间药效试验中最大的问题是不能或难以做到准确定量。国外一般采用专门的喷雾机械设备：以电动机控制的恒速推动喷雾架，喷头固定在喷雾架的梁上，喷雾架梁的宽度和小区宽度一致，梁在喷雾架上滑行，滑行到小区终端药液刚好喷完。至于具体的田间小区试验方法，读者可参照有关专著。四、作用方式和作用机理研究 农药对有害生物的作用方式是多种多样的，例如杀虫剂，主要作用方式可分为胃毒作用、触杀作用、薰蒸作用和内吸作用以及对行为的影响等。了解供试化合物的主要作用方式，不但对选用正确的生物筛选方法，而且对将来开发成商品农药后的施药技术，效果评价等都有
28、重大关系。例如，一个化合物只有胃毒作用而无触杀、薰蒸及内吸作用，那么在生物筛选中，试虫就必须选用鳞翅目、鞘翅目等害虫，让试虫在取食饲料时将药剂摄入消化道，如果选用蚜虫，飞虱等试虫，筛选工作就无法进行；同样，如果一个化合物无内吸作用，那么也不可能加工成粒剂施于土壤中防治作物上的蚜螨。因此，在生物筛选的最初阶段就应测定供试化合物主要有哪些作用方式，这一点在新农药开发中十分重要。 关于作用机理，特别是分子机理的阐明，同样是新农药研制开发的主要内容，但这一部分工作是在开发工作的后期进行。作用机理的研究反过来又可给新农药研究带来许多新的思想、新的启示，甚至提供新的途径，如前所述，发现新的先导化合物的途径
29、之一就是生物合理设计，而生物合理设计的基础是对其作用机理的深刻认识。第三节 农药安全评价 农药安全评价也是新农药研究与开发的重要内容。农药安全评价包括农药卫生毒理安全评价和农药环境安全评价两部分内容。一、农药卫生毒理安全评价 农药卫生毒理安全评价是通过动物试验和对人群的观察，来阐明农药的毒性及其潜在的危险性，其目的是为保护人类健康和制定预防措施提供理论依据。完整的农药毒理安全评价除进行系统的毒性试验外，还应进行按触人群的流行病调查。但对新农药研究与开发来说主要是对新农药进行动物毒性试验，然后将动物毒性试验资料进行定性定量评价后,用以预测对人类健康的危险性。 经复筛的活性化合物被选定具有继续深入
30、研究的价值时，即需进行第一和第二阶段的毒性试验，其结果作为评定是否再继续进行开发的依据。在活性化合物的制备、药效、第一和第二阶段毒性以及技术经济等方面的评价认为有商业开发价值并准备进行中试和大田药效试验时，即需进行第三和第四阶段毒性试验，并根据试验结果评价该化合物是否可作为商品农药使用。 各阶段的毒性试验内容如下: 第一阶段:急性毒性试验。包括急性经口毒性(LD50)试验；急性经皮毒性(LD50)试验；急性吸入毒性试验(适用于挥发性液体或可升华固体化合物)；眼刺激试验；皮肤刺激试验及皮肤致敏试验。 第二阶段：亚急性毒性试验。包括蓄积毒性试验；原核细胞基因突变试验及AMSE试验；体细胞：骨髓细胞
31、微核试验或骨髓细胞染色体畸变分析任选一项。生殖细胞：睾丸细胞染色体畸变分析或显性致死试验任选一项。亚急性毒性试验对动物的染毒时间一般为1428天。 第三阶段：亚慢性毒性试验。包括90天的经口试验；21天经皮试验；21天或28天吸入试验；迟发性神经毒性试验；两代繁殖试验；致畸试验和代谢试验。 第四阶段：慢性毒性试验。大鼠两年喂养试验，或小鼠一年半喂养试验。至于具体的试验方法和评价指标，读者可参阅卫生部、农业部制定的农药安全性毒理学评价程序。 二、农药环境安全评价 在新农药研究与开发过程中，当入选化合物要进行农药登记及商品化生产前必须进行环境安全评价试验。试验内容主要有： (一)环境行为 环境行为
32、是供试化合物在环境中发生的各种物理和化学现象的总称，包括化合物在环境中的化学行为与物理行为。化学行为主要指化合物在环境中的残留性及其降解与代谢过程；物理行为主要指化合物在环境中的移动性及其迁移扩散规律。 (二)生态效应 生态效应包括化合物对非靶标生物的毒性及化合物在生物体的富集作用。对非靶标生物的毒性主要包括对害虫天敌的影响，对鱼类的影响，对蚯蚓及土壤微生物的影响，对蜜蜂的影响，对家蚕的影响，对鸟类的影响等。具体的试验方法及评价指标，读者可参阅国家环保局南京环境科学研究所编写的化学农药环境安全评价试验准则。 第四节 农药管理和农药登记一、我国的农药管理制度 农药管理是为了保证农药质量，防止农药在生产、经营、使用过程中对人畜、环境产生危害，使其在农林牧业生产中发挥最大效益所制定的法律、法规或技术规范。由国家立法机关制定和颁布的有关法
