1、桑叶的生物活性成分药理成份产业化工艺路线0201doc6桑蚕资源的生物活性成分药理成份产业化工艺路线6.1桑资源的生物活性成分药理成份产业化工艺路线6.1.1桑枝总黄酮提取工艺优化黄酮类化合物的生物活性。黄酮类化合物是药用植物的主要活性成分之一，具有广泛的生物活性。具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、预防心血管疾病以及抗衰老等作用。随着研究方法和技术的不断提高，发现黄酮类化合物还具有清除自由基、抗菌消炎、抗过敏、抗病毒、抗癌和提高免疫力等作用。我国桑枝资源丰富，不管直接以桑枝作为药材而进行初级开发，还是以其为原料，用以中药制剂或者保健品的次级开发，或者用以天然药物产品的深度开发，桑枝均具有重大的综
2、合利用价值。利用桑枝黄酮类化合物开发新药或者保健品，更具有广阔的应用前景。(1)桑枝总黄酮提取工艺研究。本实验探讨了提取时间、乙醇浓度、料液质量浓度及温度对桑枝总黄酮提取效果的影响，在此基础上利用正交试验，采用极差和方差分析法确定了黄酮的最佳提取工艺条件：温度为80、料液质量浓度33g/L、乙醇浓度70、浸提时间120min。在该条件下，其提取率可达101。(2)桑枝总黄酮的分离纯化研究。本试验探讨了聚酰胺分离纯化桑枝总黄酮的静态吸附和动态吸附两方面的技术参数，静态吸附上样量1：274gg(净黄酮量：树脂量)、动态吸附上样量l：61gg、上样浓度2149mgmL、吸附流速和解析流速均为lmLm
3、in、吸附时间lh、70乙醇作为洗脱剂。在此条件下黄酮的洗脱量可达9229。(3) 桑枝中桑色素的分离纯化及检测。采用95乙醇浸提，乙酸乙酯萃取，聚酰胺树脂吸附色谱法对桑色素进行分离纯化。结果表明，该方法可提取分离到高纯度的桑色素。薄层层析色谱法显示，以氯仿：甲醇：醋酸(15：5：2)作为展开剂，用1硝酸铝醇溶液显色，可于波长为365nm的紫外灯下观察到桑色素显绿色荧光。用高效液相色谱作定性检测，结果表明，用symmetryC-18(46x150mm)色谱柱，以甲醇：水：磷酸(50：498：O2)为流动相，流速为lmLmin，柱温30，在波长370nm处桑色素具有良好的色谱吸收峰。（4）体外抗
4、氧化活性研究。本试验以VE做对照，从清除自由基能力和还原能力两方面评价了芦丁、槲皮素、桑色素和桑枝总黄酮抗氧化能力。结果表明，槲皮素对DPPH的清除能力最强，是VE的14倍，桑色素和桑枝总黄酮的清除能力相近且弱于槲皮素，芦丁清除能力最弱；在002-008mgmL范围内，槲皮素的还原能力最强，桑色素和桑枝总黄酮与VE的还原能力相近，且弱于槲皮素，芦丁的还原能力最弱。（5）不同品种桑枝总黄酮含量比较。本试验对本校桑树种质资源圃中保存的几种生产上广泛种植的栽培品种的桑枝总黄酮含量进行了测定比较，结果显示， 不同品种之间桑枝总黄酮含量差异较大。一、研究内容(1)研究xx桑树种质资源圃中嘉陵20号的桑枝
5、为材料，选择提取时间、乙醇浓度、料液质量浓度及温度对桑枝总黄酮提取效果进行了单因素实验，在此基础上利用正交实验，采用极差和方差分析法确定了桑枝黄酮的最佳提取工艺条件。(2)以聚酰胺为材料，通过静态和动态吸附实验，研究了聚酰胺分离纯化桑枝总黄酮的最佳技术参数。(3)采用95乙醇浸提，有机溶剂萃取，聚酰胺树脂吸附色谱法对桑色素进行分离纯化，用薄层层析色谱与高效液相色谱相结合的方式进行定性分析，确定了分离纯化及鉴定桑色素的技术路线和方法。(4)以VE做对照，从清除自由基能力和还原能力两方面评价了芦丁、槲皮素、桑色素和桑枝总黄酮的抗氧化能力。(5)利用NaN02-Al(N03)3-NaOH分光光度法测
6、定了广泛种植的几种桑树栽培品种桑枝总黄酮含量并比较了其差异性。二、桑枝总黄酮提取工艺优化利用实验室的常用的仪器设备条件对人工三倍体嘉陵20桑枝黄酮进行粗体工艺优化，技术路线如下：桑枝总黄酮提取工艺优化6.1.2 桑叶黄酮提取纯化工艺及对尿酸代谢的影响 一 、桑叶黄酮是其中主要的生物活性成分，药理学研究表明：桑叶黄酮具有调节-葡萄糖苷酶、降血糖、抗肿瘤等药理活性。而且黄酮类化合物对高尿酸血症有效。为深度利用资源，本文对黄酮的提取分离技术进行了工艺研究，并后研究了桑叶黄酮对高尿酸血症模型的降尿酸的作用。研究通过高压液相色谱法对桑叶黄酮类化合物进行成分分析，结果表明，其主要成分为芦丁，杨梅素，槲皮素
7、，山奈素等。采用正交试验法对提取桑叶黄酮的工艺进行优化，结果表明，最佳的浸提条件为：在80下70乙醇回流提取2次，每次15h，料液比为1：2 0(wv)。为得到纯度较高的桑叶总黄酮，采用大孔树脂吸附法进行黄酮纯化，以桑叶总黄酮的得率和纯度为指标，比较了五种大孔树脂的吸附性能，结果显示HPD826大孔树脂对桑叶总黄酮吸附性能最好；进一步采用正交试验法对HPD826大孔树脂纯化桑叶黄酮的工艺进行优化，所获最佳条件组合为：取浓度为4mgml左右的桑叶提取液上样，上样体积为15树脂体积数(BV)，上样速率控制在2 BVh左右，之后用3 BV， 60的乙醇， 以1 BVh的速率洗脱，纯化后的桑叶黄酮得率
8、为195，纯度5541。 所以选择体外实验探讨桑叶黄酮(MLF)对大鼠肝脏匀浆液中黄嘌呤氧化酶(XO)活性的影响，结果显示：MLF剂量依赖性地抑制大鼠肝脏匀浆液XO活性，在10000 mgL抑制率与别嘌醇(AP)无显著差异，提示MLF可能具有降尿酸活性。进一步研究其对正常小鼠血清UA含量和肝脏匀浆液XO活性的影响，以50、100、200 mg/kg*d_1剂量MLF灌胃正常小鼠14d，测定相关指标。结果显示：MLF三种剂量与对照组相比对正常小鼠体内血清UA含量和肝脏匀浆XO活性均无显著性影响，对小鼠体重和脏器系数无显著影响。采用氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠模型评价了MLF的降尿酸活性，以50、
9、100、200 mg/kg*d_1剂量MLF灌胃正常小鼠14d，检测相关指标，结果显示：200mgkg bW MLF可极显著(P001)降低模型小鼠血清尿酸含量，下降1667；并能显著(P005)，但能极显著降低模型小鼠血清尿酸含量(P提取次数料液比提取时间。综合各种因素，确定桑叶总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度7096、提取温度80、料液比1：2 O、提取时间15h提取2次。 运用静态吸附与解吸实验对对5种吸附树脂的吸附和解吸特性的比较，发现树脂的极性、比表面积和平均孔径的大小直接影响树脂吸附容量和解吸率。结果表明，考察的几个大孔树脂中，HPD826型大孔树脂表现出最好的吸附性能与良好的解吸效
10、果。因此选用HPD826型大孔树脂对桑叶总黄酮进行纯化。通过单因素实验、正交实验以及方差分析确定了桑叶总黄酮分离富集的最佳操作条件。研究结果表明，最佳工艺条件为：上样体积为15 BV，上样速率控制在2 Bvh左右。上样结束后， 再用3 Bv， 60的乙醇， 以1 BVh的速率洗脱。 由本实验室制备流程是：桑叶-干燥粉碎石油醚脱脂乙醇提取过滤浓液离心石油醚萃取下层水溶液上柱纯化水洗乙醇洗脱收集洗脱液低温干干燥。通过以上流程得到精制的桑叶黄酮，其纯度为5541。 本文主要就桑叶的活性成分、桑叶黄酮的提取纯化工艺研究、桑叶黄酮对正常小鼠尿酸代谢的影响和对高尿酸模型尿酸代谢的影响四个方面进行研究，现将
11、主要成果总结如下： l在成分分析方面，桑叶中含量较多的天然产物为多酚、黄酮和多糖，进一步采用唧LC法测定，桑叶含有较多芦丁，杨梅素，槲皮素，山奈素等黄酮类物质。 2通过桑叶黄酮的提取纯化工艺研究，综合各种因素，确定桑叶总黄酮的最佳提取纯化工艺，得到精制的桑叶黄酮。 3桑叶黄酮对正常小鼠的实验表明，MLF对正常状态下的小鼠无影响。4桑叶黄酮对氧嗪酸钾致高尿酸血症小鼠的实验表明，MLF对于XO活性具有抑制作用，对高尿酸血症有一定的改善效应。桑叶黄酮有效降低腺嘌呤诱导高尿酸血症大鼠的血尿酸水平，缓解高尿酸对肾脏的损伤，其可能的作用机理为：一方面，本研究提示MLF组对肝脏XO有明显抑制作用，提示XO是
12、MLF在体内的药物靶点之一。另一方面MLF能影响磷酸戊糖途径，使uA生成减少，模型动物血清TG，UA水平均显著降低。6.1.3 桑叶1-脱氧野尻霉素提取分离方法研究研究了从桑叶中提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ ) ,探讨了提取剂、提取方法、料液比、提取次数、时间等因素对提取率的影响。实验表明:提取的最佳条件为以65%的乙醇为提取剂,按料液比18和14超声强化细胞破碎20 min (功率1800W) , 732 H阳离子树脂分离, 0. 25 mol /L 的氨水洗脱(洗脱速度1 2 mL /min) ,提取率为95. 8% ,得率为124. 54 mg/100 g,纯度为92. 3%以上。本
13、方法具有工艺流程简单、快速、提取率高的优点,适合于工业生产。1实验部分1. 1试剂与仪器桑叶,购于药材市场(经检测DNJ含量为130 mg/100 g) ; 732 H阳离子交换树脂,钠型;食用乙醇(95%) ;硫酸、盐酸、氨水、正丁醇、碘化钾等均为分析纯。FZ102微型植物试样粉碎机; JY98-超声波细胞粉碎机; RE-52旋转蒸发器; 752紫外可见光栅分光光度计。1. 2工艺流程图1工艺流程图Fig. 1Diagram of craft1. 3操作方法将桑叶粉碎过40目筛,称取100 g于1000 mL烧杯中,加65%乙醇800 mL浸泡30 min,放入超声波细胞破碎机中处理20 m
14、in,过滤,收集滤液,残渣加入400 mL 65%乙醇重复处理一次,过滤,弃去残渣,合并两次滤液,将滤液用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩至小体积,进行离心分离。收集上清液并通过内装阳离子交换树脂的交换柱,用蒸馏水冲洗至流出液无色为止。用0. 25 mol/L的氨水洗脱(洗脱速度12 mL /min) ,收集洗脱液。将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩,用浓缩液一倍体积的正丁醇萃取3次,弃去水层合并正丁醇相,回收正丁醇,真空干燥即得成品。1. 4提取率计算提取率的定义为:a =m1m100% (1)式中aDNJ提取率, %;m1 提取液中DNJ的含量,mg/100 g;m 样品中DNJ的含量,mg/100 g。2
15、结果与讨论2. 1提取剂的选择称取粉碎过40目筛的样品100 g三份,放入三个1000 mL烧瓶中,分别加入蒸馏水、0. 25%的稀硫酸、65%乙醇800 mL,在相同的条件下回流提取,过滤,定容至1000 mL容量瓶中。采用分光光度法测定DNJ的含量,结果见表1。表1不同提取剂与提取率的关系Table 1Rela tion between extraction ra te and var iety of solven ts提取剂 提取剂方法 提取时间/h 提取次数 温度/ 料液比/ ( gmL - 1 ) DNJ 提取量/ mg(100 g) - 1 提取率/%蒸馏水 回流提取 2 1 80
16、 18 78. 26 60. 20. 25%的稀硫酸 回流提取 2 1 80 18 106. 99 82. 365%的乙醇 回流提取 2 1 80 18 103. 22 79. 2由表1可知, 0. 25%的稀硫酸提取率最高, 65%乙醇次之,蒸馏水最差。因为DNJ属于生物碱类化合物,易溶解于酸性介质,形成可溶性盐。从实验结果来看65%乙醇与0. 25%的稀硫酸对DNJ的提取率相差不大,而稀硫酸提取液过滤及浓缩相对困难,故本方法采用65%乙醇作为提取剂。2. 2提取方法的选择取样品100 g两份,一份加65%的乙醇800 mL于1000 mL烧杯中,放入超声波细胞破碎机中提取,另一份放入100
17、0 mL烧瓶中,加入相同浓度和相同体积的乙醇,在80下进行回流提取,图2不同提取方法与提取率的关系Fig. 2Relation between extraction rate anddifferent extraction methods由图2可知, 20 min时,超声强化细胞破碎提取法的提取率为92. 7%, 2 h时热回流法的提取率为79. 2%。超声强化细胞破碎法提取与常规热回流相比,DNJ提取率高13. 5% ,时间仅为1 /6。这是因为当桑叶在溶剂中受到超声作用后,超声产生的空化效应,使溶剂随超声产生的空化泡的崩溃,很快渗透到桑叶内部细胞中,并使细胞内的DNJ 快速渗透、溶解并转入
18、溶剂,使细胞内外出现浓度差,促使DNJ从高浓度溶液向低浓度溶液中扩散,大大加速了提取过程。同时伴随着空化泡崩溃瞬间释放出来的能量,使桑叶中的细胞壁破裂,溶剂直接进入细胞内部,使细胞中的DNJ 在超声作用下直接转入溶剂中,通过溶剂将细胞中的DNJ在很短时间内全部提取出来。与传统提取法相比,增加了物质内部化学成分的提取率。而热回流法随着时间的延长,提取率开始增高后有所下降,是部分DNJ遭到破坏所致。2. 3提取时间的选择将样品100 g, 加入65%的乙醇800 mL 于1000 mL烧杯中,放入超声波细胞破碎机中提取,测定不同时间的提取率,超声强化细胞破碎提与提取率的关系见图3。图3超声强化细胞
19、破碎提取时间与提取率的关系Fig. 3Relation between extraction rate and ultrasonic time由图3可知,提取率随超声波提取时间的增加而增大, 20 min时,随着时间的增加,提取率趋于平缓。本实验选取20 min作为提取时间。2. 4乙醇浓度的选择取样品100 g四份,分别加入50% , 60% , 65%和70%四种不同浓度的乙醇800 mL于1000 mL烧杯中,在相同条件下进行超声强化细胞破碎提取一次,测定DNJ含量,结果见表2。表2不同乙醇浓度与提取率的关系Table 2Rela tion between extraction ra t
20、e andd ifferen t concen tra tion of ethanol溶 剂 提取方法 超声时间/min 提取次数 DNJ提取量/ mg(100 g) - 1 提取率/%50%乙醇 超声破碎提取 20 1 80. 86 62. 260%乙醇 超声破碎提取 20 1 90. 22 69. 465%乙醇 超声破碎提取 20 1 120. 51 92. 770%乙醇 超声破碎提取 20 1 116. 64 89. 5由表2可知, 65%乙醇提取效果最好。2. 5料液比及提取次数的选择取样品100 g四份,加入65%乙醇,按料液比(摩尔比) 14, 16, 18, 110进行超声强化细
21、胞破碎提取两次,每次20 min,结果见表3。表3不同料液比与提取率的关系Table 3Rela tion between extraction ra te andd ifferen tma ter ia l liqu id ra tio料液比/ ( gmL - 1 ) 提取次数 DNJ提取量/ mg(100 g) - 1 提取率/% 14 1 110.76 85. 2 2 119. 73 92. 1 16 1 117. 39 90.3 2 121. 94 93.8 18 1 120.51 92.7 2 126.49 97.3 110 1 122.98 94.6 2 127.53 98.1 由
22、表3可知,随着料液比的增加,溶解出来的产物也增多。当料液比为1 8 一次提取时, 已有92. 7%的DNJ被提取出来,两次为97. 3% ,但过多的乙醇会给后工序的乙醇回收造成负担。故选用料液比为18 和1 4 各一次提取,这时的提取率为95. 8%。2. 6成品分离及纯度检测取样品100 g于1000 mL 烧杯中,按照上述实验得到的最佳提取条件进行超声强化细胞破碎提取,DNJ得率为124. 54 mg/100 g。将得到的DNJ 提取液上内装阳离子交换树脂的交换柱, 用蒸馏水洗至流出液无色为止。用0. 25 mol/L的氨水洗脱(洗脱速度1 2 mL /min) ,收集洗脱液。将洗脱液用旋
23、转蒸发仪浓缩,正丁醇萃取,回收正丁醇,真空干燥得到成品。经检测纯度为93. 2%。3结论(1)上述实验证明, DNJ 提取的最佳生产条件为: 65%乙醇作为提取剂,按料液比18和14各一次进行超声波提取20 min。提取液通过阳离子交换树脂,以0. 25 mol/L 的氨水洗脱,流速控制在1 2 mL /min,洗脱液经正丁醇萃取,浓缩、干燥后得到成品。(2)DNJ提取率为95. 8% ,得率为124. 54 mg/100 g,纯度可以达到93. 2%。(3)超声强化细胞破碎提取法具有快速、简便、提取温度低、提取率高的优点,不会使桑叶的有效成分破坏。( 4)本方法工艺流程简单、快速、提取率高,
24、适合于工业生产,为桑叶的综合利用及糖尿病的预防和治疗药物的开发奠定了一定的基础。6.1.4 桑叶中1-脱氧野尻霉素的检测、提取及其生理活性研究 DNJ之所以被人们越来越重视，主要由于它具有治疗糖尿病、抑制肿瘤转移、抑制病毒、抗滤过性病原体、高纯度麦芽糖的酶合成、在大鼠体内的代谢、减肥和增加胰岛素敏感性等作用。目前国际市场主要需要的桑叶提取物产品DNJ含量基本都在10以上甚至有些要20以上，而国内生产的桑叶提取物中DNJ的含量大都在5以下，由此可以看出我国在这方面的发展空间还是比较大的。其实在高纯度DNJ产品上同样有较大的发展空间，5mg纯度为95DNJ标准品其市场售价可达1500元人民币,而纯
25、度为99，99同样重量的DNJ产品更能卖到3000元以上，故进行较高纯度桑叶中DNJ分离纯化研究具有相当的经济价值。在干桑叶中的DNJ含量一般为01左右，在桑根部位会略高一些为014。其实，DNJ不仅在桑树不同部位含量有差异，即使是相同部位比如桑叶，不同品种其中的含量差异也是很大的。DNJ的提取：1乙醇浸泡提取法，先用65乙醇浸泡样品粉末20min，然后过虑取滤液，剩下的残渣再用的65乙醇再重复处理一次所得滤液和前一次合并。用旋转蒸发仪蒸发滤液，回收乙醇并将滤液浓缩到小体积。离心后取上清液，并使其通过阳离子交换树脂。先用蒸馏水冲洗直到流出液为无色，然后再用025 molL的氨水洗脱（洗脱速度l
26、2 mlmin)，收集洗脱液。用旋转蒸发仪浓缩洗脱液，再用洗脱液相同体积的正丁醇萃取3次。取正丁醇相弃去水相，真空干燥就可得成品提取率为958，得率为12454 rag100 g，纯度为923以上。2蒸馏水提取法，把桑叶粉碎后放进蒸馏水中进行回流加热，225小时间后过虑取水溶液然后再重复一次合并两次提取液，再利用阳离子交换柱(00lx7型)层析对DNJ进行了初步纯化，收集pH为94105的洗脱液。3微波辅助提取法，把一定量桑叶粉末加入无菌过滤水中其固液比例为1：40(gm1)。在微波炉中加热15min，提取两次。其中微波炉的功率为406W。然后乘热洗涤残渣，浓缩，置于50mL容量瓶中，作为供试品溶液待用，最后得DNJ提取率为0024。4超临界流体萃取法，超临界流体是物质在临界温度和临界压力以上的一种特殊状态，它既不是气体也不是液体而是具有二者双重优点的流体状态。在超临界状态下，超临界流
