1、临床检验技师微生物病毒感染的实验诊断讲义第二十七章病毒感染的实验诊断本章内容病毒的基本性状病毒的分类与命名病毒感染的实验诊断各类病毒感染的简介病毒的基本性状病毒是一类非细胞型微生物。个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。仅含一种核酸作为遗传物质。（DNA或者RNA）外被蛋白质衣壳或还有包膜。病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。病毒的基本性状形态结构大小和形状大小：单位用纳米表示。1nm=1/1000m大型病毒（200300nm）中型病毒（80160nm）小型病毒（1830nm）形态：球形或近似球形、杆状、弹状、砖形、蝌蚪状等。
2、基本结构指病毒的核心和衣壳两部分。辅助结构包膜病毒的基本性状病毒的增殖病毒必须依赖宿主细胞，以特殊的自我复制方式进行增殖。复制周期：吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与成熟、释放。若病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能组装或释放有感染性的病毒颗粒，称为顿挫感染。由于病毒基因组不完整或基因位点改变而复制出不完整无感染性的病毒，称为缺损病毒。病毒的基本性状噬菌体以细菌、真菌等为宿主，在其中增殖能引起细菌等裂解的病毒称噬菌体。噬菌体具有识别细菌表面特异受体的功能。噬菌体感染细菌后产生两种后果，一是建立溶菌周期；二是建立溶原状态。病毒的基本性状非寻常病毒比病毒更小更简单的致病因子，又称为亚病毒因子，
3、包括类病毒、卫星病毒和朊粒等。病毒的分类与命名病毒分类的依据和原则是病毒的基本性质。病毒分类的一般系统是科、属、种3级。将病毒分为DNA病毒、RNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒三大类。目前认为有24个科的病毒能感染人和动物。按传播途径：呼吸道病毒、胃肠炎病毒、经性传播感染的病毒等。按感染部位与症状特征：肝炎病毒、出血性热病毒、疱疹病毒等。病毒感染的实验室诊断病毒学实验诊断有三个方面：直接检测和分离鉴定；检测病毒蛋白抗原成分和核酸；检测抗体。病毒感染的实验室诊断标本采集、运送及处理标本采集（1）采样时机：应在病人急性期或发病初期采集标本。（2）标本种类：根据不同病毒感染采集不同标本。标本的运送
4、及保存大多数病毒抵抗力较弱，在室温中易被灭活，所以标本要快速运送，立即处理和接种。采集和运送保存均在4，长时间保存需置-70。标本处理根据不同种类的标本，运用不同的处理方法。病毒感染的实验室诊断分离培养与鉴定分离培养（1）组织培养：包括器官培养、组织块培养和细胞培养。针对不同的欲检测病毒，选择适当的培养细胞。细胞培养分：原代和次代细胞培养；二倍体细胞株；传代细胞系。（2）鸡胚接种：鸡胚常用于黏液病毒、疱疹病毒、痘类病毒等的原代分离。（3）动物接种：常用新生小鼠或乳鼠进行病毒分离。根据病毒种类不同，需选择相应的敏感动物，还需接种相应的合适部位。病毒鉴定（1）初步鉴定：根据临床症状、流行病学特点、
5、标本来源、易感动物范围、细胞病变特征及生物学特征、理化性质可初步判断病毒的科及属。（2）最终鉴定：在初步鉴定的基础上，选择适当的血清学方法对病毒分离株进行最后鉴定。常用的有中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、免疫荧光试验、酶免疫试验等。病毒感染的实验室诊断病毒感染的诊断显微镜检查（1）用光学显微镜直接检查病毒包涵体。包涵体检查可作为病毒感染的辅助诊断，不是特异性试验。（2）用电子显微镜直接检查病毒颗粒，数小时即可从病毒形态上作出明确的鉴别诊断。应用免疫电镜灵敏度更高。病毒抗原检查利用特异性免疫血清检测标本中病毒抗原。病毒抗体检查利用特异性抗原检测病毒感染者血清中IgM和IgG抗体。IgM抗体
6、出现在病毒感染的早期。IgG抗体检测需采集感染急性期与恢复期双份血清，恢复期IgG效价必须比急性期增高4倍或4倍以上时，才有诊断意义。病毒核酸检测利用核酸杂交和PCR技术检测病毒特异基因片段。但检出病毒核酸并不等于检出具有传染性的病毒颗粒。流行性感冒病毒生物学性状分节段的单负股RNA病毒。形态：球形或丝状。结构：核心：由核酸和核蛋白组成。基质蛋白（M蛋白）：保护核心与维持病毒外形。包膜：血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。分型：变异：流感病毒易发生变异，变异的物质基础是HA和NA，两者变异可同时出现，也可单独出现。培养特性：鸡胚接种培养；原代猴肾细胞或犬肾传代细胞培养；利用红细胞凝集试验确定病
7、毒的存在。抵抗力：不耐热，对干燥、日光、紫外线以及甲醛、乙醇等均敏感。流行性感冒病毒微生物检验标本采集和处理：在发病急性期，以前三天为最好。合理采集相应标本，如鼻腔洗液、咽拭子、鼻拭子等，置于Hanks液中。低温运送保存。分离培养与鉴定：接种于鸡胚羊膜腔，收集羊水和尿囊液进行血凝试验、血凝抑制试验进行鉴定。快速诊断：免疫荧光技术和酶免疫技术。分子杂交技术。PCR技术。免疫电镜技术。血清学诊断：需同时检测急性期（5d以内）和恢复期（24周）血清，在相同条件下进行血凝抑制试验，如恢复期抗体效价比急性期高4倍或4倍以上即有诊断意义。流行性感冒病毒临床意义副流感病毒生物学性状单负股RNA，不分节段。包
8、膜上嵌有两种糖蛋白刺突，一种为HN，具有血凝和神经氨酸酶活性，具有流感病毒HA的吸附作用；另一种为F，具有使病毒进入宿主细胞和使病毒在宿主细胞之间传播的作用。副流感病毒抵抗力弱，不耐酸，对热敏感。副流感病毒微生物检验标本采集和处理分离培养：最敏感的细胞是原代人胚肾和原代猴肾细胞。病毒鉴定：最常用的方法是红细胞吸附抑制试验，亦可用血凝抑制试验、中和试验和补体结合试验对病毒进行鉴定。直接检测病毒抗原：间接免疫荧光法、ELISA、放射免疫和电镜技术。血清学诊断副流感病毒临床意义副流感病毒经感染者呼吸道分泌物通过人与人密切接触或气溶胶传播，可引起儿童和成人上呼吸道感染。呼吸道合胞病毒生物学性状核酸为单
9、负股RNA，不分节段。球形，单个病毒颗粒具有多形性。包膜上的G蛋白作用类似流感病毒的血凝素蛋白HA，包膜上的F蛋白是融合蛋白，介导病毒穿入和细胞融合。呼吸道合胞病毒微生物检验标本采集和处理分离培养与鉴定：不能在鸡胚中增殖，可在人类上皮细胞传代细胞系内增殖。细胞病变特点为合胞体形成即细胞融合成多核巨细胞，胞质内形成嗜酸性包涵体。直接检测病毒抗原：免疫荧光技术、酶免疫技术。血清学诊断：中和试验、免疫荧光试验和酶免疫试验检查血清中IgG、IgM及IgA。呼吸道合胞病毒临床意义引起婴幼儿下呼吸道疾病的最常见的病毒。最常见的传播途径是经飞沫传染，最易引起婴幼儿细支气管炎和细支气管肺炎，较大儿童和成人主要
10、引起上呼吸道感染。腺病毒中等大小的无包膜病毒，核心为单一线形双股DNA。可在细胞核中形成嗜碱性包涵体。感染可常年流行，常引起呼吸道疾病，上呼吸道感染多见普通感冒、咽炎、扁桃体炎。下呼吸道疾病有支气管炎、细支气管炎和肺炎。也可引起其他器官感染。麻疹病毒病毒呈球形，核心为单负链RNA。三种衣壳蛋白（L、P、N）。包膜内面为M蛋白，包膜表面有血凝素（H蛋白）和融合蛋白（F）；H蛋白与细胞表面病毒受体CD46结合，感染宿主。可在受感染细胞产生细胞融合和多核巨细胞，胞质和胞核内有嗜酸性包涵体。儿童时期最常见的急性呼吸道传染病。飞沫传播，冬春季易发病。病毒侵入上呼吸道和眼结膜上皮细胞内增殖。麻疹病毒还可引
11、起较为少见的远期并发症是亚急性硬化性全脑炎（SSPE）。风疹病毒球形，核心为单正链RNA。包膜表面有血凝素。ELISA法检测血清特异性IgM可协助诊断。风疹是全身麻疹样出疹伴耳后及枕下淋巴结肿大为特征的急性呼吸道传染病。病毒在局部淋巴结增殖后，通过病毒血症播散全身。孕妇在妊娠早期感染病毒，经胎盘垂直传播感染胎儿，可引起先天性风疹综合征。冠状病毒正链单股RNA病毒，含包膜。鉴定方法：荧光免疫法，电镜检查法，核酸序列检测法等。成人和较大儿童上呼吸道感染的重要病因。主要引起普通感冒和咽炎。大约10%30%的普通感冒由该病毒引起。SARS冠状病毒是严重急性呼吸综合征的病原体。近距离呼吸道飞沫传播。禽流
12、感病毒禽流感病毒是甲型流感病毒的一种亚型，可引起禽流行性感冒。目前发现感染H5N1亚型的患者病情严重，致死率高。采用鸡胚培养法分离病毒。也可作病毒抗原、抗体及核酸的检测。病毒核酸类型所致疾病流行性感冒病毒（）ssRNA流行性感冒副流感病毒（）ssRNA感冒、支气管炎、肺炎呼吸道合胞病毒（）ssRNA婴儿支气管炎、肺炎腺病毒dsDNA感冒、咽炎、扁桃体炎、肺炎麻疹病毒（）ssRNA麻疹风疹病毒（+）ssRNA风疹、胎儿畸形冠状病毒（+）ssRNA感冒、咽炎、SARS肠道病毒属小RNA病毒科肠道病毒属。由粪-口途径传播。肠道病毒生物学性状形态结构：球形；由简单的病毒衣壳和单股正链RNA组成。培养要
13、求：能在猴肾、人胚肾、人羊膜细胞、HEP-2、HeLa细胞中增殖，最适生长温度为3637。抵抗力：较强，在污水及粪便中可生存数月。对酸及乙醚稳定，对紫外线、干燥及热敏感，5630min可灭活。肠道病毒微生物检验标本的采集与处理直接检测病毒：电镜检查及酶免疫法、PCR。病毒分离：猴细胞系对脊髓灰质炎病毒、B组柯萨奇病毒和ECH0病毒具有良好的敏感性。人类二倍体成纤维细胞，如WI-38和HELF适合于A组柯萨奇病毒的分离。病毒鉴定：中和试验、PCR及免疫荧光法。血清学诊断：中和试验、补体结合试验及血凝抑制试验。肠道病毒临床意义病毒的靶器官以神经系统、肌肉和其他系统为主。其中脊髓灰质炎病毒可损害脊髓
14、前角运动神经细胞，导致脊髓灰质炎即小儿麻痹症。手足口病：柯萨奇A16病毒，新型肠道病毒71。疱疹性咽峡炎：柯萨奇A病毒。心肌炎及心包炎：柯萨奇B病毒。无菌性脑炎：柯萨奇B病毒、ECHO病毒。新生儿全身感染性疾病：柯萨奇B病毒、ECHO病毒。黄病毒是指一大群通过吸血的节肢动物而传播疾病的病毒。小球形，+ssRNA，有季节性、地方性和自然疫源性。致病性强，病情重。流行性乙型脑炎病毒生物学性状形态结构：简称乙脑病毒，基因组为单正链RNA。培养特点：出生23d的乳鼠脑内接种后35d即可发病；可在地鼠肾，幼猪肾等原代培养细胞内增殖，并引起明显的细胞病变。乙脑病毒抗原性稳定，很少变异。流行性乙型脑炎病毒微
15、生物检验标本直接检查：免疫荧光技术、酶免疫技术、核酸探针等。分离培养与鉴定：乳鼠脑内接种、原代金色地鼠肾细胞等培养细胞。根据细胞病变、红细胞吸附试验证实病毒的增殖，阳性即可传代或鉴定。血清学诊断：中和试验、血凝抑制、补体结合试验等。流行性乙型脑炎病毒临床意义引起流行性乙型脑炎，简称乙脑。通过三带喙库蚊叮咬传播，猪为最重要的宿主和传染源。病毒流行主要在夏秋季节。人感染后，绝大多数表现为隐性或轻型感染。只有少数发生脑炎。病毒侵入脑组织内增殖，造成脑实质病变，表现为高热、惊厥或昏迷症状。森林脑炎病毒形态结构、微生物检验与乙脑病毒近似。可经蜱传播，引起人类森林脑炎。森林硬蜱为主要传播媒介和储存宿主。亦
16、可经胃肠道传播。人感染后，有相当一部分表现为隐性感染，发病者潜伏期约1014d，然后出现高热、头痛、脑膜刺激征、昏迷等。登革病毒病毒形态结构与乙脑病毒相似。蚊体胸内接种培养，白纹伊蚊的传代细胞（C6/36株）或地鼠肾细胞进行培养，初生小鼠动物接种。血凝抑制试验、ELISA及斑点免疫测定法检测特异性IgM抗体等方法鉴定。储存于人和猴体内，通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等传播。临床上分为普通型登革热和登革出血热/登革休克综合征两个类型。出血热病毒汉坦病毒新疆出血热病毒汉坦病毒生物学性状形态结构：圆形、椭圆形或多形性。单负股RNA。培养特点：人肺传代细胞（A549），非洲绿猴肾细胞（Vero-E6），人胚肺
17、二倍体细胞（2BS）及地鼠肾细胞中增殖，不引起明显的细胞病变。易感动物有多种。抵抗力：对脂溶剂敏感，对酸抵抗力弱，601h可被灭活。汉坦病毒微生物检验病毒分离与抗原检测：常用Vero-E6细胞、A549细胞分离病毒。通过免疫荧光抗体染色检查细胞胞浆内的病毒抗原。血清学诊断：免疫荧光染色检查病毒特异性IgM或IgG抗体；ELISA检测特异性IgM。汉坦病毒临床意义可引起肾综合征出血热（HFRS）。病毒侵入人体后约有2周的潜伏期，可引起流行性出血热，起病急，典型临床表现为高热、出血和肾损害。伴有三痛（头痛、眼眶痛、腰痛）及红（面、颈、上胸部潮红）。眼结膜、咽部及软腭充血，软腭、腋下、前胸等处有出血
18、点。临床经过可分为发热期、低血压期、少尿期、多尿期和恢复期。新疆出血热病毒呈圆形或椭圆形，病毒结构、培养特性和抵抗力与汉坦病毒相似。可引起新疆出血热，属一种自然疫源性疾病。野生啮齿动物及家畜是主要储存宿主，硬蜱是该病毒的传播媒介，亦是储存宿主，潜伏期210d，大多数感染者突然发热，表现为发热、全身肌肉痛、中毒症状和出血。疱疹病毒单纯疱疹病毒水痘-带状疱疹病毒巨细胞病毒EB病毒疱疹病毒共同特征病毒呈球形，有包膜。病毒基因组为线性dsDNA。病毒感染细胞与邻近未感染细胞融合，形成多核巨细胞。单纯疱疹病毒生物学性状形态结构：有包膜的DNA病毒，为双股线状DNA。培养特性：能在多种细胞内增殖，细胞被感
19、染后出现肿胀、变圆、出现嗜酸性核内包涵体。可感染多种动物。单纯疱疹病毒微生物检验病毒分离与抗原检测：免疫电镜检查病毒颗粒或病变细胞，或吉姆萨染色后在光学显微镜下检查多核巨细胞和胞核内嗜酸性包涵体。采用直接免疫荧光法或酶免疫法进行病毒抗原检测。分子生物学诊断：可利用核酸杂交技术或PCR技术检测出HSV。血清学诊断：ELISA或胶乳凝集试验检测HSV抗体。单纯疱疹病毒临床意义直接密切接触和性接触传播，也可经飞沫及垂直传播。HSV-1感染常局限在口咽部，引起口咽部疱疹、疱疹性角结膜炎、脑炎等。多见于半岁以后的婴幼儿，大多数呈隐性感染。HSV-2的原发感染多见于青春期以后的患者，主要通过生殖道途径传播
20、，主要表现为生殖器疱疹。孕妇在胎儿胚胎期感染HSV，有引起流产、早产、死胎或先天畸形、智力低下等危险。水痘-带状疱疹病毒（VZV）基本特性与HSV相似。VZV能在人胚二倍体肾细胞（HFDK）或人胚二倍体肺细胞（HFDL）培养中增殖。受感染的细胞出现嗜酸性核内包涵体和多核巨细胞。引起水痘（儿童-原发感染）和带状疱疹（成人-复发感染）。巨细胞病毒生物学性状形态结构：有包膜的DNA病毒，为双股线状DNA。人CMV（HCMV）只能感染人。培养特性：体外培养HCMV只能在人成纤维细胞中才能增殖。细胞病变特点为肿胀，核变大形成巨大细胞，核内有致密的嗜碱性包涵体，形似猫头鹰眼特征。抵抗力：加热5630min
21、，低pH、乙醚、紫外线、反复冻融均能灭活。巨细胞病毒微生物检验病毒分离与抗原检测：HE染色等观察巨大细胞和细胞核内的包涵体。也可利用免疫荧光技术检查标本中的HCMV抗原，亦可利用酶免疫法检查。利用核酸杂交或PCR技术检测HCMV的核酸。血清学诊断：ELISA或IFA来检测HCMVIgG抗体或IgM抗体。巨细胞病毒临床意义可通过多种途径传播。正常人感染：人群中感染非常广泛，通常呈现隐性感染，少数出现传染性单核细胞增多症。免疫功能缺损的个体的感染：HCMV感染所致的间质性肺炎是骨髓移植受者的首位死因。AIDS患者HCMV感染以肺、中枢神经系统和胃肠道感染最为常见。先天性和围生期感染。EB病毒生物学
22、性状形态结构：形态与其他疱疹病毒相似，病毒颗粒为球形。培养特性：不能用常规的疱疹病毒培养方法进行培养。一般用人脐血淋巴细胞或从外周血分离的B淋巴细胞培养。抗原性：根据病毒抗原表达时所处的病毒增殖周期的不同阶段，将EBV抗原分为3类。EB病毒微生物检验病毒分离与抗原检测：接种人脐带血淋巴细胞对EB病毒进行分离培养，孵育4周，病毒阳性培养物，通过抗补体免疫荧光法进行EB鉴定。血清学诊断：嗜异性抗体检测可用于辅助诊断传染性单核细胞增多症。EB病毒临床意义主要通过唾液传播，也可因输血传染。EBV流行广泛，幼儿感染后多数无明显症状，但终生携带病毒，或引起轻度咽炎和上呼吸道感染。青春期发生原发感染，约50
23、%出现传染性单核细胞增多症。EBV主要侵犯B细胞，与EB病毒感染有关的疾病主要有：传染性单核细胞增多症、非洲儿童恶性淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金病和其他某些淋巴瘤。甲型肝炎病毒生物学性状形态结构：小RNA病毒科，无包膜，核心为单正股RNA。培养特性：一般不需要进行病原学检查。抵抗力：HAV的抵抗力较其他小RNA病毒强，60加热1012h后仍具有感染性，85加热立即灭活，对乙醚、氯仿及pH为3的酸性环境有抵抗力。甲型肝炎病毒微生物检验病毒分离与抗原检测：一般不需要进行病原学检查。血清学诊断：感染早期一般可用RIA或ELISA检测病人血清中抗-HAV IgM。对于了解既往感染史或进行流行病学调查，需检测
24、抗HAV-IgG。也可利用ELISA或EIA、RT-PCR、核酸杂交技术直接检测抗原。甲型肝炎病毒临床意义粪-口传播，传染源多为人，潜伏期1550d，平均28d。可造成散发式大流行。病毒常在患者血清谷丙转氨酶（ALT）升高前56d就存在于患者的血清和粪便中，23周后，随血清特异性抗体的产生，血清和粪便的传染性逐渐消失。引起甲型肝炎。典型的甲型肝炎常可分为黄疸前期、黄疸期及恢复期。乙型肝炎病毒生物学性状形态结构：双股环状DNA。大球形颗粒：具有感染性的HBV完整颗粒，呈球形，又称Dane颗粒；小球形颗粒：为HBsAg，不含病毒核酸DNA及DNA多聚酶，无传染性；管形颗粒：多个小球型颗粒“串联而成
25、”。抗原性：主要有HBsAg、HBcAg及HBeAg。HBsAg是HBV感染的主要标志。HBcAg免疫原性强，抗-HBcIgM提示HBV处于复制状态。HBeAg作为HBV复制及具有强感染性的一个指标。抵抗力：对理化因素有较强抵抗力。乙型肝炎病毒微生物检验病毒分离与抗原检测：一般不进行病原学分离鉴定。血清学诊断：主要靠RIA和ELISA等血清学方法检测HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBc、抗-HBe。其中HBsAg的检测最为重要，可发现无症状携带者，是献血员筛选的必检指标。近年来，PCR检测HBV DNA也用于乙肝的临床诊断。乙型肝炎病毒临床意义血液、血制品传播、性传播、母婴传播。致乙
26、型肝炎。肝炎的症状可以是轻度而短暂的，也可以是重度和迁延性的。病人可以完全恢复健康。也可因急性重型肝炎而致死或成为慢性肝炎。部分HBV持续感染者可发生原发性肝癌。丙型肝炎病毒生物学性状形态结构：小的有包膜的单正股RNA病毒，可感染黑猩猩并在体内连续传代，引起慢性肝炎。抵抗力：对理化因素抵抗力较弱，对酸、热均不稳定。沸水煮5min或60加热30min均可使感染性丧失。对氯仿、乙醚等有机溶剂敏感。丙型肝炎病毒微生物检验病毒分离与抗原检测：尚不能用体外细胞培养进行分离。血清学诊断：主要是以EIA测定抗-HCV。分子生物学方法：检测HCV RNA。HCV抗体检测主要是ELISA法作为筛选试验，采用条带
27、免疫法作确认试验。丙型肝炎病毒临床意义经输血或其他非肠道途径（如共用针头、血透析等）传播。可有HCV的亚临床感染，临床上无自觉症状，而ALT不正常，是丙型肝炎的主要传染源。HCV感染的一个主要特点就是慢性化的几率很高，感染过程很长，存在不同程度的肝组织病变，并呈慢性进行性。丙型肝炎根据临床病程可划分为急性和慢性（6个月为区分界限）。可发展为肝硬化，与原发性肝癌关系十分密切。丁型肝炎病毒生物学性状形态结构：球形，外被HBsAg包绕，核心含HDV抗原（HDAg）和HDV-RNA基因组，基因组为单负链环状RNA。HDV不能独立复制，需要HBV辅助才能增殖。培养特性：对HDV敏感的动物有黑猩猩、东方土
28、拨鼠等。丁型肝炎病毒微生物检验通过检测HDV感染的血清学标志物以及HDV RNA，结合HBV感染的检测，可作出HDV感染的实验室诊断。HDAg检测：RIA或ELISA。HDV RNA检测：核酸杂交或RT-PCR技术。抗-HDV抗体检测：ELISA等方法检测患者血清中抗-HDV IgM或抗-HDV IgG。HDV感染后两周左右产生抗-HD IgM，一个月达高峰，随后迅速下降；抗-HDIgG出现较迟，在恢复期出现。丁型肝炎病毒临床意义经血传播、密切接触、母婴垂直传播。HDV可引起与HBV相关联的急性和慢性肝病。HDV感染只有在感染了HBV的人群或是与HBV同时侵入才能发生。根据与HBV感染的关系，可将HDV感染分为两种类型：同步感染指与HBV同时或者先后感染；重叠感染指
