1、）（3）基因表达载体组成除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。（4）启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。（5）基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程则可对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。（6）微型繁殖技术既能保持优良品种的遗传特性，还可以高效快速地实现种苗的大量繁殖。（7）动物细胞培养中需用胃蛋白酶或胶原蛋白酶将组织细胞分散成单个细胞。（8）原代培养的细胞遗传物质没有改变，而传代培养的细胞有的已经发生突变，获得了不死性。（9）动物体细胞核移植技术获得的克隆动物在遗传性状上与供核母体完全一致。（10）动
2、物细胞融合技术和植物体细胞杂交技术类似，也可获得杂种动物。考向一基因工程Z1（2018全国卷）回答下列问题：（1）博耶（H.Boyer）和科恩（S.Cohen）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达_（答出两点即可）。（2）体外重组的质粒可通过Ca2参与的_转化_方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与_外壳蛋白（或答噬菌体蛋白）_组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体
3、宿主细胞的是_细菌_。（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用_蛋白酶缺陷型_的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加_蛋白酶_的抑制剂。解析（1）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。（2）重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白（或噬菌体蛋白）进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所
4、以宿主细胞选用细菌。（3）为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。2（2017全国卷）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题：（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A_。（2）若用家蚕作为表达基因A
5、的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_噬菌体_作为载体，其原因是_噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕_。（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_繁殖快、容易培养_（答出两点即可）等优点。（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是_蛋白A的抗体_（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体_。解析（1）人为真核生物，从人的基因组文库中
6、获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的RNA序列，无法表达出蛋白A。（2）噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此，选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。（3）大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。（4）常用抗原抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。（5）艾弗里等人的肺炎双
7、球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。3（2017全国卷）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_嫩叶组织细胞易破碎_。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_防止RNA降解_。（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDN
8、A_。（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子_（答出两点即可）。（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_磷酸二酯键_。（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_目的基因的转录或翻译异常_。解析（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是相对于老叶而言嫩叶组织细胞更容易被破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目
9、的是防止RNA降解。（2）以mRNA为材料获得cDNA的原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点且目的基因无表达所需启动子。（4）DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。（5）若获得的转基因植株不具备所期望的性状表现，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。4（2017全国卷）编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。（1）先要通过基因工程的方
10、法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCTCAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子_。（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为_模板_，加入了_dNTP_作为合成DNA的原料。（3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另
11、一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。由图2可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是_进行细胞传代培养_。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是_维持培养液的pH_。仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少_C_（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。解析（1）若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCTCAGGAAGGA），则转录出的mRNA上缺少起始密码子，故不能翻译出蛋白乙。（2）使
12、用PCR技术获取DNA片段时，应在PCR反应体系中添加引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、dNTP作为原料。（3）T淋巴细胞浓度之所以不再增加，是因为细胞间出现接触抑制，因此若要使T淋巴细胞继续增殖，需要对贴满瓶壁的细胞使用胰蛋白酶处理，然后分瓶培养，即细胞传代培养。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，以维持培养液的pH。据图分析，蛋白丙与对照接近说明B、D片段对于T淋巴细胞增殖不是非常重要，蛋白甲和乙对T淋巴细胞的增殖都有较大影响，甲、乙两种蛋白中共同的片段是C，所以缺少C片段会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。1理清基因工程3种操作工具的作用与特点项目限制酶DNA连接酶运载体作
13、用切割_目的基因和运载体_拼接DNA片段，形成_重组DNA分子_携带目的基因进入_受体细胞_作用部位两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键作用特点（条件）识别特定的核苷酸序列；在特定位点上切割DNA分子EcoliDNA连接酶只能连接黏性末端；_T4DNA_连接酶能连接黏性末端和平末端能在宿主细胞内稳定存在并大量_复制_；有一个至多个_限制酶切割位点_；具有特殊的_标记基因_2掌握获取目的基因的3种途径（1）直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从_基因文库_中获取。（2）人工合成目的基因（常用方法如下）化学合成法：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用_DNA合成仪_用化学方法合成，不需要模板
14、。人工合成法：以_RNA_为模板，在_逆转录酶_的作用下人工合成。（3）利用_PCR_技术扩增。3牢记基因表达载体的构建（1）基因表达载体的组成：目的基因启动子终止子_标记基因_复制原点。（2）启动子和终止子：启动子是_RNA聚合酶_识别和结合的部位，启动转录；终止子是_终止转录_的位点。（3）基因表达载体的构建过程4将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法_农杆菌转化_法、基因枪法、花粉管通道法等_显微注射_技术_感受态细胞_法（Ca2处理法）受体细胞体细胞受精卵原核细胞5理清目的基因的检测与鉴定（1）导入检测：_DNA分子_杂交技术（使用DNA探针）（2）表达检测（
15、3）个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等的接种实验。T题型1基因工程的操作工具和流程1（2016全国卷）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tett中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tett表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_能自我复制
16、、具有标记基因_（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长_；并且_含有质粒载体_和_含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）_的细胞也是不能区分的，其原因是_二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_四环素_的固体培养基。（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为运
17、载体，其DNA复制所需的原料来自于_受体细胞_。解析（1）作为运载体的质粒上应有一个至多个限制酶切割位点，在细胞中能够自我复制，并含有特殊的标记基因。（2）未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌中均未导入质粒载体，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此这样的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，二者在含有氨苄青霉素的培养基中都能生长，因此无法区分二者。由题图可知，用BamHI切割质粒后将四环素抗性基因破坏，因此可将经氨苄青霉素培养基筛选出的菌落置于含有四环素的培养基上再次筛选，能在含四环素培养基上生存的
18、是含有质粒载体的大肠杆菌，不能生存的是含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。（3）噬菌体为病毒，经改造后作为载体时，其DNA复制所需原料来自受体细胞。2（2018河北省衡水中学一模）转基因抗病香蕉的培育过程如图1所示，图2表示Pst、Sma、EcoR和Apa四种限制酶的识别序列及酶切位点。请据图回答下列问题：（1）质粒的化学本质是_DNA_。（2）利用基因工程培育转基因抗病香蕉的核心步骤是形成重组质粒，即_基因表达载体的构建_；将目的基因导入受体细胞的方式是_农杆菌转化法_。（3）将抗病基因从含抗病基因的DNA中切割下来，使用的限制酶是_Pst和EcoR_，一个质粒被限制酶Pst、Sma、Ec
19、oR同时切割后得到的DNA片段和黏性末端分别为_3、3_个。单独用Apa切割质粒后的片段是_和_。（4）转基因抗病香蕉的培育发生了_基因重组_（变异类型）。卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，根据这一原理可利用含卡那霉素的培养基筛选已导入重组质粒的香蕉细胞。由此推断，重组质粒中应含有_卡那霉素抗性_基因作为标记基因。解析（1）质粒是一种小型的环状DNA分子。（2）基因工程的操作分四个步骤，其中构建目的基因的表达载体是核心步骤。图中将B的基因导入受体细胞的方法是农杆菌转化法。（3）从图1中的目的基因的三种限制酶的切割位点可以看出，不能使用Sma，否则会破坏目的基因的结构，只有利用另外两种限制酶
20、才能将目的基因切割下来。用三种限制酶切割环状DNA，能得到3个DNA片段和3个黏性末端。根据图2中的Apa识别的碱基序列及切割位点可知，该酶切割质粒后得到的黏性末端是。（4）基因工程的原理是基因重组，利用含卡那霉素的培养基能筛选出抗卡那霉素的细胞，由此可以推断重组质粒中的标记基因是卡那霉素抗性基因。易错警示有关基因工程概念及其工具的8个错混点（1）限制酶是一类酶，而不是一种酶。（2）限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。（3）在切割目的基因和运载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。（4）将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处
21、，同时产生4个黏性末端。（5）不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。（6）限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。（7）基因工程中的运载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的运载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。（8）基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。题型2基因工程在生产科技中的应用3（2018河北衡水中学一模）科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。下图是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的DNA和质粒上
22、的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析回答下列问题。（1）在该过程中，研究人员首先获取了抗盐基因（目的基因），并采用_PCR（聚合酶链式反应）_技术对目的基因进行扩增，该技术需要的条件是_引物_、酶、原料、模板，该技术必须用_耐高温的DNA聚合或热稳定DNA聚合_酶；然后构建基因表达载体，基因表达载体中除了具有目的基因、启动子和终止子之外，还需具有_标记基因_。（2）用图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用Sma酶切割，原因是_Sma会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因_。图中过程为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，应选用_BamH和Hind_酶对外源DNA、质粒进行切
23、割。（3）为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的_抗盐基因（或目的基因）_作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者具体过程是_将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态_。4（2018东北三省三校高考生物一模）马铃薯是重要的经济作物，在基因育种方面取得丰硕成果。（1）马铃薯是双子叶植物，常用_农杆菌转化_方法将目的基因导入马铃薯体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构有：目的基因、_启动子_、_终止子_、_标记基因_、复制原点五部分。（2）马铃薯易患多种疾病，导致产量下降。基因工程中常用的抗病基因为_病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、抗毒素合
24、成基因、几丁质酶基因_（写一种即可）。（3）科学家还培育出抗除草剂的转基因马铃薯，主要从两个方面进行设计：修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂_不敏感（抵抗）_，或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能正常代谢。引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前_被降解（分解）不敏感（抵抗）_。（4）将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行_检测和鉴定_。解析（1）马铃薯是双子叶植物，常用农杆菌转化法将目的基因导入双子叶植物体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构有目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点五部分。（2）基因工程中常用的抗病基因为病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、抗毒素合成基因、几丁质酶
25、基因。（3）除草剂只能作用于杂草，不能作用于马铃薯，因此需要修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感（抵抗），或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能正常代谢。也可以引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前被降解（分解）。（4）将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行检测和鉴定。有关基因工程操作过程的4个错混点（1）基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。（2）目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。（3）标记基因的作用筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性
26、基因、发光基因（表达产物为带颜色的物质）等。（4）受体细胞常用植物受精卵或体细胞（经组织培养培养成新个体）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物（大肠杆菌、酵母菌）等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌（需内质网、高尔基体的加工、分泌）；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。考向二细胞工程全国卷）2018年细胞期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴“中中”和“华华”。（1）“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指_将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母
27、细胞中_。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目_不变_（填“减半”“加倍”或“不变”）。（2）哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度_小于_（填“大于”或“小于”）体细胞核移植，其原因是_胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易_。（3）在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常，所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目_相同_（填“相同”或“不同”），性染色体组合_不同_（填“相同”或“不同”）。解析（1）核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中，形成重组细胞。
28、重组细胞形成的早期胚胎可移植到受体子宫内进一步发育，最终分娩得到克隆动物。因为染色体在细胞核中，所以克隆动物体细胞的染色体数目与提供细胞核的个体的体细胞相同。（2）由于动物的胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而动物的体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难，因此，动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。（3）哺乳动物雌雄个体的体细胞中，细胞核内常染色体的数目是相同的，性染色体组合是不同的。若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，则得到的克隆动物的体细胞中常染色体的数目相同，性染色体组合不同。2（2014全国卷）某研究者用抗原（A）分别免疫3只同种小鼠（X、Y和Z），每只小鼠免疫5
29、次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价（能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数），结果如下图所示。若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞（染色体数目40条），并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞（染色体数目60条）按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。（1）制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16000以上，则小鼠最少需要经过_4_次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是_Y_小鼠，理由是_Y小鼠的血清抗体效价最高_。（2）细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融
