1、消毒剂消毒效果及有效期确认方案制药有限公司GMP文件 文件编码：ZLYF00505Cleaning and Sanitizing Compounds the Effect of the Programme Validation Protocol消毒剂消毒效力及有效期确认验证方案起 草： 日期： 审 核： 批 准： 日期： 实施日期： 颁发部门：质量部分发部门：质量部、工程部验证小组名单组长姓 名职务/职称部 门成员姓 名职务/职称部 门文件编码：RVP-CV-006a-00立项申请审批表立项题目消毒剂消毒效果及有效期确认立项编号VP-CV-006a-00立项部门生产部申请日期 年 月 日确认对
2、象消毒剂确认内容1、先决条件确认 2、人员资质确认 3、文件确认4、检测仪器仪表确认 5、菌种确认6、培养基和稀释液的配制确认 7、中和剂鉴定试验9、75%乙醇溶液、0.2%新洁尔灭溶液消毒效力的确认10、消毒效力现场考察试验11、消毒剂储存有效期确认12 0.2%新洁尔灭溶液和75%乙醇溶液消毒效力周期的确认审核意见 签 名：年 月 日方案编制及实施要求方案编制要求：消毒剂消毒效果及有效期确认方案由生产部 起草。实施要求：消毒剂消毒效果及有效期确认方案实施的时间为2012年 月确认总负责人批准 签 名: 年 月 日方案审核和批准文件名称：消毒剂消毒效果及有效期确认文件编码：VP-CV-006
3、a-00编写人 日 期： 年 月 日审核人姓名职务签名日期批 准 人： 日 期： 年 月 日执行日期： 年 月 日 年 月 日验证小组人员名单：小组职务姓 名所在部门职 务组 长生产部成 员生产部成 员生产部成 员生产部成 员生产部成 员生产部成 员生产部成 员质量部成 员质量部成 员质量部成 员质量部成 员质量部成 员质量部成 员质量部成 员质量部成 员工程部Tablet of Content 1 目的 通过消毒剂消毒效果及有效期的确认，科学制订消毒程序，以保证各洁净级别的操作间及设备外表面按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒防止污染的效果，2 适用范围 本方案适用于洁净区的墙面、天花板、门窗
4、、机器设备、仪器、操作台、地漏、推车、记录台、凳子等表面以及操作人员双手（手套）的消毒等。 3 职责3.1 消毒剂消毒效果及有效期确认小组组长职责3.1.1 负责组织编写消毒剂消毒效果及有效期确认方案，组织消毒剂消毒效果及有效期确认方案的培训和实施。3.1.2 负责消毒剂消毒效果及有效期确认方案实施过程的监控。3.1.3 负责组织收集各项确认数据，并对实验结果进行分析，制订消毒操作程序。3.2 生产部3.2.1 负责消毒剂的配制，及消毒剂消毒效果及有效期确认各项试验的实施。3.2.2 负责消毒剂配制相关记录的填写，及消毒剂消毒效果及有效期确认各项试验实施过程关键项目参数的记录。3.2.3 负责
5、配合质量部进行消毒剂消毒效果及有效期确认各项试验的实施。3.3 质量部3.3.1 负责消毒剂消毒效果及有效期确认方案的审核、实施、实施过程的监控、归档；确认报告的发放、文件资料的保存。3.3.2 负责消毒剂消毒效果及有效期确认各项试验实施过程中的取样送检，检验结果的跟踪。3.3.3 负责消毒剂消毒效果及有效期确认各项试验实施过程中样品的检验，并出检验报告。3.3.4 负责组织对确认过程中的偏差进行调查、处理、评估。3.4 工程部3.4.1 负责保证提供消毒剂消毒效果及有效期确认各项试验的条件。4 描述4.1 本公司的洁净区分为十万级、万级和百级，拟定用于洁净区表面消毒的有2种消毒剂：75%乙醇
6、、0.2%新洁尔灭溶液。本次验证方案将选用以上2种消毒剂分别进行验证试验。实验分为两部分：一是实验室考察部分；二是现场考察部分。4.2 消毒剂的种类、消毒对象、消毒方法和有效期如下表： 消毒剂的种类、消毒对象、消毒方法和有效期序号名称消毒对象消毒方法有效期175%乙醇用于地面、墙面、器具、工作服、清洁布、拖布、洁净鞋水池、地漏和手的消毒。采用擦拭、喷洒、浸泡和液封方式密闭保存试验6天20.2%新洁尔灭溶液用于地面、墙面、器具、工作服、清洁布、拖布、洁净鞋水池、地漏和手的消毒。采用擦拭、喷洒、浸泡和液封方式密闭保存试验6天4.3 作用对象一样的消毒剂每月轮换使用，避免表面微生物产生耐药菌株。在利
7、用消毒剂进行表面擦拭消毒过程中消毒剂的作用时间应不少于10分钟，利用消毒剂进行浸泡消毒的不少于10分钟。4.4 实验室考察部分，定量悬浮试验法适用于浸泡或液封方式的消毒方法；表面实验法适用于擦拭或喷洒方式的消毒方法。洁净区设施表面材质有不锈钢、镀锌板及玻璃三种，故表面试验法选用不锈钢载片、镀锌板及玻璃裁片模拟洁净区设施表面进行验证试验。 两种试验方法作用的消毒剂序号试验方法消毒剂1表面实验法75%乙醇20.1%新洁尔灭溶液3定量悬浮试验法75%乙醇40.1%新洁尔灭溶液4.5 现场考察试验部分选择10万级洁净区、万级的微生物限度室、超净工作台设备表面消毒前和消毒后分别进行取样，测定其微生物数量
8、。5 确认程序5.1菌种序号名称序列号1金黄色葡萄球菌CMCC(B)260032大肠埃希菌CMCC(B)441023白色念珠菌CMCC(F) 98001 5.2 培养基序号名称备注1营养琼脂培养基培养基经121，20min灭菌备用2营养肉汤培养基3改良马丁琼脂培养基4改良马丁液体培养基5大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟（编号：BZW12085）规格： 55mm，取样面积为25m26玫瑰红钠琼脂培养接触碟（编号：BZW15129）5.3 消毒液拟定选用的中和剂序号消毒剂名称中和剂备注175%乙醇1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和剂经121，20min灭菌备用。20.1%新洁尔灭溶液5.4 器具及设
9、备序号名称1无菌移液管2锥形瓶3无菌试管4漩涡混合器5恒温水浴锅6恒温恒湿培养箱7恒温恒湿培养箱 5.5稀释液 0.9%无菌氯化钠溶液、PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液6 中和剂鉴定试验6.1 试验目的通过该试验，确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用，对试验用菌剂及其恢复期培养示范有害或不良影响。6.2 菌液的制备及计数6.2.1 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌工作菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，3035培养1824小时。取上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成11085108CFU/ml的工作菌液（如肉汤培养物的浓度已为1108510
10、8CFU/ml，可不再用0.9无菌氯化钠溶液稀释）。计数时，将11085108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀释成含50100CFU/ml菌液，并同时采用营养琼脂培养基3035培养2天计数。计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数。6.2.2 白色念珠菌工作菌液的制备 接种白色念珠菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，2328培养2448小时。取上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成11085108CFU/ml的工作菌液（如肉汤培养物的浓度已为11085108CFU/ml，可不再用0.9无菌氯化钠溶液稀释）。计数时，将11085108CFU/ml的工作菌液10倍
11、系列稀释成含50100CFU/ml菌液，并同时采用改良马丁琼脂培养基2328培养3天计数。计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数。6.3 鉴定试验操作6.3.1 配制75%乙醇、0.2%新洁尔灭溶液，具体操作执行清洁剂和消毒剂管理。将配置好的消毒剂置201恒温水浴锅中备用。6.3.2 分组操作试验分组及稀释操作方法简表组号混合液A混匀作用10min混合液B混匀作用10min取混合液B或混合液B的稀释级溶液0.5ml平板计数（2皿/组）取0.5ml工作菌液加入下列溶液中取混合液A 0.5ml加入下列溶液1消毒剂4.5ml稀释液4.5ml混合液B、10-12消毒剂4.5ml
12、中和剂4.5ml混合液B、10-13中和剂4.5ml稀释液4.5ml10-2、10-34中和产物4.5ml（消毒液与中和剂比例为1:1）稀释液4.5ml10-2、0-35稀释液4.5ml稀释液4.5ml10-2、10-36稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿。具体操作第1组目的：观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。操作：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min，取0.5ml注皿，平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼
13、脂培养基，倒置2328培养5天计数计数。第2组目的：观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。操作：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液0.5ml +中和剂4.5ml，混匀作用10min，用稀释液稀释成10-1。分别取未稀释溶液（混合液0.5mll+中和剂4.5ml的混合液）及10-1 0.5ml注皿，各平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置于2328培养5天计数。第3组目的：观察中和剂是否有抑菌性操作：取中和剂4.5ml+工作菌液0.5ml，
14、混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置3035培养3天计数计数。第4组目的：观察中和产物，或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。操作：取消毒剂和中和剂1:1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、
15、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置3035培养3天计。第5组目的：作菌落数对照用操作：取稀释液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置3035培养3天计数。
16、第6组目的：作为阴性对照用操作：分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿。结果判断试验结果应符合下列全部条件，判断所选中和剂合格。第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少，且符合下表要求第1组平板平均菌落数第2组平板平均菌落数05x(x+5)y(y+0.5y)第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过15%。计算公式如下：（3组间菌落平均数-各组菌落平均数）的绝对值之和误差率10033组间菌落平均数第6组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。7定量悬浮试验 0.2%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液
17、消毒效力的确认（定量悬浮试验法）目的：由于0.2%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液要通过浸泡或液封消毒，采用将消毒剂置于无菌具塞试管中通过定量悬浮试验法，确定其消毒效力是否符合要求。程序：（1）菌种的选择 由于0.2%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液中低效消毒剂，且不能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌； （2）菌液制备：取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌接种于营养肉汤培养基中，于3035培养1824h即得，培养后微生物浓度应不少于106cfu/ml。取白色念珠菌接种于改良马丁液体培养基中，于2328培养2448h即得，培养后微生物浓度应不少于106cfu/ml。（3）消毒
18、剂的配制：按照清洁剂、消毒剂配制使用程序进行配制0.2%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液，现配现用。（4）试验方法：（a）在室温条件下将配制好的0.2%新洁尔灭溶液（或75%乙醇溶液）按9ml/支分注于27支无菌具塞试管中，按照“5分钟组”、“10分钟组”和“15分钟组”共3组每组9支，进行分组编号。（b）取供试菌液（106cfu /ml的金黄色葡萄球菌菌液，106cfu /ml的大肠埃希菌菌液，106cfu /ml的白色念珠菌菌液）1ml按照下表，分别接入到盛有9ml0.2%新洁尔灭溶液（或75%乙醇溶液）的试管中（已进行10倍稀释），轻轻摇动，混合均匀，并立即开始计时。5分钟组10分钟组15分
19、钟组金黄色葡萄球菌1ml/支，共3支1ml/支，共3支1ml/支，共3支大肠埃希菌1ml/支，共3支1ml/支，共3支1ml/支，共3支白色念珠菌1ml/支，共3支1ml/支，共3支1ml/支，共3支（c） 消毒剂的稀释分别在5分钟、10分钟和15分钟时迅速吸取1ml菌药混合液，加入到9ml（1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80）中和剂中，迅速混匀中和10分钟，分别取上述经中和的“5分钟组”、“10分钟组”和“15分钟组”的接种细菌的消毒液，倾入过滤杯滤过，然后各用0.9%无菌生理盐水50ml清洗滤膜，滤过，重复用50ml0.9%无菌生理盐水的洗涤共3次。取下滤膜，含细菌的膜放入营养琼脂平板内，
20、含真菌的膜放入玫瑰红钠琼脂平板内，含菌膜面向上。细菌于30-35的生化培养箱内培养3d，真菌于23-28的霉菌培养箱内培养5d。培养后在明亮处，对平板上的菌落数进行计数，记录计数结果。d 阳性对照分别将106cfu/ml金黄色葡萄球菌菌液、106cfu/ml大肠埃希菌菌液、106cfu/ml的白色念珠菌菌液用无菌注射用水进行梯度稀释至浓度为10100cfu/ml，取稀释液体1ml于平皿中，倾注冷却至45营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基混匀，待凝固后于细菌于30-35的生化培养箱内培养3d，真菌于23-28的霉菌培养箱内培养5d。培养结束后对平板上的菌落数进行计数，记录计数结果。0.2%新洁尔
21、灭溶液消毒效力的确认与消毒剂作用时间菌种名称试验组菌落数（cfu/ml）10-1平均菌落数（cfu/ml）杀菌率1235分钟金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌10分钟金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌15分钟金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌阳性对照 稀释级菌种名称10-310-410-5平均菌落数（cfu/ml）金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌确认结果评价：操作人： 日期： 年 月 日 复核人： 日期： 年 月 日 75%乙醇溶液消毒效力的确认与消毒剂作用时间菌种名称试验组菌落数（cfu/ml）10-1平均菌落数（cfu/ml）杀菌率1235分钟金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌10分钟金
22、黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌15分钟金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌阳性对照 稀释级菌种名称10-310-410-5平均菌落数（cfu/ml）金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌确认结果评价：操作人： 日期： 年 月 日 复核人： 日期： 年 月 日8 表面试验 75%乙醇溶液、0.2%新洁尔灭溶液消毒效力的确认（表面试验法）目的:由于75%乙醇溶液、0.2%新洁尔灭溶液要通过擦拭消毒，故选用不锈钢载片、镀锌片及玻璃裁片进行表面试验法，确定其消毒效力是否符合要求。程序：（1）菌种选择：由于75%乙醇、0.2%新洁尔灭溶液中低效消毒剂，且不能杀灭芽孢，故表面试验用菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希
23、菌和白色念珠菌。（2）工作菌液制备 取金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌分别接种于营养肉汤培养基中，于3035培养1824h即得，培养后微生物浓度应不少于106cfu/ml。取白色念珠菌接种于改良马丁液体培养基中，于2328培养2448h即得，培养后微生物浓度应不少于106cfu/ml。（3）染菌不锈钢载片制备：将经灭菌的不锈钢载片平铺于无菌平皿内，滴加金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌含菌量为11085108CFU/ml的菌液0.1ml，并均匀涂布于整个载体表面。滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用。每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片；染菌镀锌载片制备：将经灭菌的镀锌载片平铺于无菌平皿内，滴加金
24、黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌含菌量为11085108CFU/ml的菌液0.1ml，并均匀涂布于整个载体表面。滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用。每种菌平行制备两个染菌镀锌载片；染菌玻璃载片制备：因培养皿的材质为玻璃，故用培养皿代替玻璃载片进行染菌试验。进行菌液滴染前，用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌面积（50mm50mm），标注清晰。菌液滴染操作同染菌不锈钢载片制备。（4）取样 试验组：将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上，消毒剂作用时间分别为5min、10min、15min，不锈钢载片、镀锌载片及玻璃载片每个作用时间分别制备2个。作用结束后，用接触碟取样（接触碟规格： 55m
25、m，取样面积为25m2）。取金黄色葡萄球菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟（编号：BZW12085）；取大肠埃希菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟（编号：BZW12085）； 取样白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基接触碟（编号：BZW15129）。接触碟取样方法：打开接触碟盖，使无菌培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面与取样面表面均匀接触10秒左右，盖上碟盖。对照组：对照组的活菌浓度同工作菌液的制备。阴性对照：用接触碟在已灭菌的载片上（未染菌片的载片）按压取样，操作同上。每种载片及每种接触碟平行制备两份。（5）培养：将取样金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的接触碟倒置于3035培养3天
26、计数；取样白色念珠菌的接触碟倒置于2328培养5天计数计数。（6）结果计算：计算试验组和对照组的活菌浓度（CFU/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值: 杀灭对数值(KL)对照组平均活菌浓度的对数值（NO）试验组活菌浓度对数值（NX）可接受标准：杀灭对数值(KL)应不低于3个对数单位。75%乙醇溶液、0.2%新洁尔灭溶液消毒效力的确认序号消毒剂名称工作菌液杀灭对数平均值（KL）不锈钢载片（min）玻璃载片（min）镀锌载片（min）510155101551015175%乙醇金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌20.2%新洁尔灭溶液金黄色葡萄球菌大肠埃希菌白色念珠菌可接受标准 阴性
27、对照无菌生长； 杀灭对数值(KL)应不低于3个对数单位确认结果评价：操作人： 日期： 年 月 日 复核人： 日期： 年 月 日9 消毒效力现场考察试验目的：确认消毒剂对相应设施的实际消毒效力。操作：（1）生产车间岗位操作人员按照洁净区卫生清洁程序、地漏的清洁消毒程序、10万级洁净区洁具清洁消毒程序、万级洁净区洁具清洁消毒程序、地漏清洁程序进行清洁。（2）生产车间岗位操作人员，使用放冷的注射用水，按照清洁剂、消毒剂配制使用程序进行75乙醇溶液、0.2%的新洁尔灭溶液配制，现配现用。按照洁净区卫生清洁程序进行清洁消毒，分别清洁消毒10万级洁净区各房间的顶棚、墙面、工作台面和墙面、地漏、水池下水；10万级洁净区的工作鞋、清洁布、拖布；万级区微生物限度室等房间顶棚、墙面、工作台面和墙面、地漏、水池下水，万级洁净区的工作鞋
