1、分子生物学技术精第六章 分子生物学技术是以核酸、蛋白质等大分子为研究材料，研究其结构与功能，以空前的广度和深度揭示生命现象以及疾病的本质。在临床医学检验中，特别对遗传病和癌基因的检测已成为不可缺少的手段。第一节 核酸的分离纯化技术一、DNA的分离与纯化根据DNA的结构及在细胞中分布的不同，分离提取的方法不同。（一）大分子量DNA的分离与纯化制备DNA的样品包括：生物组织、培养细胞、血样。在基因诊断中一般采用外周血白细胞。制备DNA时，既需要去除蛋白质、脂类和糖类物质，又需要保证DNA的完整性。目前应用较广的方法有氯仿法；去污剂法；酚抽提法。基本过程包括：1. 细胞的破碎；（SDS，溶菌酶）2.
2、 去除蛋白质；（氯仿，苯酚和蛋白酶K）3. 防止DNA降解；（核酸酶抑制剂，EDTA）4. 沉淀DNA；（乙醇；异丙醇）5. 消化RNA；（RNA酶）6. 纯度测定；可采用紫外分光光度计测定提取物230nm，260nm，280nm的吸光度。A260 /A2801.8，A260 /A2302.0，表示提取物DNA的纯度好，A260 /A280比值太小，残留蛋白质太多，A260 /A230比值小，残留酚类有机杂质。（二）质粒DNA的提取与纯化质粒是游离于细菌染色体之外，具有自行复制子的双链环状小分子DNA。在基因工程中常作为目的基因的载体。质粒的提取方法很多，如碱裂解法，煮沸法，SDS法等，其碱裂
3、解法是质粒的大量提取的常用方法。基本原理：在pH12.012.6环境中，线状染色体DNA变性，而环状质粒DNA保持自然状态，调节pH至中性，增加盐浓度，使染色体DNA交联，形成不溶性网状结构，在SDS作用下，染色体DNA、蛋白质沉淀，离心，上清液中保留质粒DNA，抽提（酚，氯仿），乙醇沉淀。二、RNA的分离纯化RNA包括：rRNA、tRNA、mRNA。其中mRNA占总RNA1%5%，含量少，但种类繁多，是分子生物学的主要研究对象之一。（一）总RNA的提取主要方法有异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，快速提取法等。其中盐酸胍-有机溶剂法提取的RNA质量较好。盐酸胍破碎组织细胞，并抑
4、制RNA酶活性，氯仿去除蛋白质，乙醚沉淀RNA。（二）mRNA的分离与纯化利用真核细胞中mRNA 5末端含有多聚腺苷酸序列，采用Oligo（dT）纤维素柱或Poly U琼脂糖柱的亲和层析。第二节 DNA分析技术DNA分析技术主要包括核酸纯化，基因分子克隆以及杂交分析。在医学研究领域多用于临床遗传疾病的基因诊断。一、基因的分子克隆基因是DNA分子中的一个片段，这一片段含有合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列。（不仅是结构基因核苷酸序列，还有调控基因序列，内含子，5，3端非翻译序列）。基因的分子克隆：从众多不同基因群体中分离出某一感兴趣的基因分子，通过无性繁殖（扩增），产生很多相
5、同基因分子的集合。（一）目的基因的制备从染色体DNA中分离，通过mRNA合成cDNA和化学合成等方法制备。1. 基因组DNA 将染色体DNA用限制性核酸内切酶切割成基因水平的许多片段，其中含有我们感兴趣的基因片段（目的基因），并与合适的载体进行体外重组，得到一系列重组DNA。这种由载体携带的所有基因组DNA的集合称为基因组文库（genomic DNA librarg）。基因组DNA文库就象图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息。限制性核酸内切酶（简称为限制酶），能识别DNA的特异序列，并在识别位点或周围切割双链DNA的一类内切酶。限制酶存在于细菌体内，目前发现的有1800多种，可分为三
6、类，在重组DNA技术中常用的是类酶。它们识别的核苷酸序列都呈二重对称结构（回文结构），切割可产生3种不同末端的DNA产物。5AGCT3 Alu 5AG3 5CT33TCGA5 3TC5 3GA5 平末端5GAATTC3 EcoR 5C3 5AATTC33CTTAAG5 3CTTAA5 3G5 5粘末端5GGTACC3 Kpa 5GGTAC3 5C33CCATGG5 3C5 3CATGG5 3粘末端2. cDNA 以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA（complementary DNA，cDNA），再复制成双链cDNA片段，与载体进行体外重组，建立cDNA文库，与基因组DNA
7、文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库，包含了细胞全部mRNA信息。3. 化学合成 如果已知某种基因的核苷酸序列或根据某种基因产物的氨基酸序列，推导出该多肽链编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学原理合成目的基因。（二）基因扩增 主要方法有两种1. 通过宿主细胞增殖而扩增（1）载体 外源目的基因离开染色体是不能复制的，如果将目的基因连接到复制子上，目的基因则可作为复制子的一部分在受体细胞中复制，这种复制子就是基因载体。目前已发展的基因载体有质粒、噬菌体、病毒DNA、人工染色体载体等。质粒（plasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。它具有独立复制能力，并可在细胞
8、分裂中与染色体一道分配到子细胞中，作为基因载体的质粒一般应具备以下特性：1 具有能自主复制的复制子；2 具有可供筛选的选择标记；营养缺陷型标记，抗菌素标记。3 拥有多种限制酶的单一切点；以便外源基因的插入。4 分子量小，且对外源基因有一定的容量；5 松弛型复制，多拷贝。70年代初用的是天然质粒，如今采用的质粒均由天然质粒经人工改建而成。如pBR322，PUC18，PUC19，PGEM系列。噬菌体：为线状双链DNA病毒，寄主是大肠杆菌，与质粒相比，具有以下优点：1 对外源基因容量比较大，可插入几kb到20kb的片段；2 重组DNA可在体外被包裹成噬菌体颗粒，具有更高的感染宿主细胞的能力。3 对寄
9、主的选择面较质粒窄，因此，在基因工程操作的安全性上较质粒有保证。 置换载体（取代载体） 一对限制酶切点噬菌体载体 插入载体 单一酶切点（2）体外制备DNA重组体：目的基因与载体在体外连接方式有多种。如定向克隆、粘性末端连接、平端连接、人工接头连接等。定向克隆：利用两种不同的限制酶切割目的基因和载体，使载体的两端分别与目的基因的相应末端互补，当摸的基因插入载体时，只有一个方向可供选择。（3）重组DNA导入宿主细胞 宿主细胞有原核细胞和真核细胞两类。原核细胞 大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌等。宿主细胞 大肠杆菌K-12衍生的安全宿主菌是常用的宿主细胞。真核细胞 酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞导入的方式有
10、转化和转染，以质粒为载体构建的重组DNA导入宿主细胞的过程称为转化。以噬菌体、病毒为载体构建的重组DNA导入宿主细胞的过程成为转染。方法有CaCl2法、电穿孔转化法、体外包装转染法等。2. PCR体外基因扩增 DNA合成体系（模板DNA，与模板5端互补的引物，Dntp、TaqDNA聚合酶），经反复变性、退火、以及扩增循环，自动地往复多次地进行感兴趣DNA片段的酶促合成，使反应产物按指数倍增。 模板DNA 1min 95变性 引物 55退火 1min循 环 72延伸 1minPCR体外基因扩增示意图二、基因探针标记带有标记物的一段已知序列的DNA和RNA称为基因探针。广泛用于基因克隆筛选、酶切图
11、谱制作，基因点突变等DNA序列分析。（一）基因探针种类 根据来源与性质可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、人工合成的寡核苷酸探针。（二）基因探针的标记方法1. 标记物 应具备以下特性1 高度灵敏性；2 标记物与探针分子结合，绝对不影响其碱基配对的特异性；3 不影响探针分子的主要理化特性；如杂交特异性、杂交稳定性。4 应用酶促方法进行标记时，对酶活性（Km值）无较大影响；5 有较高的化学稳定性，保存时间长。放射性核素类 常用的有32P、3H、35S，灵敏度极高，不影响碱基标记物 配对的特异性、稳定性、杂交性质；放射污染，保存时间短。非放射性核素类 常用的有地高辛、生物素。是半抗原，
12、利用它们的抗体通过免疫反应检测，无放射污染，稳定性好，保存时间长，但灵敏度、特异性不如放射性核素。2. DNA探针标记法 常用的标记法有末端标记法、切口平移法、随机引物法等。末端标记法的特点是DNA片段并非均匀标记，只将其中的一端（5端或3端）进行部分标记，标记活性不高。主要的工具酶是Klenow DNA聚合酶。Klenow DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶的片段，也称为Klenow片段，具有DNA聚合酶活性及35外切酶活性，但无53外切酶活性。完整DNA双链 5 3 3 5限制性内切酶 5 3 3 5 5末端突出的DNAKlenow DNA聚合酶4种dNTP，其中一种标记 5 3 3 5变
13、性 末端标记的单链DNA探针标记的DNA图：利用Klenow DNA聚合酶进行3末端填充标记三、分子杂交待测核酸序列与探针按碱基互补原则形成稳定的双链，杂交的方法有膜上印迹杂交、原位杂交和斑点杂交等。（一）Southern印迹杂交 是一种膜上检测DNA的杂交技术，由Southern 1975年建立，基本过程是：1. 消化降解；样品DNA经限制酶切割成大小不同的片段。2. 凝胶电泳；将各片段分离。3. 碱变性；用碱液使DNA变性成为单链。4. 转移；将凝胶中的DNA转移至NC膜上。5. 固定；室温晾干，80真空干燥，使DNA固定在膜上。6. 预杂交；将非特异吸附点封闭，以降低本底。7. 杂交；双
14、链DNA探针加热变性，解离成单链，置杂交液中，42，24h以上使充分杂交，洗涤。8. 放射自显影；晾干后的膜与感光胶片叠放，用增感屏压紧于暗盒中，置70曝光1天1周，洗片。（二）原位杂交和斑点杂交1.原位杂交 将标记探针与细胞中的核酸进行杂交，并对其进行检测的方法称为原位杂交。即被测核酸不改变在细胞中的原始位置，根据所用探针和靶细胞的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交，RNA-RNA杂交三类，用于确定组织细胞中有无相关病原体的感染，具有准确、快速、灵敏等优点。2.斑点杂交 将待测核酸样品（经变性、中和后的单链DNA或RNA）用点状加样方法滴在NC膜上，晾干，烘烤固定，进
15、发预杂交，杂交，显影等过程。四、DNA芯片技术DNA芯片技术是近年来综合运用分子生物学、微电子学、微加工和计算机等多学科交叉融合而成的高新技术。在每平方厘米的芯片上可密集排列成千上万个生物分子，能快速、准确地检测核酸，获取样品中的有关信息。 DNA芯片技术在基因测序、基因表达、基因突变及多态性检测、基因诊断和基因药物设计等方面有着广泛的应用。（一）DNA芯片技术的概念 基因芯片指对大量DNA片段同时进行处理、分析的技术，由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，故称为DNA芯片。 基因芯片技术指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子
16、的数量和序列信息。（二）DNA芯片的主要类型 从点阵的制备方法来分主要有两类：原位合成芯片与DNA微集阵列。 1. 原位合成型 采用光介导和电打印等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片。 2. DNA微集阵列 将预先制备的DNA片段用显微打印的方式有序地固定于支持物表面而制成的芯片称为DNA微集阵列，也称DNA微集芯片。DNA芯片技术工作流程主要包括：芯片的制备、样品的准备与标记、杂交、信号检测和数据分析处理。（三）DNA芯片技术的基本方法1. 芯片的制备 （1）支持物的预处理 目前用于DNA芯片制作的固相支持物有两类： 实性材料 硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料 聚
17、丙烯膜、尼龙膜、NC膜。（2）光介导原位合成法 首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，选取适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其它部位不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护，进而与单体分子共价结合。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光），以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。优点： 合成速度快，点阵密度高。缺点： 设备昂贵，技术复杂，合成长度一般小于30bp（3）压电打印合成法 基
18、本原理与普通彩色打印机相似，在墨盒中装入4种单核苷酸，在计算机控制下，通过喷嘴有序开放和关闭将单核苷酸喷射到预设的经包被的支持物表面。然后去保护、偶联、冲洗等步骤，进行寡聚核苷酸的延伸。2. 样品的准备 样品的准备包括样品的分离纯化，扩增和标记等过程。 扩增：采用固相PCR系统，在靶DNA上设计一对双向引物，并固化在丙烯酰胺薄膜上，加入模板DNA及PCR试剂，在固相表面进行PCR反应。标记：主要采用荧光标记法，也可用生物素、放射性核素等标记。样品的标记在PCR、RT-PCR过程中进行。3. 分子杂交待测样品经扩增和标记等处理后，即可与DNA芯片上的探针阵列进行分子杂交。DNA芯片上集成了大量的
19、探针，使检测过程平行化，一次可对大量的样品信息检测分析。由于集成的显微化，使得杂交所需的探针和样品用量大大减少，杂交时间缩短，一般可在30min内完成。（四）DNA芯片技术的应用DNA芯片技术现已广泛应用于生物科学的众多领域中。基本应用可分为两个主要方面：对大量的生物样品进行快速、高效、敏感的定量分析，如测序和突变检查。定性分析，如基因表达研究（基因功能分析、疾病发生机制探讨、药物研究和筛选）。1. DNA序列测定 2. 基因突变多态性分析 3. 基因表达分析（组织差异性表达、代谢过程差异性表达、病理学研究） 4. 基因组研究 5. 基因诊断（产前筛查诊断、疾病预测） 6. 药物研究与开发（新
20、药筛选、药物靶标发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用分子原理、药物活性、毒性评价、中药成分筛选等）第三节 诊断分子生物学技术的临床应用一、人类基因组概念基因组是指每一机体或染色体所包含的全部DNA，人类基因组含有30亿碱基对，约35万个基因，为了全面揭示人类本身基因组结构，1990年美国倡导并正式启动了人类基因组计划，有美、英、日、德、法、中6国科学家参与，主要目标是识别人类DNA中所有基因，测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列。人类基因组计划被喻称为人类生命科学史上一次宏伟的登月计划。二、基因诊断基因诊断是指用分子生物学技术对引起疾病的原因遗传基因和病原体在基因水平进行病原学和细胞遗传
21、基因检测和分析的方法。特点：1. 高特异性：基于碱基配对原则 2. 高灵敏度：只需几个细胞就可以进行检测 3. 早期诊断性：因为很多疾病在出现临床症状前，基因已发生了相应的变化，如家族性癌症4. 应用范围广泛：疾病检测、病原确定，器官移植配型和法医鉴定等。（一）基因诊断常用的技术方法 1. 核酸分子杂交 （1）Southern 印迹杂交 用于基因缺失型突变、短串联重复序列型疾病，也可进行限制性片段长度多态性分析（2）Northern 印迹杂交 用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性或定量分析。（3）斑点杂交 用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析。在同一张膜上进行多个样品的检测。 （4）
22、原位分子杂交 用来检测DNA在细胞核或染色体上的分布及特定基因在细胞中的表达情况2. PCR及其衍生技术 目前PCR技术在基因诊断中已得到广泛的应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交、酶切图谱分析、单链构象多态性检测、限制性片段长度多态性分析、DNA序列测定等联合应用。3.单链构象多态性检测 单链构象多态性（SSCP）检测是一种基于单链DNA构象差别来检测电突变的方法。DNA变性后，在中性条件下单链DNA因分子中碱基之间的相互作用，形成一定的立体构象。相同长度的单链DNA，若分子中的碱基序列不同，则形成不同的构象，这就是单链构象多态性。不同构象的单链DNA表现不同的电泳迁移率。4. 限制
23、性酶切片段长度多态性 由于基因突变导致DNA分子中原有的某种限制性内切酶的识别位点发生改变，使原有的酶切位点消失或形成了新的内切酶位点，于是用这种酶进行酶切后，生成的DNA片段的长度或数目随之发生改变，这种改变如与某种遗传病的基因有关，即可作为这种遗传病的诊断指标。5. DNA序列测定 这是进行基因突变检测最直接、最准确的方法。不仅可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。 6. 生物芯片技术 该技术的基本原理是根据生物分子间具有特异相互识别作用的原理，将生物化学分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其它生物分子的高通量快速检测和分析。（二）基因诊断的应用 1. 基因
24、诊断在感染性疾病中的应用 直接检测病原体的遗传物质，不仅诊断的敏感性、特异性高，而且能对病原体的变异株作出诊断。 （1）检测乙型肝炎病毒（HBV）利用定量PCR仪检测病人病毒的拷贝数可以确定病人是否具有传染性。（2）检测丙性肝炎病毒（HCV） HCV是一种RNA病毒，用RT-PCR检测或定量，不仅能检测是否有病毒颗粒，还能判断感染者是否有传染性。 （3）检测人巨细胞病毒（HCMV） 快速细胞培养和ELISA法敏感性低，特异性及稳定性都较差。利用探针杂交法检测特异性为100%，也可用PCR。（4）检测人类免疫缺陷病毒（HIV） HIV是一种RNA病毒，检测HIV感染方法有病毒培养，抗原抗体测定，
25、这种检测法困难，因为胞内培养增殖率低，难培养，病毒变异大，故用RT-PCR法检测HIV有其独到好处。 （5）检测结核杆菌 涂片培养阳性率低，时间长（约50天）故用PCR检测快且好。 （6）检测疟原虫 镜检困难，检出率低，不能鉴别虫种，PCR法快且能鉴别出虫种。2. 基因诊断在遗传病中的应用 镰刀型细胞贫血为链N末端第六位氨基酸密码子由GAG变成了GTG，故氨基酸由谷氨酸变成了缬氨酸。（正常人为CCTGAGGAG，病人为CCTGTGGAG），Mst识别序列为CCTNAGG，故正常人能被Mst酶切，突变病人该位点不能被Mst酶切，有人设计了一对引物包括此突变位点，进行PCR后产生1.3kb片段，再进行酶切，纯合子正常人可产生1.1kb和200bp两种片段,可通过电泳检测杂合子与纯合子.3. 基因诊断在肿瘤中的应用 这类检测方法常用的有PCR-等位基因特异寡核苷酸探针杂交法 (PCR-ASO)、 PCR-单链构象多态性检测法 (PCR-SSCP法)。 4. 遗传易感性疾病 如家族性高脂血症、糖尿病、高血压等。 5. 法医鉴定和组织配型 由于DNA多态性的普遍存在，造成个体间DNA的差异很大，因此，每个个体均有其特征性的“DNA指纹”，不同民族的DNA多态性分布规律也不同。
