1、布鲁氏菌病研究进展布鲁氏菌病研究进展【关键词】 布鲁氏菌病，研究进展 综述布鲁氏菌病（Brucellosis，以下简称布病）是由布氏杆菌引起的一种人畜共患传染病，布氏杆菌侵入人体后可引起以长期发热、关节疼痛、肝脾肿大和慢性化为主要特征的机体变态反应性疾病。由于布病对人群健康、经济发展和国家安全都构成了严重的威胁，因此世界动物卫生组织将其列为B类法定传染病1中华人民共和国传染病防治法将其归为一类传染病2。尽管在许多发展中国家是一种地方病3.4，但是布病仍存在漏诊和漏报5。此外，由于布病是兽医发病率和死亡率的重要因素，这种疾病在发展中国家也可以引起经济损失6。随着分子生物学及免疫学技术的不断创新，
2、使得人们对于布病及布鲁氏菌有了进一步的认识，并且在布鲁氏杆菌致病机制、诊断技术、治疗药物和疫苗的研究及流行病学的调查研究等方面进行了一些有意义的尝试和探索。现将布鲁氏菌病的研究现况综述如下。1. 布鲁氏菌病的病原生物学研究布鲁氏杆菌是革兰氏阴性、无芽孢、不运动、不形成荚膜的球杆菌。微生物分类学家将布氏菌归为布鲁氏菌属，根据布鲁氏菌的致病性和宿主嗜性, 布鲁氏菌属分成 8 个种: 羊种、牛种、猪种、犬种、海豚种、海豹种、沙林鼠种和绵羊种布鲁氏菌7。人类能被羊种、牛种、猪种布鲁氏菌感染, 偶尔被犬种、海豚种、海豹种布鲁氏菌感染. 在不同种布鲁氏菌中, 羊种布鲁氏菌毒力最强。我国流行的主要是马尔他布
3、氏杆菌、流产布氏杆菌、猪布氏杆菌三种布氏杆菌，其中马尔他布氏杆菌病最为多见。崔步云等人应用细菌基因组重复序列PCR(Rep- PCR)方法通过分析基因组间的差异来鉴定分型 8。结果证明此方法不仅可以对布鲁菌株进行分型, 还可将典型和非典型布鲁菌进行鉴定和分型,弥补传统分类方法的不足。布鲁氏杆菌没有菌毛、质粒、粘附素和特定的分泌系统等经典的细菌独立致病因子，但其外层细胞膜中的脂多糖（LPS）和外膜蛋白（OMPs）与布病的毒力相关9。根据脂多糖是否含有O链，可将布鲁氏菌病分为光滑型和粗糙型，光滑型布鲁氏杆菌的O链含有多个抗原位点，目前认为是布鲁氏杆菌的重要的保护性抗原。有研究表明光滑型脂多糖在信号
4、传导、基因调控、跨膜运输过程中所涉及的蛋白质及细菌可能是布鲁氏菌的致病因子 10。目前国内外研究较多的外膜蛋白有OMP31、OMP25、OMP10和OMP36等11.12。2.流行病学研究50年代中期, 我国开始了有组织有计划的人畜布鲁氏菌病调查。布鲁氏菌病疫情大致可分为两个阶段: 90年代以前, 经过50 60年代末严重流行阶段后, 70 90年代初稳定下降。1993年后我国布鲁氏菌病疫情呈逐年上升趋势, 布鲁氏菌病爆发点从1993年的2个上升为1999年的145个, 新发病人数从329例到1996年的3366例, 1998以来一直维持3000例以上。20002004年我国布鲁菌发病率分别为
5、0. 1713/10万、0. 2296/10万、0. 4111/10万、0. 4782/10万、0. 9043/10万。迄今, 全国布鲁氏菌病疫情回升省区已超过10个。造成疫情反弹的可能原因包括流动人口的增加、未经检疫的牲畜的自由流动、乳、肉等畜类产品监督力度的减弱、综合性防治措施不力以及国际贸易和旅游业的发展、环境气候的改变13,仍需进一步究其潜在的因素。值得注意的是布鲁氏菌病的流行出现了新的趋势,即布鲁氏菌病疫区从牧区向半农半牧区、农区及城市蔓延; 形式以多发的、分散的点状流行代替了大规模的爆发流行形式; 受侵的人群除职业人群外,非职业人群感染率相对上升。老年、青少年以及儿童的发病有增高的
6、趋向, 羊种布鲁氏菌有成为流行的优势菌种等13.14这些流行新趋势都为防制工作带来新的困难。值得提出的是,在布鲁氏菌病流行中布鲁菌属内种间干扰现象的发现15,以及布鲁氏菌病地理流行病学和分子流行病学的出现,为布鲁氏菌病流行病学的研究提供了新的前景。目前，中国部分地区人间布病疫情非常严峻，如疫情进一步扩散，对群众健康、当地经济和社会稳定的不利影响将进一步加大，应该尽快采取更加有力的措施，控制疫情的发展。由于人间布病的主要传染源是病畜，因此，加强畜间布病的控制工作是做好人间布病防控的关键。同时，做好布病患者的早发现、早诊断和规范化治疗，防止慢性化，也是降低布病危害的重要措施。传染源目前有 60 多
7、种动物是布氏杆菌宿主，与人类有关的传染源主要是羊、牛、及猪。病畜的排泄物、分泌物中含有大量布氏杆菌菌，由于人类与家畜和畜产品接触密切，这增加了人感染布病的机会。各型布氏杆菌在各种动物间有转移现象，即羊种菌可能转移到牛，猪等16传播途径（1）经呼吸道传染 病菌可形成气溶胶，可发生呼吸道感染。（2）经消化道传染 食用被病菌污染的水、食物、生乳、未熟的肉、内脏而感染。（3）经皮肤粘膜接触传染 直接接触病畜或其分泌物，娩出物、排泄物；或在与动物密切接触中如剪毛、屠宰、加工皮、毛、肉等过程中没有注意防护而受染；也可间接接触病畜污染的环境及物品而受染。（4）其他如苍蝇携带，蜱叮咬也可传播本病16(5)很少
8、有报道人与人之间传播布病, 人通过食入被布鲁氏菌污染的动物性食品, 吸入含菌气溶胶, 或接触患病动物的分泌物、胎儿、乳汁、排泄物等发生感染, 动物流产和分娩之际是感染机会最多的时期17.18 。因此布病严重威胁着动物饲养、兽医、肉品加工等从业人员的身体健康。人群易感性人群普遍易感，青壮年发病为多，男性多于女性，与职业有密切关系，高危人群主要为与动物密切接触者，如畜牧者、兽医、屠宰工、皮毛工和进食被污染的动物产品或制品者163.发病机制的研究进展布病的的发病机制较为复杂，细菌、病毒以及不同抗原组分的变态反映均不同程度地参与疾病的发生和发展过程。对完整的布鲁氏菌基因组的深入分析，并没有确定任何经典
9、的致病因素，如毒素，菌毛等。因此这些分析增加了这些生物体使用独特而微妙的感染机制的可能性，即逃避宿主的防御，渗透宿主细胞，改变细胞内转运以避免溶酶体降解和杀害，并调节细胞内环境，可准予自己在细胞内长期生存和复制19。布鲁氏菌与毒力因子有关的主要基因是控制脂多糖( LPS)合成的基因、四型分泌系统基因( Virb) 、过氧化氢酶基因( Cat) 、超氧化物歧化酶基因( SOD) 、布鲁氏菌毒力因子A 基因( BvfA) 等。布鲁氏菌有光滑型和粗糙型, 通常粗糙型不含或含少量的O-多糖, 致病力比光滑型弱研究表明布鲁氏菌最主要的致病机制是在宿主单核吞噬细胞等免疫系统的细内定居及繁殖，布鲁氏菌感染后
10、诱发吞噬细胞凋亡，当吞噬布鲁氏菌的巨噬细胞发生凋亡后细胞被包埋在凋亡小体中，并被其他抗原提成细胞摄取，通过这种方式摄入包埋的细菌可能触发更为有效的包内杀菌机制。此外细胞凋亡还可抑制布鲁氏菌的生长和复制, 防止布鲁氏菌感染的播散20-22。因此，有部分学者认为在布病的发病机制中，巨噬细胞的凋亡是一种机体免疫保护机制。有资料显示光滑型、非内毒素的脂多糖在感染的初级阶段可以阻碍先天和后天的免疫，以及保护病原体免于免疫系统的杀细菌活动23。而且光滑型的脂多糖阻止免疫介质的合成及炎症介质的释放，比埃希氏杆菌属更具有有效性24。布鲁氏菌病的发病机制尚未明了，有待进一步探讨。4、临床和实验室诊断研究进展：4
11、.1临床诊断布鲁氏菌病的潜伏期一般为 7-60 天，平均两周，少数患者可长至数月或一年以上，潜伏期的长短与病原菌的菌型、菌量、毒力、及机体抵抗力等诸因素有关。临床上可分为急性期、慢性活动期、慢性期相对稳定型17。国外分期法分为：患病三个月内为急性期；3 个月至一年为亚急性期；一年以上为慢性期。自布鲁氏菌病被发现以来，其有着广泛的临床表现。临床特点取决于疾病的发展阶段，所涉及的器官和系统。近年研究表明，布鲁氏菌能侵犯中枢和周围神经系统以及胃肠、肝胆、泌尿生殖、骨骼、心脑血管、表皮组织。尽管在布鲁氏菌属的分型上存在争议，但是人布鲁氏菌病的主要感染病原体是羊种、流产型布鲁氏菌25。但是物种之间的临床
12、差异难以确定，因为很少有在每一个物种有比较充足病例的情况下研究其临床表现26。因此布病物种之间是否存在临床差异性尚不能确定，有需进一步大样本病例研究。 因为布氏杆菌的临床表现的多样性，临床诊断的基础在于采用一个详细的病史，以及注意流行病学资料。必须特别注意放在决定摄入污染乳制品或接触受感染的动物是否发生。详细的问病史对于人布鲁氏菌病诊断，尤其在城市和非流行区、输入病例（旅行者在国外获得病，在非流行区发病）是重要的27。我国的 CDC 布病诊断标准为：流行病学接触史：密切接触家畜、临床症状和体征应排除其他疑似疾病；实验检查：病原分离、补体结合实验、试管凝集试验、抗人球蛋白试验阳性。凡具备项和项中
13、的任何一项检查阳性即可确诊为布病28。4.2实验室诊断目前布病检疫和诊断主要采用血清学和细菌学方法。血清学方法种类很多, 但总体上在特异性、敏感性及操作性方面没有哪种方法令人十分满意。但随着分子生物学的快速发展，一些新的诊断技术如ELLISA、PCR等相继应用于布病的诊断。在提高布病的诊断阳性率，及准确性上，起到了很大的作用。4.2.1血清学诊断方法常用的血清学检测方法有：虎红平板凝集实验（RBT）、试管凝集试验（STAT）、缓冲板凝集实验（BPAT）、补体结合试验（CFT）、乳汁环状实验（MKT）、2一琉基乙醇试管凝集实验(2一ME)等方法。平板凝集实验(PAI，)是将高浓度菌液置于高浓度盐
14、水后染色制成抗原，检钡(速度快，易于掌握和操作，是一种畜间检疫和人群快速初筛的方法。虎红平板凝集实验(RBPT)使用酸性缓冲玻片抗原代替旧有玻片抗原，从而减少非特异性凝集，但此法受制备抗原影响较大。试管凝集实验(sAT)29由wright等在1897年建立，因此又称为wrighi实验，灵敏性和特异性都很高。微孔凝集实验是对SAT的改良，血清和试剂用量更少，并能同时测定多份样本。抗人球蛋白实验(Coombstest)则是sAT的进一步强化，检测的是感染者产生的不完全抗体，从而克服由于抗体过剩、前带现象或产生单价抗体而看不到凝集现象的情况。免疫捕获凝集实验(Brucellacapt)与Commbs
15、实验相比，操作更为简便，得出结果更快。2一琉基乙醇试管凝集实验(2一ME)主要检测IgG类抗体的凝集活性，但只能用于检测小分子量的免疫球蛋白，并且操作复杂，对设备有一定要求，耗时较长，故仅用于少数难以确诊的病例。皮内变态反应阳性表示受试者曾受到布鲁杆菌感染，一般在感染后的20一25d出现，因此不宜用于疾病早期。补体结合试验（CFT）是根据溶血现象的发生与否来判断受检血清中是否存在布鲁氏杆菌的特异性抗体。此检测方法常用于标准试管凝集试验和琥红平板凝集试验检测为阳性或可疑的病例进行定性检测。目前，补体结合试验仍是最有效，应用最广泛的诊断方法，至今尚没有一种诊断方法能取代补体结合实验在血清学诊断中的
16、地位。但是此实验所需要的溶血素的制备困难，实验繁琐，难以在临床上普遍使用30。4.2.2酶联免疫吸附试验ELLISA酶联免疫吸附试验是近年来研制出来的一种新型快速检测方法，常用方法有：间接法、直接法、竞争法、双抗体夹心法。ELLISA方法最早由Garin-Bastuji等用来检测布氏杆菌抗体，其敏感性比试管凝集反应要高10-100倍31。许多学者相继应用ELLISA对人、动物的布鲁氏杆菌抗体检测进行研究，结果表明ELLISA方法比传统的标准试管凝集试验、补体结合试验敏感，并且特异性较高。由于酶标记结合物制备容易，具有稳定性好有效期长敏感性高等优点，同时可以用肉眼或光学显微镜直接观察，所得的结果
17、客观可靠，最主要的特点是快速特异灵敏，因此ELLISA方法是国际贸易指定的诊断方法。4.2.3多聚酶联反应(PCR)多聚酶联反应技术是一项体外酶促扩增 新技术，具有特异性强和敏感性高操作简便快速高效等特点，已广泛用于畜禽传染病、遗传病诊断和生物工程等方面。 5.治疗研究进展布鲁氏菌病的治疗目标是减少症状、缩短疾病周期，和减少并发症以及复发率。适当的抗生素联合使用仍需应用于布鲁氏菌病的成功治疗上。WHO推荐治疗方案是多西环素200mg联合利福平600-900mg每日一次，至少服用六周32。但是20年以来口服方案的治疗失败率及复发率从4.6%升至24%，口服联合静点方案对应值也从5%升至8%，值得
18、一提的是 WHO并未更新布病的推荐治疗方案33.34.35。导致如此高的治疗失败率及复发率的原因至今尚未弄清。因此更多的关于理想的治疗方案的研究及讨论仍然持续着。据国外一项随机临床试验报道称，氧氟沙星联合利福平，多西环素联合利福平在布病的治疗有效性及复发率无统计差异性。由于布氏菌是细胞内寄生, 目前尚无一种理想药物能将其彻底杀灭。因此在细胞内有活性的抗生素对于像布鲁氏杆菌这样的胞内寄生菌是必需的. 喹诺酮类( qunolones)抗菌药是指人工合成的含有4-喹酮母核的一类抗菌药物, 环丙沙星是第一代奎诺酮类抗菌药, 左氧氟沙星是新一代光学活性奎诺酮抗菌素, 均具有抗菌谱广、抗菌作用强、安全等特
19、点。由于其易进入细胞, 分布范围广, 故药物起效快，尤其进入吞噬细胞内, 可杀灭侵入机体网状内皮系统吞噬细胞内的布氏菌, 从而阻断慢性肉芽肿形成, 被认为是目前治疗布病的理想抗菌素。有人用环丙沙星、左氧氟沙星治疗布病, 疗效显著 36, 37 。氧氟沙星对革兰氏阴性菌具有较强的杀菌作用, 且细胞内渗透性强, 组织分布广, 副作用小, 其光毒性和中枢神经毒性分别小于7%和5%, 这在奎诺酮中是较低的, 故可以适当延长用药时间,，并且可以清除隐匿在机体内的布氏菌, 从而达到治疗的目的，这对慢性布病治疗非常有利38。也有研究表明喹诺酮类抗生素在细胞内聚集浓度和胞外聚集浓度的比例是8:15，这一项指标
20、高于其它大部分的抗生素39。有人用莫西沙星、环丙沙星、四环素、强力霉素、链霉素、磺胺甲级异戊唑对墨西哥的97株布氏菌进行药效试验, 结果氟奎诺酮和四环素抗布氏菌活性较好( 90%菌株抑菌浓度为0. 5_g/ml)40。另一项研究报道氧氟沙星对于羊种型的90%菌株抑菌浓度为0.02mg/L41，另一研究表明环丙沙星和氧氟沙星为0.5mg/L42。然而左氧氟沙星联合多西环素治疗布鲁氏菌病的研究国内外很少有报道。迄今为止, 临床工作者仍在探寻一种高效、经济、快速及治愈率高的方法来防治布病, 尽管目前的一些联合用药、中西医结合等方法取得了较好的疗效, 但仍有不尽人意之处38。因此, 布病的治疗依然是当
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