1、基因芯片技术,Gene chip technology,内容提要：了解肿瘤基因组学了解基因芯片在肿瘤基因组学的应用了解药物基因组学了解基因芯片在药物基因组学的应用了解分子诊断的概念、方法了解基因芯片用于单核苷酸多态性检测,第10章 基因芯片与医学,肿瘤的研究美国1971年颁布国家癌症条例开始抗癌大战,“is an abnormal mass of tissue,the growth of which exceeds and is uncoordinated with that of the normal tissues,and persists in the same excessive ma
2、nner after cessation of the stimuli which evoked the change”,Willis,1952,肿瘤是一团不正常的组织，在正常组织中快速、不协调的生长，并且在刺激其产生这种变化的因素消失以后，这种不正常的生长仍然持续。,Basic Biologic Features of Neoplasms肿瘤基本的生物特征,分化Differentiation,不正常增殖Abnormal Proliferation,血管再生Angiogenesis,转移，入侵性Invasion,衰老Senescence,细胞凋亡Apoptosis,恶性肿瘤Oncogenic
3、Lesion(e.g.RAS,MYC,E2F Activation),正常细胞经过多步才能变成变肿瘤Neoplasms Evolve in Multiple Steps,Initiation:presumably occurs through irreversible or stable damage to DNAPromotion:an process bringing about a clonal expansion of initiated cellsProgression:results when genetic instability leads to further mutagen
4、ic and epigenetic changes,发生：推测可能是由不可改变的或者稳定的DNA损伤开始的。促进：一个程序导致DNA损伤细胞开始无性克隆 继续：当遗传上的不稳定导致更多的肿瘤诱导物产生，无性克隆细胞就变成肿瘤细胞,肿瘤的发生（Initiation）,Tumor initiation：Cooperative DNA lesions as common final pathwayPrecancerous and incipient（初始的）lesions Molecular targets：Oncogenes,tumor suppressor genes&DNA repair ge
5、nes,肿瘤的发生：本来应该正常终止的途径没有终止引起DNA损伤癌症前期和初始损伤分子靶标：致癌基因，肿瘤抑制物，DNA修复基因,肿瘤的促进（promotion）,Expansion of initiated cellsRepetitive process,起始细胞的扩增重复过程,Initiation&Promotion,致癌剂肿瘤促进剂低黄曲霉素B1Aflaloxin B1，高杀草强Amitrole，砷和其化合物Arsenic&compounds，高三氧化二砷Arsenic trioxide，高三硫化砷Arsenic trisulfide，高石棉Asbestos癌基因（如myc、ras）需要
6、反复刺激,Initiation&Promotion,Time,No tumor,No tumor,No tumor,No tumor,Tumor,Tumor,=Promoter,=Initiator,Gr.1,Gr.2,Gr.3,Gr.4,Gr.5,Gr.6,Initiation&PromotionTarget Genes,肿瘤的发展（progression）,肿瘤组织浸润相邻组织淋巴结转移和血道转移远端转移,细胞凋亡和肿瘤发生Apoptosis and Tumorigenesis,小结：,肿瘤发生发展的三个阶段,基于基因表达谱的分子分型,为什么提倡利用分子水平进行肿瘤的分型？,肿瘤的一般临床
7、学知识,肿瘤的诊断肿瘤的临床分期（stage）肿瘤的临床分级（grade）肿瘤的治疗放疗化疗辅助治疗靶点治疗,肿瘤的临床分期(stage),TNM分期 肿瘤的大小(T,tumor size)肿瘤是否发生临近的淋巴结转移(N,node)肿瘤是否有远处转移(M,metastasis),乳腺癌分期,Tis Carcinoma in siteT1 Tumor 2.0 cm in greatest dimensionT2 Tumor 2.0 cm 5.0 cm in greatest dimensionT3 Tumor 5.0 cm in greatest dimensionT4 Tumor of an
8、y size with direct extension to chest wall or skinN0 No regional lymph nodes metastasisN1 Metastasis to moveable ipsilateral axillary node(s)(同侧腋下淋巴结)N2 Metastasis to ipsilateral axillary node(s)fixed to one another or other structuresN3 Metastasis to ipsilateral internal mammary node(s)M0 No distan
9、t metastasisM1 Distant metastasis(includes metastasis to ipsilateral supraclavicular（锁骨）lymph node(s),Stage 0 Tis N0 M0Stage I T1 N0 M0Stage IIa T1 N1 M0 T2 N0 M0Stage IIb T2 N1 M0 T3 N0 M0Stage IIIa T1,2 N2 M0 T3 N1,2 M0Stage IIIb T4 Any N M0 Any T N3 M0Stage IV Any T Any N M1,问题：这样的分期是否准确反映了病人的预后情
10、况？,肿瘤的临床分级(grade),分级指标:细胞的异常形态，细胞的恶性生长速度。肿瘤细胞生长的分级:1 到 3分别对应级别的低，中，高，在临床上常称为高分化，中分化，低分化。级别越低，预后越好。级别越高，对放疗和化疗的敏感度也较强。肿瘤细胞与来源器官中细胞的相似程度，分化良好的细胞有高度的特化特点，组织结构清晰，很容易辨认。低分化的细胞组织结构不清，很难辨认。,肿瘤的病理学诊断方法,冰冻切片和石蜡切片的染色和组织化学方法：确定肿瘤细胞的分化程度；鉴别肿瘤的类型；研究肿瘤组织发生流式细胞术定量诊断（肿瘤细胞核形态参数）：癌（瘤）细胞DNA含量的检测；良性病变多为二倍体；恶性肿瘤多为非整倍体问题
11、：单基因的组织化学检测是否能准确反映肿瘤类型及分化程度？,肿瘤的传统检测,传统的肿瘤解剖分期(包括肿瘤大小、淋巴结转移数目，TNM)对于预测肿瘤的复发转移价值不可低估，是临床上较成熟的风险评估指标。传统的组织病理诊断：以组织形态、免疫组织化学染色；通常以单一基因的不同表现对肿瘤作出诊断。问题：组织病理学上看起来一样的肿瘤，其自然发展史、生物学行为以及对治疗的反应和预后等都会有所不同。从活检标本上看都像是肿瘤的两个病人，他们都有肿瘤灶，你可以说它们看起一是一样的，但事实上，一位病人已在别的部位有恶性生长了。,肿瘤的化疗,化疗对分裂细胞有效，但肿瘤细胞不是体内唯一具有分裂能力的细胞，所以化疗对正常
12、分裂的细胞有一定的伤害。,肿瘤的放疗,放疗对旺盛生长和分裂的细胞有效。由于肿瘤细胞比起正常细胞在基因组上不稳定，所以对放疗的敏感度高于正常细胞，同时由于正常细胞具有完善的修复系统，比较耐受放疗。,肿瘤的辅助治疗,根据肿瘤的特殊性质而制定的治疗方法，如激素治疗也有把放疗，化疗结合激素治疗的方法称为辅助治疗,肿瘤的靶点治疗,根据在肿瘤发生发展中具有重要意义的靶点基因而研制成的药物，如乳腺癌的治疗靶点基因HER2，肺癌的靶点基因EGFR,肿瘤治疗中存在的问题,放疗，化疗，激素治疗的耐受过度治疗？,基因芯片在肿瘤研究中的应用,应用DNA微阵列技术和多基因RT-PCR定量检测方法来预测乳腺癌的复发转移风
13、险及其对治疗的反应，取得一定突破。还存在诸如检测方法的可重复性、肿瘤标本的取材标准、统计学分析以及检测结果核查的标准化等问题。Ntzani和Ioannides在总结1995年到2003年4月MEDLINE共84篇关于此类技术的论文后发现,只有30篇涉及临床结果，他们提出：DNA微阵列技术还需大规模前瞻性临床试验证实，同时应与现有的一些已知预测因子联合进行比较，最后作出谨慎的审核与决定。,Stanford大学的Patrick Brown认为：有用的诊断图谱肯定会出现的，“当二个生物标本的差异足以引起我们的重视时，那么肯定在它们的基因表达上也有相应的差异一旦候选基因图谱被确定，并集中到几个关键基因
14、上，就可利用简单的技术如PCR针对较大的人群中对有效的、重复产生的改变进行检测。如果一个基因在表达上的改变能重复出现，则这个基因就可用作基因诊断标记物。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,肿瘤的生物学指标(包括组织学分级、biomarker、增殖指标等)不仅能够判断肿瘤的预后，还能够预测肿瘤对治疗的反应，并为肿瘤的个体化治疗提供依据。价值超过了解剖分期，是目前临床研究的方向与重点之一。,肿瘤的分子分型（分子诊断）肿瘤的分级肿瘤的分期，预后肿瘤放疗化疗或激素治疗耐受肿瘤靶向转移（肿瘤形成转移的能力依赖于多种基因的联合作用，肿瘤转移的每个器官都需要不同组的基因）。肿瘤的分类：用表达图谱区分出所检测的标本
15、是正常组织还是肿瘤；若是肿瘤，又能区分出是良性还是恶性。运用基因芯片得到的Biomarker可用于肿瘤的早期诊断。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,白血病的分类,肿瘤分类学在过去的30多年间进步不少，但是在鉴定新的肿瘤类型（class discovery）和肿瘤分类（cancer classification）还缺乏通用的方法。急性白血病的分类方法：核的形态学分析，酶学免疫组化，染色体易位分析，任何一个分析都需要非常有经验的医师进行详尽的检查以及分析，需要专业的实验室来完成，但没有一个单独的测试能够足以用于诊断。传统分类方法的联合运用，一般而言比较准确，但仍旧会出错。,运用基因芯片表达谱对急性白血
16、病分类,寻找在基因表达水平与预测ALL和AML密切相关的分子群运用这一分子群，看如何能将已知分类的样本进行准确的分类预测，即寻找能进行分类的基因群（class predictor）（training set）用新的样本群检测class predictor的准确性(test set),Precise Classification of Cancer is the First Step in Rational Treatment,Gene Expression Profiles,Science 286:531(1999),Distinguishing between acute lymphobla
17、stic leukemia(ALL)and acute myeloid leukemia(AML)is crucial because their therapies are different.RNA from 38 bone marrow samples were hybridized to Affymetrix chips containing probes for 6,817 genes.The expression profiles of 50 genes clearly differentiate between the two types of cancer.,乳腺癌的预后分类与
18、治疗,同一分期的乳腺癌病人在治疗的反应和总体的治疗结果上有很大差异传统的用淋巴结状态和组织化学检测的方法无法准确判断肿瘤的临床表现化疗和激素治疗可以降低远处转移的风险约三分之一7080的病人不经过化疗等手段预后仍较好,Gene Expression Signatures标签 for Breast Cancer,Application:Gene ExpressionIdentifying gene expression signature that reflects biological behavior of a tumor(预后好与预后差)70-gene prognostic profile
19、 tested295 breast cancer samplesoutperformed all clinical variables for predicting patient survivalMicroarray classifiers to direct customized therapyStarting point for targeted and rational drug development,Classification on prognostic signature,Supervised classification on prognosis signatures,预后（
20、预测临床检测结果）Predict clinical outcome,Prognosis of additional 19 patients,Results 231 genes were significantly associated with the disease outcome70 genes were further selected to be optimal marker genePrediction accuracy 80%,开发公司：Agendia芯片名称：MammaPrint(R)Agendia Receives U.S.FDA Clearance For MammaPrin
21、t Breast Cancer Diagnostic TestAgendia announced that the U.S.Food and Drug Administration(FDA)has cleared the companys MammaPrint breast cancer diagnostic test.MammaPrint is agene expression profiling service to assess the risk of recurrence in breast cancer patients.MammaPrint represents a U.S.reg
22、ulatory milestone as the first In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay(IVDMIA)to acquire market clearance from the FDA,and is the agencys first step toward standardizing these multi-gene expression tests.,DNA阵列杂交结果最直接的影响是诊断；杂交结果中可以得到药物靶标基因，可为最后治疗癌症打下基础挑战：随着实验技术及仪器的不断改进和基因组数据的急剧增长，基因芯片产生的各种基因表达数
23、据，规模庞大，内容复杂；如何分析挖掘数据成为生物信息学中的挑战性课题。利用芯片检测肿瘤组织中基因表达谱将成为研究肿瘤的一种标准方法。,基因芯片在肿瘤研究中的应用,小 结,目前肿瘤诊断和治疗中存在的问题利用基因芯片进行分子分型,其他基因芯片类型在肿瘤研究中的应用,miRNA芯片CGH芯片甲基化芯片等,miRNA芯片,microRNA,microRNA(miRNA)是20 24nt的单链 RNA，在进化上具有高度的保守性，它通过与靶mRNA 不完全互补配对，抑制蛋白翻译,调节内源基因表达，在基因调控中扮演了重要的角色。MicroRNA 一般通过碱基配对结合到 mRNA 的 3 非翻译区（3-UTR
24、），从而抑制mRNA的翻译发挥功能，在细胞分化，生物发育过程中起到重要的作用，并且参与疾病发生发展。,Differences in miRNA Mode of Action,miRNA,microRNA在动植物中广泛并保守的存在；microRNA参与广泛的生物学过程，尤其是发育相关过程和组织特异性维持；microRNA与target基因的交叉调控关系；microRNA表达的基因芯片实验发现在癌症组织中miRNA广泛失调；microRNA的表达谱可以对不同癌症甚至同种癌症的不同亚型进行分类。,miRNA在癌症中的作用,1.miRNA处于基因组中的脆性位点，在癌症中常常缺失或扩增,2.miRNA基
25、因所在位点在癌症中在表观遗传层面上被修饰调控,3.miRNA发生相关基因如Drosha,Dicer在癌症中表达失调,Remains largely a mestery!,探 针,寡核苷酸探针Sanger mirBase 7.0 中已知的 Human,Mouse,Rat,Drosophila,C.elegans 和zebrafish 的探针http:/www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml前体和成熟的miRNA都可以设计探针点于芯片上,Case 1433 was initially diagnosed as ERMS based on i
26、ts histology and reactivity for desmin,smooth muscle actin and CD99，this case clustered tightly with the other ARMS included in the study.Subsequent demonstration of the fusion transcript PAX3-FKHR by reverse transcription(RT)PCR and sequencing in this sample confirms that this case is indeed an ARM
27、Scase 5918 was initially diagnosed as a GIST based on its origin in the wall of the colon and reactivity for CD34.However this case clustered away from the eight other GISTs and instead clustered loosely with PRMS.Both KIT and DOG1 are highly expressed in the vast majority of GIST.Case 5918 did not
28、have immunoreactivity for KIT or DOG1 and no mutations were found in KIT exon 11,the most common mutation in GIST.Histologic review of the tumor suggested a new diagnosis of dedifferentiated liposarcoma.,27 sarcomas,5normal smooth muscle and 2 normal skeletal muscle tissues,microRNA expression profi
29、les classify human cancers,Leukemia,Solid Tumor,microRNA表达谱的不一致性很高,不同实验室得出的microRNA表达谱结果很不一致：microRNA芯片技术的难度和不成熟性。RNA类型：总RNA进行实验可能同时检测了成熟的miRNA与前体miRNA。如果miRNA成熟受阻，则可以解释此矛盾。这暗示，前体miRNA可能含有独立的，还未知的功能。使用纯化的小RNA进行实验可能会引入错误：目前无法测量小RNA在总RNA中的比例情况，如果癌症与良性组织含有不同比例的小RNA，那么纯化小RNA实验的前提（同样量的miRNA被纯化得出）则会受到根本的影
30、响。样本量对结果的影响,PC3 cells were transduced with adenovirus either encoding p53 or containing an empty vector.After 48 h,small RNA was characterized with PCR Arrays containing 376 human miRNA-specific assays.The heat map visualizes the fold-differences in miRNA expression upon p53 over-expression(red,up-r
31、egulated miRNA;green,down-regulated miRNA;black,no difference).,PCR Arrays are the most reliable tools for analyzing the expression of a focused panel of genes.Each 96-well or 384-well plate includes SYBR Green-optimized primer assays for a thoroughly researched panel of relevant,pathway-or disease-
32、focused genes.PCR Arrays can also be customized to contain a panel of genes tailored to your specific research interests.,比较基因组杂交芯片CGH array,杂合性缺失（loss of heterozygosity）,杂合性指同源染色体中不同等位基因存在于一个或多个基因位点中的现象；野生型拷贝或等位基因发生缺失就称为杂合性缺失（LOH），LOH通常是由染色体缺失或重组引起。绝大多数人类肿瘤都存在非随机性的染色体片段丢失。杂合性缺失在肿瘤细胞中是一种非常常见的DNA变异。肿
33、瘤中存在基因的扩增通过比较肿瘤组织与体细胞组织中野生型和突变DNA的比值可以检测LOH以及基因的扩增,比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）,一种分子细胞遗传学技术，能够通过一个简单的杂交反应检测出整个基因组DNA拷贝数改变。主要原理是采用经过荧光标记的肿瘤基因组DNA和正常基因组DNA为探针，与正常人中期染色体标本进行原位杂交，根据两种探针荧光信号的强度差异找出基因组中DNA的增加或缺失区域。,aCGH(Array Comparative Genomic Hybridization),比较基因组杂交（简称CGH）的方法被用来监测染色体基因组的改变。CGH最突出的优点在于：通过一次实验就能完成对整个基因组中所有遗传物质增加或丢失的分析，实验所使用的DNA可以是从新鲜冻存的组织中提取的，也可以提取自福尔马林固定石蜡包埋的保存材料。,aCG
