1、年产8吨脂肪酸提取纯化生产工艺的设计年产8吨脂肪酸提取纯化生产工艺的设计1.概述1.1脂肪酶的来源脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他 的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必 需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织， 在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉 食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制 着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂 肪酶含量更为丰富（Pandey等）。由于微生
2、物种类多、繁殖快、易发生遗传变 异，具有比动植物更广的作用 pH、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高 纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研 究方面也具有重要的意义。1.2脂肪酸的性质脂肪酶，又称甘油三酷水解酶，是一类特殊的酯键水解酶，它广泛地存在于 动物组织、植物种子和微生物体中。脂肪酶能催化天然底物油脂（甘油三酯）水解, 产生脂肪酸和甘油，在水解过程中会产生中间产物甘油单酯和甘油二酯。 脂肪酶可以催化酯类化合物的分解、合成和酯的交换，它具有化学选择性和高度的立体 异构专一性，且反应不需要辅酶，反应条件
3、温和，副产物少。脂肪酶的另一显著 特点是：它只能在异相系统（即油一水界面）或有机相中作用，这不仅发展了“界 面酶学”，也促进了 “非水酶学”的研究和深入。脂肪酶属于丝氨酸水解酶，且 它含有相同的结构序列，G- XI S-X2 G（G为甘氨酸，S为丝氨酸，X伪组氨酸, X2为天冬氨酸），它的三维结构对酶的催化作用影响很大。微生物脂肪酶的温度 适应范围很广，一般在30-90 C之间，有的低温脂肪酶在20C下仍能保持较高的 活性，嗜热脂肪酶则能适应50C以上的高温。脂肪酶适应的pH值范围变化也很大， 在pH4.0-11.0之间，表现出不同的稳定性。脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交
4、换、酯合成等反 应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不 同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪 酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。1.3脂肪酶国内外生产情况与发展前景由于微生物脂肪酶具有不同的催化功能，除有无水解脂肪酷键位置专一性 外，还有作用温度的高温、中温和低温，作用 PH勺碱性、中性和酸性，从而构成 极为广阔的应用空间。以微生物为来源生产脂肪酶较动植物更具有巨大的潜力和优势。 目前，国内外微生物脂肪酶的研究、生产和应用都取得很大的进展。国外，微生物脂肪酶的生产主要集中在丹麦、 日本和美国等国家，据
5、不完全 统计，有66个属的微生物可产脂肪酶，其中：细菌有29个属;放线菌有4个属：酵母 属有10个属，真菌有23个属。由于发酵酶活测定方法的不可比性，无法正确显示目前国外脂肪酶的发酵酶 活，但产品酶活用统一标准的测定方法， 可得到显示的酶活单位，以我国绿微康 酶活测定的方法，我们比较了几个国家生产企业的脂肪酶产品， 产品酶活差别很 大，从几万卩/ g到几十万卩/ g都有。据了解，国外几家脂肪酶生产企业其发酵酶活都没有新的突破， 但酶的下游 工程的技术和装备突破很大，尤其酶的定向进化技术的应用，使酶的特性和酶活 单位有了很大的改进和提高，产品都可显示出高酶活单位。我国微生物脂肪酶的生产，就目前而
6、言，碱性脂肪酶仅绿微康独家生产，假 丝酵母产中性脂肪酶也仅1、2家，绿微康碱性脂肪酶罐上发酵单位可稳定在 6000 卩/ ml左右，产品酶活可由几千卩/ g到几万卩/ g，甚至更高。我国微生物脂肪 酶己实现产业化，虽然目前生产量还低，但己在诸多产业中逐步推广使用。 由于 价低质优，在国际市场中极具竞争力，绿微康已首次实现我国碱性脂肪酶的出口， 而且份额正在逐步扩大之中。因此，微生物脂肪酶具有广阔的应用空间， 尤其国 产微生物脂肪酶具有优良的酶学特性， 可适应不同应用领域的需求，微生物脂肪 酶国产化己为期不远了。1.4脂肪酶的用途1、 在洗涤工业中的应用：与碱性蛋白酶配伍成的复合酶，添加于洗衣粉
7、中， 可明显提高洗衣粉的去污力。2、 在面粉工业中的应用：与真菌a淀粉酶等配伍成的复合酶，作为面粉改 良剂，应用于馒头粉和面包粉中，具有增筋和增白双重作用，可以少用甚至不用 化学乳化剂和化学增筋增白剂。3、 在皮革工业中的应用：在毛皮、皮毛脱脂中作为一种高效、无污染的生物 脱脂剂，其脱脂效果优于碱法脱脂和化学法脱脂，明显提高皮革的等级率。4、 在食品工业的应用：利用酶作用后释放出的链较短的脂肪酸，增加和改进食品的风味和香味；利用脂肪酶催化的醇解和酯化反应来生产各种香精酯， 作调料剂；用有1,3 -专一性的微生物脂肪酶提高食用油营养价值和增加食用油的 花色品种，制备代可可酯等高档油脂；另外，脂肪
8、酶还可以用于酒类的去浊除渣、 改善面包质量，改善蛋白的发泡等等方面。5、 在脂肪酸工业中的应用：可实现脂肪酸工业酶法生产新工艺， 具有作用温 和，低温，低压，设备简单，提取收率咼，对环境污染少等独特优点。6在造纸工业中的应用：可实现木浆中松脂去除有机械法转向酶法，彻底解 决机械法去除松脂不彻底的难题，明显提高纸张的等级率 ：可作为油墨纸浆中去 墨的生物脱脂剂，具有明显的去墨效果。7、 在机械加工中的应用：可作为一种优良的生物脱脂剂，而应用于汽车、轮 船及相关机械工业中得清洗剂，效果优于化学脱脂剂。8、 在饲料工业中的应用：与a -淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等配伍成复合酶， 作为饲料添加剂，可明显
9、提高饲料利用率，料肉比和料蛋比，降低饲料成本。也 可单独使用，可减少仔猪的腹泻率。9、 在医药、精细化工等工业中的应用：在医药、农药、精细化工工业中的手性化合物的生物拆分，微生物脂肪酶是实现酶法拆分的最主要酶钟， 是制备手性 化合物的首选方法。10、 在酿酒工业中的应用：可提高白酒中酯类香味物质含量，加快白酒中各种酸、醇、酯的反应平衡，缩短贮存老熟时间，调节白酒中各种香味物质的含量 和比例，使酒质窖香浓郁、绵甜爽冽，香味协调饱满、余味悠长 ；优质酒品率可以提升30%以上。11、 在酱类酿造工业中的应用：可达到增香的目的。12、 脂肪酶在外消旋混合物光学拆分中的应用酶催化反应的高效性、高立体选择
10、性及温和反应条件使得酶催化拆分法可用 于某些用一般法难以拆分的手性化合物。 脂肪酶是水解酶，对广泛的底物能催化 不对称水解或不对称酯化。脂肪酶对手性化合物，如醇、羧酸、酯、酰胺和胺等 均有较好的立体选择性。因此脂肪酶被广泛地用来拆分外消旋醇和羧酸。 拆分的主要途径为立体选择性水解、酯化或转酯反应。用乙烯基酯为活性酯，在无水二 氯甲烷中用假单胞菌脂肪酶催化氰醇的化学拆分，得 S型醇，经化学转化合成B -肾上腺素抑制剂。此外，脂肪酶还用于酯环仲醇的拆分，拟除虫菊酯中间体 的拆分，除草剂对甲氧基苯甲酸基奈普生、布罗芬的拆分等。1.5设计范围1.设计规模为年产8吨的脂肪酶的提取纯化生产工艺。利用假丝酵
11、母培养基 培养经提取纯化得到脂肪酶2.工艺计算3.主要设备的计算和选型4.绘制带控制点的工艺流程图2.原材料及产品的主要技术规格2.1培养基配方5%黄豆粉，3%米糠，0.2%的硫酸铵，0.5%豆油，0.1%磷酸二氢钾，0.05% 硫酸镁。22试剂与仪器221主要仪器蛋白质分子筛层析系统（电脑，电脑采集器WD-1A核酸蛋白检测仪WHD-3B HL-3恒流泵，BSZ-100A自动部分收集器），电泳仪-ECP300C及其他电泳装置，离 心机，玻璃板，恒温水浴锅（DK-98-1），透析袋，比色皿。2.2.2主要试剂硫酸铵，聚乙二醇20000,葡聚糖凝胶G-75,磷酸氢二钾， 磷酸二氢钾， Tris碱，
12、盐酸，甘氨酸，SDS甘油，B 一巯基乙醇，溴酚蓝，正丁醇，考马斯 亮G-250,乙醇，磷酸。2.3产品的主要技术规格生产规模：8吨/年生产方法：利用假丝酵母培养基培养经提取纯化得到脂肪酶生产天数：300天/年纯化周期：30h3.生产流程和测量方法3.1生产流程3.1.1离心提取粗酶液取细菌发酵液于4C, 8000rpm离心5min,去掉菌体，收集上清液，于4C冰箱放置备用3.1.2盐析法初提脂肪酶量取一定量经过离心提取的粗酶液， 用饱和硫酸铵溶液缓慢加入，边加入边 搅拌，于4C下冰箱放置6h，4C, lOOOOrpm,离心5min后，收集沉淀。3.1.3透析脱盐将经过硫酸铵分级沉淀收集到的沉淀
13、物用 pH7.2的Tris-HCI缓冲液溶解。按 照酶与缓冲液1: 20的体积比于4C下透析脱盐，中间更换缓冲液数次。3.1.4分子筛凝胶过滤层析法分离纯化脂肪酶将经过上述硫酸铵盐析得到的样品液用聚乙二醇 20000浓缩，将浓缩液作为 样品上样到SephadexG-75层析柱上，以pH7.2的0.05 mol/ L磷酸钾缓冲液洗脱， 控制流速，观察并收集洗脱液。3.1.5脂肪酶SDS-PAG电泳，电泳实验采用垂直不连续电泳方式，首先选取 15%的电泳分离胶，4%的电泳浓缩胶，灌胶后以水饱和正丁醇覆盖胶面。其次，将 Sephadex G-75层析收集得到的样品液与上样缓冲液等体积混合后于沸水中保
14、持 2min，8000rpm,离心5min，取2.5卩/L点入加样孔；于80V电压下电泳至示踪染料溴酚蓝进入分离胶后 改用120V电压电泳直到示踪染料溴酚蓝接近分离胶边缘后停止电泳。3.2测量方法3.2.1脂肪酶活性的测定lml细菌发酵液于40C、pH7.5条件下水解脂肪，每分钟产生l卩mol的脂肪酸， 即为一个脂肪酶活力单位，以U/ml表示。量取4%聚乙二醇（PVP）溶液150mL加50m瞰榄油（菜子油），用高速组织捣 碎机搅动6min（分两次搅拌，每次3min，中间休息5min），即成乳白色PVP-橄榄 油乳化液。取两个100m三角瓶，分别于空白瓶A(对照)和空白瓶B中，各加入底物溶液 4
15、m和0.025 mol / L的磷酸缓冲液5ml，再于A瓶中加入95%的乙醇15ml,两瓶同 时放入40C士0. 2C水浴中预热10分钟，在两瓶中各加入酶液lmL,立即混匀并 计时，在40C士O 2C水浴中准确反应15分钟，在B瓶中立即加入95%乙醇15mL 终止酶反应：于对照和样品溶液中各加入酚酞指示剂 3滴，用0.05 mol / L氢氧化钠溶液滴 定，直至微红色并保持约30秒不褪色为其终点，记录消耗0.05 mol / L氢氧化钠 溶液的体积。按如下公式计算：X=(B-A)*c*50* n)/(t*0.05)式中，x为样品的酶活力，单位是U/ mL B为滴定样品时消耗氢氧化钠标准 碱液的
16、体积，单位是mL A为滴定对照消耗的氢氧化钠标准碱液的体积，单位是 ml; c为氢氧化钠标准溶液的浓度，单位是 mol/L; 0.05为氢氧化钠标准溶液浓 度换算系数；50为0.05mol / L氢氧化钠溶液lmL相当于脂肪酸50卩mol; t为反应 时间，单位是分钟；n为稀释倍数。3.2.2考马斯染料结合分析法测定总蛋白质含量 (Bradford)标准曲线的绘制取6支具塞试管，按表3.1加入试剂(O-100卩/ mL的标准 蛋白)，混合均匀后，向各管中加入 5mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置 5min左右，用1cm光径比色皿在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横 坐标，以吸
17、光度为纵坐标绘制标准曲线。序号123456标准蛋白质/ml00.200.400.600.801.00蒸馏水量/ml1.000.800.600.400.200蛋白质含020406080100旦/ Z量/卩g蛋白质样品的测定吸取样品液I.OmL,放入具塞试管中(每个样品重复2次)，加入5mL考马斯 亮蓝G-250溶液，充分混合，放置反应 5min后，用1cm光径比色皿在595nm下 比色测定吸光度，通过标准曲线查询计算出蛋白质含量。4.相关溶液的配置4.1饱和硫酸铵溶液在800mL dH2冲加入1.21g Tris 碱，HCI调校正pH7.0,定容至1L,配制成0.01mol/L Tris C1溶
18、液；然后，准确称量767g硫酸铵，通过搅拌和稍微加热将 其溶解于1L 0.01mol/L Tris C仲，校正pH7.0,并于4C贮存备用。4.2Imol/ L Tris HCI 缓冲溶液准确称取121gTris碱容解于800mldH2冲，用浓HC调节pH至7.2，补水定容 至1L备用。使用时将其20倍稀释得到0.05 mol/L的Tris HCI使用缓冲溶液。4.3GF蛋白质分级分离缓冲液(0.05mol/ L pH7.2磷酸钾缓冲液)溶液 A: 27.2g 磷酸二氢钾(KH2P04)(O.2mol/L)溶液 B: 45.6g 磷酸氢二钾(K2HPO? 3H20)(O.2 mol /L)4.
19、4考马斯亮蓝G-250溶液准确称取100m考马斯亮蓝G-250,溶解于50mL9%乙醇中，加入100mL85%(W/V)的磷酸，再用dH20定容到IL ,贮存于棕色瓶中备用4.5相关缓冲液的配置4 X浓缩胶缓冲液(O.5mol/LTris-HCI , pH6.8)准确称取30.25g Tris碱溶解 于400mL dH2(中，6moI/L HCI调节pH至6.8，定容至1L，4C贮存备用。4X分离胶缓冲液(1.5mol/L Tris . HCl, pH8.8)准确称取90.75gTris碱溶解 于400mL dH2(中, 6mol/L HCl调节pH至8.8，定容至1L, 4C贮存备用。10x
20、电泳缓冲液准确称取30.0gTris碱、144.0g甘氨酸、10.0gSDS容解于 1LdH20中，调节pH值8.3,室温下保存，用前稀释成1 X电泳缓冲液。2xSDS-PAGE上样缓冲液 准确量取4 X浓缩胶缓冲液2.0mL、甘油1.6mL、 10% SDS 3.2mL B -巯基乙醇O. 8mL 1.0 %溴酚蓝0.4mL充分混合后4C贮存 备用。4.6水饱和正丁醇准确量取50m正丁醇与等体积dH20昆合振荡摇匀，室温下放置备用。5 实验结果讨论5.1粗酶液的制备细菌发酵液经离心收集上清液测定酶活得：其活力为14.8U/ml,蛋白质浓度为0.57mg/ml,比活力为25.97U/g,于4C
21、冰箱放置备用。5.2硫酸铵分级沉淀脂肪酶序号饱和硫酸 铵(ml)细菌发酵 液(ml)硫酸铵 饱和液(w/v， %)酶活力(U/ml)酶活得率(%)比活力(U/mg)纯化倍数152015.340.674.5225.870.992102025.572.0013.5149.631.913152032.874.0027.0388.693.424202038.357.3049.3277.422.985252042.613.6724.7927.411.066302046.022.6718.0417.580.68实验结果上表，盐析处理脂肪酶样品液的过程中，随着盐离子浓度的增加， 脂肪酶活力呈现先增后降的趋势
22、，当硫酸铵的饱和度达到 38.35 %时，脂肪酶的酶活力最高，其值为7.30U/ ml,此时纯化倍数为2.98,虽然比表中3.42值要小, 但酶活力的总回收率为49.32 %，远比27.03 %高得多。因此盐析沉淀分离脂肪酶 的最佳硫酸铵浓度为38.35 % (W/ V)。5.3Sephadex G-75分子筛柱层析分离纯化脂肪酶经过硫酸铵盐析、透析脱盐浓缩处理后所得脂肪酶液 (酶活力18.33U / ml), 蛋白质浓度1.96mg/ml),经Sephadex G-75分子筛凝胶层析；结果出现了两个明 显的峰，用不同的试管收集洗脱峰1和峰2分别得到4.9ml和13.6ml洗脱液：峰1收集液的
23、脂肪酶活力为l.67卩/ ml。蛋白质浓度为0.05mg/ml。峰2收集液没有脂肪酶活性；经过凝胶层析纯化，脂肪酶的回收率为22.32 %， 纯化倍数为3.57倍。5.4SDS-PAGE检测脂肪酶纯度将上述经过sephadex G-75柱层析后收集得到的脂肪酶溶液进行SDS-AG电 泳，结果表明，经过分子筛凝胶过滤层析法分离纯化处理后的脂肪酶样品液经 SDS-AG电泳只有单一的电泳条带，由此说明了所得样品达到了纯化效果。6.工艺计算因为工作日为300天，纯化周期为30h，所以可得共有240个周期，因此由 年产8吨可得每个周期应生产：8/240=33kg的脂肪酸，以下以一个周期计算为例。6.1物
24、料衡算6.2能量衡算7.其他通过这次课程设计，我们初步了解了做设计的一般要求，格式，内容和方法， 为将来的小设计乃至毕业设计积累了宝贵的经验。刚开始做课程设计时有点一头雾水，因为跟以前的化工原理课程设计不同， 这次没有老师教我们到底每一步该怎么做。 而是在拿到任务后，我们必须自己整 理思路，规划设计。老师能告诉我们的只是一些规范的格式，必须的作图技巧， 以及为我们在设计中遇到的困惑答疑解难。这着实让习惯了填鸭式教育的我们措 手不及，一下子不知道该从何下手。所幸经过几天的适应摸索，以及和同组同学 的相互讨论，我们渐渐理清思路，开始步入正确的轨道。设计的本质就是要解决问题，一个任务布置下来，我们要
25、做的就是调动一切 现有条件，使用各种工具来针对性地解决这个问题。 要成功完成设计，除了基本 的专业知识外更要有较好的文献研读能力，如何消化他人的研究成果从海量数据 中找到自己所需的内容，并结合具体问题正确使用非常重要。刚开始看化工设计 手册那两本大厚书时真是头疼，满满都是字根本不知道我们想找的内容在哪里， 在老师的指导下经过多次练习后才感觉有些上手。此外，要完成一项工作团队精 神不可或缺，一个人的知识能力有限，考虑问题自然是不全面的。大家凑在一起， 互补合作，及时发现错误，工作效率自然就高得多。最后通过这次的学习我也深刻认识到做设计是项精细的工作， 由于涉及到大 量计算，我们必须有极高的耐心和
26、专注力。 否则稍不留神哪里算错，便真是一失 足成千古恨要改动大量数据，烦不胜烦。我在期间就犯过不少错误，幸亏在跟同 学交流时及时发现未酿成大错。总之这次的课程设计对我们来说是次宝贵的历练， 既学到许多知识，又为今 后的课程打下基础。感谢老师的辛苦指导和同学们的互相帮助， 这些知识我在日 后的学习中将受用不尽。8.参考文献1国家医药管理局上海医药设计院编.化学工艺设计手册（第二版）（M .北京：化学工业出版社，19962沈自法，唐孝宣编.发酵工厂工艺设计（M）.上海：华东理工大学出版社，19943欧阳平凯.生物化工产品（M .北京：化学工业出版社，19994李良铸，李明华.最新生化药物制备技术（
27、M .北京：中国药科技术出版社，20015梁世中主编.生物工程设备（M .北京：中国轻工业出版社，2004 杨基和，蒋培华化工工程设计概论（M北京：中国石化出版社，20059.致谢此次课程设计的制定、实施、完成到撰写都是蔡志强老师的精心指导下完成的。整个课程设计过程中蔡老师给我们提供方法，答疑解难，纠正错误。短短的 两个星期，蔡老师给了我们很大帮助，值此课程设计完成之际我向老师表示深深 的谢意。同时还要感谢课程设计中帮助过我的同学们， 没有大家的相互帮助与讨论，我根本不可能顺利完成课程设计。通过这次的课程设计，我们不仅学到很多设计知识，锻炼了解决问题的能力， 使自己的视野更加开阔。怎样以最高的效率去完成一件事。这些都是在课本上 学不到的经验，对我来说相当宝贵。我想再一次对老师和同学们表示由衷的感谢！
