1、引物二聚体的形成什么是引物二聚体？怎样消除引物二聚体?是引物的3端间相互错配扩增形成的。引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们 的肉眼看不到而已。提高PCR严谨性(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。减少PCR产物中引物二聚体的方法:1从引物自身 着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法;2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量;3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可 降低它们的浓度;4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷
2、却，这时再加入反应体系当中，引 物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可 以增强特异性;6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的 引物合成为二聚体。7.增加循环数;8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度(根
3、据扩增片断长度 而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些);9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑 Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。10. 以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释1001000倍，如果间隔较长可以稀释50100倍。反应成分问题：可能的原因解决办法 引物3端互补 重新设计引物 引物长度过短 增大引物长度 引物浓度太高 降低引物浓度 模板浓度太低 提高模板浓度反应条件问题：可能的原因解决办法 退火温度不够优化 优
4、化退火温度 循环数太多 减少循环数如何区分引物二聚体与PCR产物（100kb）（1）PCR产物的电泳检测可能出现那些问题：一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要
5、配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位
6、协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：
7、变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物
8、为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性
9、扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因
10、往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。（2）。怎么鉴别引物二聚体和产物：1实时定量PCRPCR可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过对光密度扫描来进半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一特定基因在特定组织中的表达量。早期定量PCR技术需
11、要特别的训练，严格的测试和特别准确的加样。早期定量PCR技术的难点主要在于：如何确定PCR正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例），为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。所谓的实时荧光定量PCR，其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线（如图1）。一般而言，荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光
12、背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期 。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量 与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 ，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是
13、3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）（如图2所示）。定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。对某一样品的C（t）值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数（如图3所示）。因些只要获得未知样品的
14、CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。SYBR Green 荧光染料目前荧光实时定量 PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：内嵌染料（SYBR Green ）、双标记探针、FRET探针、分子信标和Ampliflor。其中SYBR Green 染料法不需要设计合成序列特异性探针和新的引物对，是一种简便，性价比较高的实时监测方法，常常被用于进行RNA表达相对定量以及DNA定量研究中。SYBR Green 是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green 的最大吸收波长约为497nm，发射波长
15、最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射强荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子仅有微弱荧光信号背景，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。此外，由于一个PCR产物可以与多个分子的染料结合，因此SYBR Green的检测灵敏度很高。但是，由于SYBR Green与
16、所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR Green Real-Time PCR定量结果。在PCR结束后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化绘出每个样品的熔解曲线。绘制熔解曲线时，Real-Time PCR 仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过和中荧光值的变化过程。不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不一样的温度下解链，当产物解链时，SYBR Green的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出荧光强
17、度随温度变化的负一次倒数图。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为熔解峰值。熔解曲线是扩增反应的质控途径，当图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。荧光定量PCR技术的应用实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定是量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们不定期可以对PCR产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体。以区分非特异扩增；利用特异
18、性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：1、 比较经过不处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等），及特定基因在不同相的表达差异。2、 比较正常组织与病理组织中各种mRNA 表达量差异。3、 验证基因芯片实验结果。4、 验证RNA干扰实验结果。2DXY上的建议：1可以用非变性PAGE胶电泳，应该能分开的，理论上说分辨率达到1个碱基。可以用非变性丙烯酰胺凝胶电泳进行分离鉴定NA在丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围:丙烯酰胺(W/V):12% 有效分离范围(bp
19、):40-20015% 25-150电压一般是1-8V/cm, 6个小时后银染即可分辨你的两个片段2可以用1.3%TAE的长胶，在30伏的电压下（中号电泳槽），跑16-20小时是应该可以分开的。3用2.5%的琼脂糖就能分开，我们实验室经常用它来分开相差28bp的片段，效果很好，看的很清楚，但有几点要注意，缓冲液要是新配的，电压100v跑10分钟，接着50v跑一个 半小时，到两个小时。4理论上用1.5或者2.5琼脂糖应该都可以分开，在电泳的时候电压不适宜太大，用40-50v跑上2小时左右应该就可以了。电压加大到80v或者100v的时候虽然节省实验时间，但是有时条带的效果看起来就不是很好。还有就是
20、似乎你的Marker选择的不好，即使电泳能够分开两条带，这个Marker也很难来说明你的目的条带和内参带的大小。5用聚丙烯酰胺跑垂直电泳。1。需要单独的垂直电泳槽，及配置聚丙烯酰胺凝胶。2，具体的做法可以到 生物谷 网站，有详细的说明。3，你可以用5%的琼脂糖跑一下。6建议你跑PCR的时候做个阴性对照，只加引物，电泳时看阴性对照引物二聚体的位置，以区分拟订目的片段71bp条带，或是电泳时直接加一空引物做对照1材料与方法11标本人单核细胞系U937，细胞密度2108/L，分对照组(N)、处理组(T1)、处理组(T 2)，N用1640培养基及10胎牛血清培养，T1用IFN-104U/L LPS 1
21、g/L、T2用IFN- 10 U/L LPS l0g/L分别刺激7 h。12主要试剂与仪器TRIzol试剂(GIBCO BRL)、Fluoro DD试剂盒(Genomyx)、Supersript 逆转录酶(GIBCO BRL)、AmpliTaq DNA聚合酶(GIBCO BRL)、RNase-free DNaseI(Promega);Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler(Perkin Elmer)13总RNA的制备按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA，以 RNase-free DNase I(终浓度80 000 U/L)除去其中污染的 D
22、NA，经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检 测其纯度14mRNA差异显示1.41逆转录反应选择锚定引物T7(dT12)AP(anchored prime rs，AP)，序列为5ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3，其中 MAGC NA /G/C/T，以总RNA为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNA l0g,AP 4 pmol ,70 5 min,加入50 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2,10mmol /L DTT,25mol/L，dNTPmix(1111)，SuperS
23、cript 60 Units，总反应体系20 l 。42 5 min，50 50 min，70 15 min。142荧光标记差异显示PCR 选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物TMR-T7(dT12)AP，随机引物(5ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3)，以逆转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系包括：20 mmol/L Tris-HCl(pH84) ，50 mmol/L KCl，375 mmol/L MgCl2，逆转录产物30 l，50 mol/L dNTP mi x(111)，035 mol/L 5-随机引物,035 mol/L 3-锚定引物,Amp
24、li Taq 0.5 U nits，总反应体系10 l。95 2 min。9415 s，50 30 s，72 2 min，4个循环； 94 15 s，60 30 s，72 2 min，25个循环；72延伸7 min。143分离差异显示片段配制56变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚02 5 mm，大小6133 cm。将PCR产物加40 l上样缓冲液，95变性后上样。3000V、100 W 、55电泳45 h。干胶后置于Genomyx SC扫描，用系统所带的AcquireSC program软件分 析处理扫描结果。144回收差异条带用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手 术刀片切割下所需条带，置
25、于30 l去离子水中，37水浴3060 min，备用。145差异条带的再扩增以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子 22-mer(5GTAATACGACTCACTATAGGGC3)、反M13(-48)24-mer(5AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3)为引物,进行再扩增反应：模板2.0 l,20 mmol/L Tris-HCl(pH84)，50 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2,20 molL dNTP mix(1111)，02 molL T7、0 2 mol/L M13-r，AmpliTaq 10 U nits，总反应体系20 l。反应条件同差异显示P
26、C R。2结果21总RNA的质量总RNA经Dnase I处理，用10甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28 S、18 S、5 S条带 ，且28 S18 S约为21(图1)，表明RNA完整性好，无降解现象。N、T1、T2的OD260OD28 0比值分别为192、183、198，表明样品纯度高。Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel22荧光标记mRNA差异显示结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比较见较多呈有无或强弱变 化的差异条带，图2中箭头所示。23差异条带再扩增取T2中约125Kb的条带再扩增，结果见图3。荧光标记
27、差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进，极 大减少了上述不足。差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定引物，将总mRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物 产生的第一条cDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差 示条带在序列胶上易于分辨，从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。DD专用的随机引 物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3-端以G或C结尾，可增加DD扩增的效率。通过改 变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等，差异片段的长度可达1015 kb(
28、图2)， 因较长的cDNA片段容易通过Northern blot进行分析鉴定辨别真假阳性克隆，且其中可提供 更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意义。文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致4。通常， 再扩 增的引物与DD引物相同，本试验将再扩增引物设计为T7(22-mer)与M13-r(24-mer)，此为 在锚定引物的5端和随机引物的3端分别增加的序列(本文方法中所列差异显示引物序列的 划线部分)，这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的 机会。同时，T7启动子序列可直接用于体外转录合成cRNA探针，为cDNA片段的直接测序和鉴 定(RPA或
29、Northern分析)提供了方便。用常规的序列分析胶进行分辨时,较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本 操作改用56的PAGE胶(聚丙烯酰胺)，减少胶的厚度(仅250 m)，通过提高电泳的电压( 3000 V)及温度(55),可显著提高分辨率。同位素标记存在曝光时间长、带型不佳，基本与相邻的带混合、污染等缺点，将荧光物 质标记于锚定引物的5端,可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期仅两天。目前，DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理5 、病理过程相关的未知表达基因的研究,相信对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要的 作用。军队“九五”医药卫生科研基金资
30、助课题(96M145)7（附）：凝胶电泳程序：凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种.一、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在 37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连 接等.(一)凝胶浓度凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定.琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.
31、20.961.50.2312.00.12(二)电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使 DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.10XTBE缓冲液的配制Tris硷，108克EDTA，9.3克硼酸，55克H2O至，1000ul(其PH应为8.08.2)临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释.(三)核酸电泳的指示剂与染色剂1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈
