1、基于QuEChERS前处理技术和弱阳离子交换色谱的牛奶和奶粉概要 2011年 7月 Vo. l 29N o . 7July 2011Chi n ese Journal of Chro m atography687690特别策划 :食品安全检测 研究论文DOI :10. 3724/SP. J . 1123. 2011. 00687*通讯联系人 :章飞芳 , 博士 , 主要研究方向为食品安全分析 . E m a i :l zhangff ecust . edu . cn .郭志谋 , 博士 , 主要研究方向为新型分离材料与分离技术 . E m ai:l guozh i m ou dicp . ac
2、 . cn . 基金项目 :国家科技支撑计划项目 (N o . 2009BADB 9B 02 和上海市科委重点基础研究项目 (No . 09JC 1403900 . 收稿日期 :2011 01 27基于 QuEChERS 前处理技术和弱阳离子交换色谱的牛奶和奶粉中三聚氰胺的快速检测方法魏 杰 1, 郭志谋2*, 沈爱金 2, 章飞芳1*, 梁鑫淼1, 2(1. 华东理工大学药学院 , 上海 200237; 2. 中国科学院大连化学物理研究所 , 辽宁 大连 116023摘要 :应用 QuEChERS 前处理技术 , 并 结合弱 阳离 子交 换色谱 , 建 立了牛 奶和 奶粉 中三聚 氰胺 的快
3、 速检 测方 法。 样品使用医用酒精 (乙醇含量 75% 和一种新型脂肪吸附 (LAS 材料超声振荡处理 , 在沉淀 (吸附 蛋白质和脂肪的同时提取三聚氰胺 , 然后经 8000r /min 离心 , 上清 液过膜 直接分 析。色谱分 析在弱 阳离子 交换色 谱柱 (WCX 上 进行 , 采用 2mm o l/LpH 为 3 8的磷酸二氢 钾水溶 液为流 动相 , 在 5m in 内 实现 分离分 析。结果 表明 , 该 方法在 0 0220m g /L内线性相关系数大于 0 9999。在 150mg /kg添 加浓 度范 围内 , 牛奶 的平均 回收 率为 98 9%105 2%, 相对标准
4、偏差 (RSD为 0 9%3 4%;奶粉的平均回收率为 86 4%102 9%, R SD 为 1 5%6 7%。本方 法的检出限为 0 05mg /kg(牛奶 和 0 1mg /kg(奶粉 。整个 分析检 测过程 没有使用 有毒有 害有机 溶剂 , 是一种 绿色的分析方法。关键词 :QuEC hERS 方法 ; 弱阳离子交换色谱 ; 快速分析 ; 三聚氰胺 ; 牛奶 ; 奶粉 中图分类号 :O 658 文献标识码 :A 文章编号 :1000 8713(2011 07 0687 04Rapid analysis ofm ela m ine in m ilk and m ilk powder u
5、singQuEChERS approach coupled w it h w eakcation exchange c hro m atographyW EI Jie 1, GUO Zhi m ou 2*, SHEN A ijin 2, ZHANG Feifang 1*, LI ANG X i n m iao1, 2(1. Schoo l of Pharm a cy, Ea st Ch ina Un iver sity o f Scie n ce an d T echno logy, Shan gha i 200237, China ; 2. Da lian I n stitu te of C
6、he m ica l Phy sics, Ch in ese Aca de m y of Scien ces, D a lian 116023, China A bstract :A s i m pl e , rapid m et hod for t he deter m i n ati o n of m ela m ine i n m ilk and m il k powderwas developed using QuEChERS approach coupl e d w ith weak cation exchange chro m at ography (WCX.The sam pl
7、e s were extracted and cl e aned up by m edici n al alcohol and lipi d adsorbent (LAS s i m ultaneous l y ,t hen centrifuged and filt ered f or hi g h perfor m ance liquid chro m at ographic (HPLCanal y sis . The separation w as perf or m ed on a W CX colu m n (150mm 4 6mm, 5 m w it h 2mm ol/LKH 2PO
8、 4(p H 3 8 as m obile phase . The flo w rate was 1 5m L /min and t he detection wave l e ngt h was 208n m. T he i n jecti o n volu m e was 20 L and t he colu m n tem perature w as 30 . Under t he opti m ized conditions , good li n earit y was obt a i n ed i n therange of 0 02-20m g /Lw it h a corre
9、lation coefficient (r 2of 0 9999. For sa m ples spiked w ith m e l a m ine standard i n the range of 1-50m g /kg, the average recoveries of standard in t he m ilk andm ilk powder were 98 9%-105 2%and 86 4%-102 9%,respectively . The relative stand ard deviations were 0 9%-3 4%and 1 5%-6 7%,respecti v
10、 el y . The li m its of detecti o n (LOD, S /N 3 were 0 05m g /kg(mil k and 0 1m g /kg(milk powder. The presentm ethod is green due t o not use of t he t oxic organic solvents .K ey w ords :QuEChERS ; w eak cati o n exchange chro m atography (WCX ; rapi d analys is ; m ela m ine ; m ilk ; m ilk po w
11、der色 谱 第 29卷三聚氰胺 (mela m ine 是一种三嗪类含氮杂环 有机化合物 , 因其相对较高的含氮量 (66 7% 被一 些不法商贩添加到乳制品中冒充蛋白质 , 人体长期 摄入三聚氰胺会 造成生殖、 泌尿系统损害 , 引起膀 胱、 肾部结石 , 并进一步诱发膀胱癌。因此 , 有必要 发展乳制品中三聚氰胺的快速检测方法 , 加强质量 监控。但是 , 乳制品中存在大量的蛋白质和脂肪等 复杂基质 , 检测中基质干扰严重 , 需发展有效的样品 前处理 (提取和净化 方法来检测三聚氰胺。目前 , 文献报道了多种三聚氰胺的前处理方法 1-8。主要 采用三氯乙酸、 三氯乙 酸 乙腈、 三 氯
12、乙酸 乙酸铅、 高氯酸、 乙腈 高 氯酸、 乙腈 水 、 甲醇 甲酸等作为提 取溶剂 , 然后提取液经过阳离子交换固相萃取柱净 化。这些前处理方法有效地提取和净化了样品 , 但 步骤繁琐、 耗时且使用 SPE 固相萃取柱净化增加了 样品前处理复杂程度和检测成本。部分文献报道样 品经溶剂提取后直接过膜分析 5, 7, 8, 但是样品可能 含有大量脂肪、 蛋白质等基质分子 , 直接分析基质干 扰较大 , 还可能对色谱柱寿命产生影响。另外 , 这些 前处理方法大都需要使用有毒有害试剂。另外 , 近 年来也有报道使用聚合物整体柱 9, 10进行奶制品中 三聚氰胺的样品前处理 , 也能达到很好的结果。
13、三聚氰胺是亲水性小分子 , 文献报道多用离子 对色谱 1, 2, 11, 12、 亲水作 用色谱 3-6, 13、 强阳 离子交 换色谱 7, 14进行分离分析。离子对色谱存在平衡时 间长、 重复性差、 色谱柱易损坏等缺点 , 影响方法的 重现性和灵敏度。而亲水作用色谱基质干扰较大 , 需使用大量乙腈 , 分析成本较高。强阳离子交换色 谱需较高浓度缓冲盐和一定浓度有机溶剂。QuEChERS 是 Lehotay 等 15于 2003年提出的 一种样品前处理方法 , 该方法包括基于分配机理的 样品提取和加入吸附剂的分散固相萃取两个步骤 , 操作简单 , 可高效、 快速地提取净化样品 , 主要用于
14、农药残留的提取净化。本文采用 QuEChERS 样品 前处理方法进行牛奶和奶粉样品前处理 , 使用医用 酒精结合一 种商品 化脂肪吸 附 (Lipi d Adsorbent , LAS 材料来提取三聚氰胺 , 同时沉淀 (吸附 蛋白质 和脂肪等基质实现样品的净化 , 所得上清液采用弱 阳离子交换 (WCX 色谱柱进行分离分析 , 为三聚氰 胺的快速检测提供一种新方法。1 实验部分1. 1 仪器与试剂W aters 2695高 效液 相 色 谱仪 , 配 有 W aters 色谱 柱 (大连 思 谱精 工 有限 公 司 , 150mm 4 6 mm, 5 m ; SORVALL 离 心 机 (美
15、 国 T her m o F isher Sci e ntific 公司 ; M illi Q 纯水 系 统 (美 国 M illipore 公司 ; KQ 5200DE 超声仪 (江 苏昆 山超 声仪器有限公司 。三聚氰胺 (分析纯 , 天津市光 复精细化工研究 所 ; 医用酒精 (乙醇含量 75%,盘 锦天源药业有限 公司 ; LAS 材料 (粒径 60 m, 大连思谱精工有限 公司 ; 磷酸二氢钾 (纯度 99 0%,Si g m a A ldrich 公司 ; 磷酸 (含量 85%,美国 TED I A 公司 。 1. 2 标准溶液配制准确称取 25m g 三聚氰胺标准品 , 用水溶解
16、并 定容至 25mL , 配制成 1g /L的三聚氰胺标准储备 液 , 放置于 4 冰箱中避光保存。用 H 3PO 4/医 用酒精 (0 01/100, v/v逐级稀释 三聚氰胺储备液 , 配制成 0 02、 0 1、 0 2、 0 5、 2、 5和 20m g/L的标准溶液。1. 3 样品前处理准确称取奶粉 0 5g 或液态奶 1 0g(精确到 0 01g 置于 10mL 离心管中 (奶粉中加入 1mL 去 离子水混匀溶解 , 用 H 3PO 4/医用酒精 (0 01/100, v /v定容至 5mL , 混匀。然后取 1g LAS 材料加入 上述样品中 , 混匀 , 超声 1m i n ,
17、 于 8000r /min 离心 2m i n , 取上清液过 0 22 m 微孔滤膜 , 直接进行液 相分析。1. 4 色谱条件色 谱 柱 采 用 W CX 色 谱 柱 (150mm 4 6 mm , 柱温 30 ; 流动相采用 2mm ol/LKH 2PO 4 (用磷酸调节 pH 为 3 8; 流速 :1 5m L/min ; 进样 体积 :20 L ; 分析时间 :5m in ; 二极管阵列检测器波 长扫描范围为 200400n m, 以保留时间和三聚氰 胺的紫外光谱图定性 , 外标法定量。2 结果与讨论2. 1 提取净化条件的选择和优化牛奶和奶粉的基质成分复杂 , 含有大量蛋白质 和脂
18、肪 , 有效的样品前处理是检测三聚氰胺的关键 步骤。如前所述 , 现有前处理方法大都存在步骤繁 琐、 耗时等缺点 ; 一些快 速方法 , 如国家标准 GB /T 22400 2008, 使用乙腈提取会引起部分脂肪类物质 溶解 , 对检测产生较大干扰 ; 另一方面 , 提取过程使 用有毒有机溶剂 , 对人员和环境存在不利影响。三 聚氰胺是强极性亲水小分子 , 牛奶中的蛋白质和脂 肪等基质多为疏水性物质 , 两者在性质上存在较大 LAS688第 7期魏 杰 , 等 :基于 QuEChERS 前处理技术和弱阳离子交换色谱的牛奶和奶粉中三聚氰胺的快速检测方法 脂肪有很强的吸附能力 , 可在高有机相 (
19、75%乙醇 浓度下吸附蛋白质和脂肪 , 并且辅助蛋白质和脂肪 沉淀。同时对亲水性的三聚氰胺不产生吸附 , 实现 三聚氰胺与基质的分离 , 达到净化样品的目的。另 外 , 医用酒精也可沉淀一部分蛋白质分子 , 进一步净 化样品。因此 , 选用 医用酒 精 (乙 醇含 量 75% 和 LAS 材料提取三聚氰胺能够同时沉淀 (吸 附 蛋白 质和脂肪 , 直接获得澄清透明溶液 , 所得样品过膜直 接分析 , 具有基质干扰小 , 环境友好的优点。 对照实验结果显示 , 只用医用酒精处理 , 不加入 LAS 材料 , 样品经离心后得不到澄清溶液 , 无法直接 进行分析 , 证实加入 LAS 材料有助于沉淀
20、 (吸附 脂 肪、 蛋 白质等 基质 , 降低 基质干 扰 , 实现直 接检测 (见图 1。 图 1 (a牛奶样品 、 (b只加入医用酒精离心处理的样品和 (c 加入医用酒精和 LAS 材料离心处理的样品F i g . 1 (a M il k sa m ple , (b m il k sa m ple treated w ithm edic i nal alcohol and (c m il k sa m p le treated w ith m ed ici na l alcohol and LAS m aterial2. 2 色谱条件的选择 三聚氰胺为极性小分子 , 在反相色谱分析中需 加
21、入离子对试剂 , 存在平衡时间长、 重复性差、 色谱 柱寿命短等缺点 , 影响方法的重现性和灵敏度。由 于三 聚氰 胺 显 碱 性 , 可 用 离 子 色 谱 分 析。 GB /T22400 2008采用强阳 离子交换 (SCX 色 谱进行三 聚氰胺的分离分析。 SCX 对三聚氰胺保留较强 , 需 使用较高浓度的缓冲盐和一定浓度的有机溶剂。弱 阳离子交换 (WCX 色谱在低 p H 下离子交换容量 较小 , 使用低浓度缓冲盐 (2mm ol/LKH 2PO 4, pH 3 8 即可实现三聚氰胺的洗脱和分离。另外 , 一些 小分子酸、 亲脂性物质等基质保留很弱或不保留 , 不 会对三聚氰胺的检测
22、产生干扰 , 纯水相条件下可在 5m in 内实现基 质干扰物 与三聚氰 胺的快 速分离 (见图 2 。在实际操作中 , 可将医用酒精和 LAS 材 料提前分装好 , 超声、 离心操作均可批量处理 , 分摊时间 , 1m i n 完成一个样品的前处理 , 67m in 完成一个样品的检测工作。图 2 (a 2m g /L三聚氰胺标准溶液 、 (b 添加 10m g/kg三聚氰 胺的 牛奶 样品 和 (c 空 白牛 奶样品的色谱图F ig . 2 Chro m atogra m s of (aa 2m g/Lm ela m i nesolution, (b a m il k sa mp le s
23、piked w ith 10m g /kgm ela m i ne and (c a blank m il k sa m ple三聚氰胺在紫外光区有两个特征吸收 , 分别为 208n m 和 236n m 。文献报道三聚氰胺的分析大都 选用 240n m 作为检测波长 , 其原 因是所选用的流 动相体系和样品基质在三 聚氰胺最大吸收 波长处 (208nm 干扰较大。本方法前处理得到的样品纯 净 , 且使用低浓度磷酸盐做流动相 , 在低波长下干扰小 , 故选用 208n m 作为检测波长 , 提高检测灵敏度(见图 3 。图 3 三聚氰胺 (20m g/L 在 (a 208nm 和(b240n m
24、 的色谱图F ig . 3 Chro m atogra m s of m ela m i n e (20m g /L at(a208nm and (b 240n m2. 3 线性范围和检出限将 1 2节中配制的不同质 量浓度 (0 02、 0 1、0 2、 0 5、 2、 5、 20m g /L的标准溶液重复分析 3次 , 用所得到的峰面积平均值为纵坐标 , 三聚氰胺的质 量浓度 (mg /L为横坐 标建立回归曲线 , 结 果表明 三聚氰胺在 0 0220m g /L内线性关系良好 , 相关 r 2为 回 归 方 程 y 203-689色 谱 第 29卷2912 1。在空白牛奶和奶粉基质中添加
25、三聚氰胺 , 按信 噪比 (S /N 大 于 3计算 , 本 方法 的检 出限分 别为 0 05m g /kg(牛奶 和 0 1m g /kg(奶粉 。 2. 4 回收率和精密度在空白奶粉基质中添加 2、 5、 10、 30、 50m g/kg5个 浓 度 水 平 , 牛 奶 基 质 中 添 加 1、 5、 10、 30、 50m g /kg5个浓度水平的三聚氰胺进行加标回收率测 定 , 每个浓度平行测定 5次 , 用回归方程计算加标回 收率和相对标准偏差 (RSD 。如表 1所示 , 牛奶中 三聚 氰 胺 的 回 收率 为 98 9%105 2%,RSD 为 0 9%3 4%;奶粉中三聚氰胺
26、的回收率为 86 4%102 9%,RSD 为 1 5%6 7%。2. 5 实际样品分析使用本方法对市场上随机抽取的一种牛奶和一 种奶粉样品进行检测 , 结果见图 4, 在两个样品中均 没有检到三聚氰胺。表 1 奶粉和牛奶基质中三聚氰胺的添加回收率和精密度 (n =5Tab l e 1 R ecoveries and prec isions of m el a m i n e inm il k and m il k po w der sa m ples (n =5M il kAdded /(mg /kgRecov er y /%RS D /%M il k po w de rAdded /(mg
27、 /kgRecover y /%RSD /%1105. 23. 4290. 06. 75100. 83. 4586. 45. 01099. 72. 21090. 65. 83098. 90. 930100. 32. 55099. 91. 850102. 91.5 图 4 (a 1 牛奶实际样品 、 (a2 空白牛奶加标样品 、 (b 1 奶粉实际样品和 (b 2 空白奶粉加标样品的色谱图 (加标量均为 10m g /kgF ig . 4 Chro m atogra m s of (a1 a realm il k sa mp le , (a2 a b l ank m il k sa m ple
28、sp i k ed w ith 10m g /kgm ela m ine ,(b1 a realm il k pow der sa m ple and (b 2 a blank m il k po w der sa m ple spi k ed w ith 10m g /kgm ela m ine3 结论本文应用 Q uEChERS 方法对牛奶和奶粉中的 三聚氰胺进行了提取净化 , 并用快速弱阳离子交换 色谱进行三聚氰胺的分析 , 大大提高了牛奶和奶粉 中三聚氰胺的检测效率。与传统方法相比 , 灵敏度、精密度和回收率均较高 , 且不使用有害有机溶剂 , 环 境友好。本方法为牛奶和奶粉中三聚氰胺
29、的快速检 测提供了简便的样品前处理方法和检测手段。 参考文献 :1 He Q S , Li u M F , Huang L Y, e t a. l Chi nese Jour nal ofChro m atography (何 乔 桑 , 刘 敏 芳 , 黄 丽 英 , 等 . 色 谱 , 2008, 26(6:7522 Xuan D L , Zhu Z H. Chi nese Journa l of Hea lth Labora toryTechnol ogy (宣 栋樑 , 朱震 海 . 中国卫 生检验 杂志 , 2010, 20(5:10073 W ang L , P ang J J ,
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