1、基因工程的技术操作陶正 基因工程操作技术（调整）1. 为什么要学习基因工程技术操作？1） 只有在实验室才能真正学会和掌握基因工程的重要概念和相关原理。2） 只有在实验室才能真正增长知识和才干。3） 只有亲手做过的实验才能记忆犹新。2. 珍惜实验课的体会：1)基因工程实验的开设来之不易。2)实验课上的学习内容将为你今后的科学生涯打下宝贵的基础。3. 实验室常见的仪器设备及用途：1)纯水仪：用途：制纯水 注意事项：防止爆炸，防止发水。2)天平：托盘天平（配平实用） 电子天平（0.01、0.001、0.0001）3)磁力搅拌器（具有加热功能） 4）酸度计用途：配置药品 调PH值注意事项：防止腐蚀 保
2、护电极4)高压灭菌锅（手动、半自动、全自动）用途：灭菌。注意事项：使用前检查锅内水是否充足 使用前设定好灭菌的温度、压力和时间打开和关闭灭菌锅是注意同时旋转对称的螺旋至少待灭菌无稍微冷却后方可去除5)超低温冰箱（-80。C） 7）普通冰箱（-20。C）用途：用于贮藏药品、材料等。注意事项：确保冰箱门关严 防止冻伤6)超净工作台： 用途：用于植物组织培养、微生物接种。 注意事项：确保使用状态时紫外灯必须关闭 保持清洁 不要用酒精擦拭有机玻璃挡板7)恒温培养箱： 用途：用于液体培养基中对细菌的培养 注意事项：使用前调好温度计转速8)高速冷冻离心机（台式、立式） 用途：用于DNA、RNA等提取过程中
3、的高速冷冻离心 注意事项：使用前要预冷，调好温度转速等 必须调平 使用后要关电源，擦拭干净（离心机内部的水珠）9)PCR仪： 用途：用于基因扩增 注意事项：使用前设好程序 使用后关闭电源10)移液器：（0.21000l） 用途：用于微量液体的移取 注意事项：使用前必须看清楚量程，并在量程范围内使用。 使用时要缓慢用力 切记避免有机溶剂腐蚀枪杆 使用后调至最大量程11)微波炉： 用途：融化琼脂糖凝胶，或琼脂粉 注意事项：注意微波时间 避免污染物污染12)凝胶电泳装置： 用途：用于核的电泳的检测 注意事项：使用前要注意电泳的方向与电泳槽的正负极是否吻合，设定拟使用的电压，电流等。 使用时要戴PE手
4、套，并注意不要产生大量的污染物。13)UV投射仪及凝胶成像系统： 用途：用于核算条带的观察及照相 注意事项：不要造成EB污染 使用时要先开电源，再开紫外，关闭是相反。 使用后将凝胶几时拿走放回收处，并使仪器内部保持清洁。14)烘箱： 用途：用于烘干器皿 注意事项：防止器皿水分过多，造成短路。 塑料凳器皿切记不要高温烘烤 玻璃器皿等高温烘烤后，注意及时断电，千万不能过夜。15)分子杂交炉： 用途：用于Southern、Northern等分子杂交。 注意事项：正确设定杂交温度，时间等。 防止同位素遗漏，污染。16)恒温培养箱、培养室： 用途：生物材料的培养 注意事项：正确设定培养温度、湿度、光照时
5、间等培养条件。 防止培养箱，培养是污染。 注意温度的调节。17)制冰机： 用途：制碎冰。 注意事项：使用时先接通水源。 使用后要关闭水源。18)蛋白质、核算分析仪： 用途：测定核算及菌液的浓度。 注意事项：使用时要先预热。 使用前要调零。 要调好光源。19)测序仪： 用途：对核算进行测序。 注意事项：防止污染、按程序操作。20)基因枪： 用途：用于转基因。 注意事项：无菌操作，保持清洁。 使用时检查是否漏气。21)其他：恒温水浴锅、研钵研杵、液氮罐、电炉子、通风橱、涡旋器、同位素室及暗室。4. 常见的有害化学物质：A 苯酚、氯仿、异戊醇。B 溴化乙锭（EB）。C 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB
6、）。D 焦乙酸二乙脂（DEPC）.E 放射性元素32P、35S5. 安全规程：1)熟悉所有有害物质的标识。2)在不知道正确操作程序时不要使用实验室的药品及仪器。3)不要认为扩大污染源，或随意丢弃污染垃圾。4)如果不小心将有害物质弄到皮肤或衣服上，马上采取有效措施处理。5)严禁在实验室吸烟、饮食、以免误事和吸入有害物质。6)不要穿拖鞋进实验室。实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备一：实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的方法和技术。二：实验原理：感受态细胞是经物理化学方法增强获取DNA能力的细菌细胞，其 原理是处于0。C的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀呈球形，此 时，细菌处于容易吸收外源DNA的状态
7、。三：实验仪器及药品：1.仪器：制冰机、恒温摇床、天平、酸度计2.材料：大肠杆菌DH5，10ml离心管，1.5ml离心管3.试剂：0.1mol/lCaCl2溶液，80%甘油，LB液体培养基（1L），pH7.0-7.3 胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。四：实验内容：1.用划线法将大肠杆菌DH5接种于无抗性固体培养基上，与37。C倒置培 养1-2天。2.从菌落上挑取一个单菌落接至3ml液体培养基中，37。C振荡培养过夜。3.取0.5ml菌液转到一个装有50mlLB液体培养基的锥形瓶中，37。C振荡培 养2-3h4.将菌液转移至10ml离心管中，冰上放置10min。5.4。C离心10
8、min（4000r/min）回收细胞。6.倒出上清液，将管倒置1min，以便培养液洗尽。7.用冰冷的2ml0.1mol/lCaCl2溶液悬浮细胞沉淀，立即放在冰上保温30min.8.4。C离心10min（4000r/min）回收细胞。（其上清）9.用冰冷的0.1mol/lCaCl20.4ml悬浮细胞（务必放在冰上）10.分装细胞：200l/份，加30l无菌甘油，混匀置-80。C冰箱中保存， 此细胞即为感受态细胞。思考题：1.感受态细胞制备过程中的注意事项？ 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪 头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意 防止被其它试剂
9、、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或 杂DNA的转入。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞 转化率将会降低。 2.Ca2+感受态细胞中的作用？ 促进大肠杆菌转化。实验二 质粒DNA转化大肠杆菌实验目的：掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法技术。实验原理：转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程，其原 理是细菌处于0。CCaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀呈球形，转化混 合物的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物贴附于表面，经42。C 短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物，将细菌放置在培养基中保温 一段时间，促使在转化过程中获得新表型得到表达，然后将细菌培养
10、 物涂在含有Amp的选择培养基中。实验仪器：超净工作台、恒温摇床、制冰机、恒温箱、-70。C冰箱、水浴锅实验材料：大肠杆菌DH5，PUC1g质粒，离心管实验试剂：LB固体培养基20mg/ml X-gal40l 200mg/mlPTG40l实验内容：1.取200l新配的感受态细胞加入DNA 2l混匀，冰浴30min，同 时用PUC1g做两个对照： 受体对照：200l感受态细胞+2l无菌水 质粒对照：200l感受态细胞0.1MCaCl2溶液+2l质粒DNA 2.将管放在42。C冰浴中90s。 3.冰浴2min。 4.每管加800l液体培养基，培养45min 5.加4lIPTG和40lX-gal混匀
11、。 6.将混合液移至含有Amp（50mg/ml）的培养皿中，再用无菌涂布棒 将菌液均匀涂满平板。 7.将适当体积（100l）转化的感受态细胞涂在备好的培养基上。 8.倒置平皿37。C培养12-16h，出现菌落。实验结果：含抗生素不含抗生素结果分析受体对照组DNA对照组转化实验组转化数：=菌落数*稀释倍数*转化反应原液体积/涂菌板体积思考题：如何提高转化率？ 1）载体DNA及重组DNA 2)受体细胞 3）转化操作 4）试剂纯度与器皿的洁净度 实验三大肠杆菌质粒DNA的提取实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA。实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA在拓扑学上
12、的差异来 分离它们，在pH值介于12.0-12.5这个窄小的范围，线性的DNA双 螺旋结构解开而被断裂，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的 氢键会被断裂，但现在两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密的结合在 一起，当加入pH4.8的乙酸甲高盐缓冲液回复pH至中性时，共价闭合 环状的质粒DNA两条互补链仍保持在一起，因此，复兴迅速而准确， 而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会迅速 而准确，它们缠绕成网状结构，通过离心，是染色体DNA与不稳定的 大分子RNA，Pr-SDS复合物等一起沉淀下来被除去。仪器材料与试剂：（1）：仪器：恒温摇床等。（2）：材料：葡萄糖，Tris、ED
13、TA、SDS 等（3）：试剂：1.溶液：50mmol/l葡萄糖、25mmol/l三羟基氨基甲烷TrisHCL 10mmol/l乙二胺四乙酸EDTA （去除细胞壁，保护DNA ） 2.溶液:0.4mol/lNaOH(10ml) 2%SDS(10ml)用前等体积混合 (破坏细胞膜，使DNA变性) 3.溶液:5mol/l乙酸甲（60ml） 冰乙酸（11.5ml）水（28.5ml） （使溶液恢复中性，使质粒DNA复性） 4.TE缓冲液（10ml）：10mmol/lTrisHCL 1mmol/lEDTA ddH2O(灭) 5.70%乙醇，放-20。C冰箱中用后即放回。 6.胰RNA酶。 7.凝胶加样缓冲
14、液：40%蔗糖，0.25%溴酚蓝。 8.氯仿/异戊醇按24:1的体积进行配制。实验步骤：1.将2l含相应抗生素（50g/ml）的LB培养基加入到试管中，接 入上述含质粒的大肠杆菌，37。C振荡培养液。 2.取1.5ml培养物倒入微量离心管中4000r/min离心2min。 3.吸取培养液使细胞沉淀，尽可能干燥。 4.细胞沉淀悬浮于100l溶液中，充分混匀，室温放置10min。 5.加200l溶液盖紧管盖，混匀内容物，将离心管放在冰上5min。 6.加入150l溶液（冰上预冷），盖紧管盖，颠倒数次，是指混 匀，冰上放置15min。 7.12000r/min离心5min，将上清液转移至另一离心管中
15、。 8.向上清中加入等体积氯仿/异戊醇。反复混匀，12000r/min离心 5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上吸干液体。 9.向上请中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，-20。C放置15-20min， 12000r/min离心5min，倒上清液，把离心管倒放在吸水纸上吸干 液体。 10.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀振荡并离心倒去上清液，真空抽 干或空气中干燥。 11.加入20lTE缓冲液，其中含有20g/ml的胰蛋白酶时DNA完全 溶解-20。C保存。操作要点：1.溶液必须新鲜配制，最好使用一次，将剩余的液体弃掉。 2.加入溶液时，要把液体充分混匀，并在冰上孵育足够的时间， 使沉
16、淀完全，如果为充分将细菌裂解物与溶液混匀，将会影响 质粒DNA纯度。实验结果：大肠杆菌质粒DNA提取的质量好坏需通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。思考题：1.为什么溶液要现用现配？ 放置空气中的二氧化碳进入到氢氧化钠中，使氢氧化钠变性，降低溶液 的PH，增加了破碎细胞膜的难度。 2.为什么加完溶液要冰上放置？ 防止DNA变性。实验现象：加溶液：沉淀溶解，溶液浑浊 加溶液：溶液稍澄清 加溶液：白色絮状物生成 加氯仿/异戊醇：（去除蛋白质）溶液分层无水乙醇作用：沉淀DNA.70%乙醇作用：洗涤沉淀表面的异戊醇等杂质实验四PCR基因扩增实验目的：通过本次实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理：聚
17、合酶链反应（PCR）的原理类似于天然复制过程，在待扩增的DNA 片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物经变性、退火、延伸、 若干个循环后，DNA扩增2n倍。 1.变性：加热使模板DNA在高温（94。C）下变性，双链间的氢键断裂 而形成两条单链，即为变性。 2.退火：使溶液温度降至50-60。C，模板DNA引物按碱基互补配对原 则互不结合，即退火阶段。 3.延伸：溶液反应温度升至42。C，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模 板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸 （dNTP）按5，-3，方向复制出互补的DNA，即引物的延伸阶段。 上诉3步为1个循环，即高温变性，低温退火，中温退
18、火3个阶段， 从理论上讲每经过1个循环，样品中的DNA量应增加1倍，新形成的 链又可称为下一个循环的模板，经过25-30个循环后，DNA可扩增 106-109倍。 典型PCR反应体系由以下部分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、 Mg2+人工合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶实验仪器：材料与试剂 （一）仪器：PCR热循环仪。 （二）材料：DNA模板、4种dNTP、引物、Taq酶、DNA相对分子 量标准物。 （三）10%缓冲液、4种dNTP、Taq酶、DNA模板、 引物：5，-ATGGGCGTCTCTGCTGTT-3， 引物：5，-GCTAAGCAAAACACTCCGCCC-3，实验步骤：1
19、.在0.2ml Eppendorf管内配制25l反应体系 反应物 体积/l ddH2O 17 10*PCR缓冲液 2.5 2.5mmol/ldNTP 2.2 引物 1.0 引物 1.0 Taq酶 0.3 2.按下述程序进行扩增： 94。C预变性 5min 94 。C变性 55s 57 。C退火 55s 72。C延伸 1min20s 重复- 30次 72。C后延伸 8min注意事项：换柜头、试剂打入液面下、PCR仪的使用。1.引物的设计原则： 引物的长度为15-30bp 引物GC含量：40%-60% 引物自身不能发生互补 引物特异性由3，端决定 （3，端最后的碱基为T 5，端决定引物扩增的长度）
20、2.10*PCR缓冲液中的TrisHCl的作用：维持溶液的碱性环境。 10*PCR缓冲液中的KCL的作用：有利于引物的退火，浓度不宜过高，过高会 影响Taq酶的活性。 10*PCR缓冲液中的Mg2+的作用：Taq的辅酶，浓度过高会影响PCR反应的特异 性，浓度过低会影响Taq的活性，使反应量减小。3.dNTP中4种脱氧核苷酸要等浓度。4.模板的种类：基因组DNA、质粒DNA、RNA反转录的cDNA。5.PCR的反应体系：25l、50l、100l。6.酶单位：5个单位/l。7.预变性的作用：使双链充分打开。8.后延伸的作用：确保DNA链完全延伸。实验五琼脂糖凝胶电泳检测实验目的：通过本次实验学习
21、琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子 在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，由于 糖-磷酸骨架在结构上的重复性质相同数量的双链DNA几乎具有等 量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动，在一定的 电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本 身的大小和构型具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不同， 可进行分离DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关 系，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对 分子质量相同，但构型不同的DNA分子。仪器：材料
22、与试剂 （一）仪器：琼脂糖电泳系统、紫外线投射仪 （二）材料：Tris、硼酸、EDTA、核酸染料、上样缓冲液 （三）10*TBE 10*TBE Tris:108g EDTA:7.44g 硼酸：55g。实验步骤：（一）制胶：称取0.8g琼脂糖放入三角瓶中，加入80ml0.5*TBE缓冲 液置于电炉上加热，至完全融化，待60。C加入核酸染料混匀。 （二）胶板制备：1.将制胶器放入制胶槽中，并放好样品梳子。 2.将冷却至60。C的琼脂糖凝胶液缓缓倒入大板中，直至形成一层均 匀的胶面（不要形成气泡）。3.待胶凝后，取出梳子，将大阪放在电 泳槽内。4.加入缓冲液至电泳槽中。 （三）加样：用移液枪将2l上
23、样缓冲液和10lPCR产物质粒混匀， 加入加样孔。 （四）电泳：1.接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA的迁移速度与电压 成正比，最高电压不超过5V/cm。2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前 沿1-2cm处停止电泳。 （五）观察：将凝胶取出，放入紫外线投射仪中，观察条带。1.核酸染料是溴化乙锭的代替物，其作用是改变碱基间的距离。2.加核酸染料的凝胶在紫外下为荧光绿色。3.DNA在凝胶过程中有3中形式：超螺旋结构、开环结构、线性结构 凝胶后3中结构距胶口由近及远的顺序分别是：开环结构、线性结构、超螺旋 结构。4.上样缓冲液中40%蔗糖的作用：沉淀DNA，使要上的样更好地进入点样口。5.上样缓冲液中25%
24、溴酚蓝的作用：指示剂。6.上样缓冲液：上的样品=1:57.电泳的电压要求：5V/cm。实验六质粒载体的限制酶消化及电泳检测实验目的：学习质粒载体的限制酶切及电泳检测的方法。实验原理：酶切包括单酶切和双酶切，单酶切操作比较简单，只需要将限制酶最 适的缓冲液、目的DNA和相应限制酶混合，用灭菌的ddH2O补足体 积，在37。C孵育1-3h即可，但是对于双酶切特别是两种酶所用的 缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不一致，采用 以下措施解决： 1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另一种酶切。 2）先进行低盐要求的酶切热失活酶后添加盐离子浓度到高盐的酶反应 要求，加入第二种酶
25、进行酶切。 3）使用通用缓冲液进行双酶切。实验材料：1. 材料：质粒DNA：pUC19 2. 试剂：限制酶、ddH2O 、10*HBuffer、DNA Marker、10*Loading Buffer 、核酸染料 3. 仪器：微量移液枪、离心机、恒温孵育器、电泳仪、紫外投射观 测仪。实验步骤：1. 在一灭菌的1.5ml离心管中依次加入质粒DNA2l（约2g） ddH2O 15l，10*缓冲液2l，限制酶至总体积20l。 2. 混匀，稍离心。 3. 37。C孵育1-3h。 4. 70。C孵育10min终止酶切反应。 5. 电泳，检测酶切效果。思考题：1. 假设一种限制酶在重组质粒上有两个酶切位点
26、，酶切后的电泳显示 有3条带，分析可能的原因，并采取何种措施解决？ 1)酶反应浓度较低，不足以切开两个酶切位点，仅切开一个酶切位点 或为切开，所以出现3条带。 2）酶反应时间不够，不完全。 解决措施：增大酶的浓度，延长酶反应时间。 2. 影响酶切反应的因素？ 酶的影响、pH值的影响、温度的影响、DNA样品纯度及用量 选择填空：1. 基于构造的分离质粒DNA的制备方法：1）碱变性法 2）溴乙锭-氯化铯密度梯度离心 3）质粒扩增。2. E.coil质粒DNA提取时用的溶液的组成：1）mol/l乙酸甲（60ml）2）冰乙酸（11.5ml）3）水（28.5ml）其中乙酸甲的作用是：恢复pH至中性，使D
27、NA复性。3. TE缓冲液的作用是：回溶DNA并长期保存。 TE缓冲液成分：1）10mmol/l Tris.HCL：10ml。2）1mmol/lEDTA：2l 3）DD水：988l。4. 胰RNA酶的作用：提纯质粒，除去离心后上清液的RNA。5. 苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。其中苯酚和氯仿的作用是：使蛋白质变性，除去离心后上清液中多余的蛋白质和胰RNA酶。异戊醇的作用是：使溶液分三层，防止液相交界面的杂质，易于后期分离。6. 10*Loading Buffer（加样缓冲液）的成分：蔗糖、溴酚蓝10*Loading Buffer的作用：1）前沿指示剂 2）增加比重，浓缩DNA，使点样后的
28、DNA能够沉于电极缓冲液液面下。7. 10*HBurffer(酶缓冲液)的成分有：1）Tris。HCL:PH7.4 2）Nacl 3)Mg2+ 4）DTT（二硫苏糖醇）：其中二硫苏糖醇的作用是：还原剂，保持酶活性。8. 酶切反应的终止方式有：1）70。C孵育10-15min 2）加入EDTA 3）加入苯酚。9. 根据10*HBurffer(酶缓冲液)中NaCl的浓度可以将酶分为 1）低盐酶（0-50mmol/l） 2）中盐酶（50-100mmol/l）3）高盐酶（100-150mmol/l）10. 酶的星号活性：在不是酶的最适条件下进行酶切，可能会导致酶的特异性降低，以至于一种酶可识别和切割更
29、多的位点。以大肠杆菌EcoR为例：正常的识别是5，-GAATTC-3，星号活性下EcoR的识别位点是：5，-NAATTN-3，。11. 回文结构：是指从DNA双链来说，在各自的方向上的阅读结果都相同。限制性核酸内酶切识别4-8个核酸回文结构。12. PCR反应变性、退火、延伸各段所持续的时间主要是由DNA的长度来决定的。引物的设计是PCR反应的关键步骤。13. PCR反应引物是指位于待扩增的DNA两端互补的寡核苷酸序列。PCR反应模板是待增的序列，可以是质粒DNA，基因组DNA、cDNA。14. 大肠杆菌质粒DNA提取时用的溶液加入时，要把液体充分混合并置于冰上孵育足够的时间，使沉淀完全，如果
30、为充分将细菌裂解物与溶液混匀，将会影响质粒DNA的纯度。15. DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳可以分离不同分子质量的DNA，相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。16. 琼脂糖凝胶范围100bp-60kb。EB是橘红色光、Gelview是绿色光。17. 大肠杆菌感受态细胞的制备始终要置于0。C下操作，从-80。C中取出来的大肠杆菌要置于冰盒中0。C降温，不要放置室温降温。18. 质粒DNA转化大肠杆菌的试验中有受体菌对照（阴性对照）和质粒对照（阳性对照）两个对照试验，其中受体菌对照实验是验证菌体本身是否
