1、基因工程知识要点第一章1.基因工程:是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。2.基因工程的基本过程为哪些？切接转增检 获得目的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，用内切酶将外源DNA切开。切（同时选择运载目的基因的载体） 目的基因与载体DNA拼接：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子。 接 重组体分子导入受体细胞：借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。转
2、短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。 增 筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。 检3.哪些基因是真核生物特有的？ 假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。 基因家族：由功能相关的基因成套组合形成 重复序列哪些是原核生物特有的：插入序列。哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因第二章1. 寄主细胞控制的限制与修饰宿主控制限制核酸限制性内切酶宿主控制修饰修饰的甲基转移酶以(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。（简述寄主控制的限制与修饰现象。v 大多数细菌的噬
3、菌体侵染都存在着一些功能性障碍。所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的R/M体系的作用：v 保护自身的DNA不受限制；v 破坏外源DNA使之迅速降解；2. 简述型、型和型核酸内切酶的基本特性。（1）型酶基本特性 有内切酶活性和甲基化酶活性互斥 需要ATP、SAM（S腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因子； EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。多肽链：特异性亚基，识别DNA序列的活性。多肽链：修饰亚基，具有甲基化酶活性。多肽链：限制亚基：具有核酸内切酶活性 有特定的识别位点 切割方式：结合在识别位点，以滚环形式沿着DNA分子转位，从距识别位点5
4、 一侧几千bp处随机切割分子，无特异性。（2）型酶：有内切酶活性和甲基化酶活性分开反应能识别专一的核苷酸序列，并在固定位置上切割识别序列的核苷酸对顺序呈回文结构（那项具有回文结构：识别位点的DNA序列呈双重旋转对称 ）切割可形成两种核苷酸切割末端粘性末端和平末端。粘性末端定义 ：指DNA分子在限制酶作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，能通过互补碱基间配对而重新环化起来。（3）型酶： 由两个亚基组成的蛋白质复合物，即同时具有内切酶活性和甲基化酶活性 需Mg 2+、ATP、SAM辅助因子可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3端24 26bp处切开，所以它的切割位点也是没有特异性的4. 同尾酶
5、：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。同裂酶：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。星号活性：同一限制酶当某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，即酶切位点专一性改变的活性。包装上标“”注明。5.DNA缺口平移、取代反应的概念DNA缺口平移：在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶的5 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。（概念：当外切酶活性从缺口的5一侧移去一个5核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3一侧补上一个新的核苷酸，但Pol不能在3-OH和5-P之
6、间形成一个键，随着5一侧的核苷酸不断移去， 3一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。） 用途：通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。取代反应：如果在反应混合物中仅存在一种dNTP，则此酶的35 的外切酶活性将从ds DNA的3端降解，直到互补于该dNTP的碱基出现为止，然后在该位置发生合成和取代反应。6.各DNA聚合酶的基本特性及其区别；（1）大肠杆菌DNA聚合酶（Pol）的酶活性 5 3的聚合酶活性：需Mg2+ 5 3的外切酶活性：可以从游离的5-OH末端水解DNA分子(修复作用) 3 5的外切酶活性（较低）：从DNA链的3-OH末端向5
7、水解DNA(校对作用)用途：主要功能参与DNA的合成，起到修复作用；Pol同DNA分子克隆的关系最为密切。（2）Pol的Klenow片断 53的聚合酶活性； 35 的外切酶活性 无53 外切酶活性。Klenow片断的主要用途： 修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端； 标记DNA片断的末端； cDNA克隆中的第二条链c DNA的合成； DNA序列的测定。（3）Pol（参与DNA修复过程）酶活性： 53的聚合酶活性：要求模板是双链DNA，中间有空隙的单链DNA部分，且空隙部分不长于100 bp； 具有35 的外切酶活性，无53 外切酶活性； 主要在DNA的损伤修复中有一定的作用（4）Pol
8、聚合作用：是细胞内DNA复制所必需的； 35 的外切酶活性，底物是单链DNA； 53 外切酶活性，底物是单链DNA。（5）T4 DNA聚合酶 53的聚合酶活性； 35 的外切酶活性； 无53 外切酶活性； 取代反应:在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；（6）T7 DNA聚合酶 53的聚合酶活性； 35 的外切酶活性（是klenow片段的1000倍）； 无53 外切酶活性；（7）耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）（选择题） 具耐高温的特性，最适活性温度为72，连续保温30min仍有活性，一次加酶即可满足PCR反应全过程的需求； Mg 2+依赖酶；具有聚合酶活性；具有53 外切
9、酶活性，无35 外切酶活性 SDS完全抑制其酶活性。（8）反转录酶依赖RNA的DNA的聚合酶。 多肽链具有反转录酶活性和RNase H活性； 多肽链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的53脱氧核酸外切酶活性。 以mRNA为模板合成cDNA；在反转录酶作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条cDNA。7.连接酶所需的条件供能分子、磷酸基团和羟基。概念：能够催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。即能够将DNA链上彼此相邻的3-羟基（ OH ）和5-磷酸基团（-P），在供能分子的作用下，形成磷酸二酯键。需要三种成分参与：3-OH，5-P，提供能量的分子供能分子：NAD+（烟酰胺腺嘌呤二
10、核酸）在E.coli等细菌中选用ATP（腺苷三磷酸）动物细胞、噬菌体中选用注： 只能连接缺口（nick）； 不能连接裂口（gap）； 而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。8.缺口：在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去磷酸二酯键所出现的单链断裂。裂口：在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。9、碱性磷酸酶：将DNA末端的5端磷酸基除去，使其5端变成3羟基，能防止自身环化。作用：（1）去除DNA和RNA的5”-磷酸基，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用32PATP进行末端标记，继而进行序列分析。（2）去除载体DNA5”-磷酸基，防止自身环化，降低本底
11、，提高重组DNA检出率。 发夹结构：10、末端转移酶特性： 催花dNTP添加到3-OH端，且不需模板； 需Co 2+。用途： 给载体或cDNA加上互补的同聚尾； 标记3末端。第三章1、基因载体：离开染色体的外源DNA不能复制，而插入的外源DNA可作为复制子的一部分在受体细胞中进行复制，这种复制子就是外源基因的载体。 2、报告基因：有特殊意义的基因，重组子转入宿主细胞中，可依据报告基因从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。2、载体应具备的特性： 能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制，插入外源基因后，仍保持稳定的复制状态； 易于从宿主细胞中分离，并行纯化； 载体DNA序列中有单一的酶切位点，并
12、位于DNA复制的非必需区内； 具有能够观察的表型特征，如报告基因（遗传标记），插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择标志。3、载体的致死效应：利用载体进行克隆时，有时可能对大量的克隆化基因和克隆化基因产物可能有害，宿主细胞呈现致死效应。如大量表达目的蛋白不利于宿主繁殖，使其致死。3、R1质粒和Col E1-K30质粒R1质粒Col E1-K30E.Coli中严紧型松弛型奇异变形杆菌中松弛型严紧型4、质粒构型：常见的构型: SC L OCA. 共价闭合环形DNA(cccDNA):呈现超螺旋的SC构型B. 开环DNA(ocDNA):即OC型。C. 线性DNA(lDNA):即L型。根据寄主
13、细胞所含的拷贝数多少质粒分为严紧型和松弛型。5、质粒的种类F质粒：又叫F因子、性质粒或致育质粒。是最具代表性的单拷贝的接合型质粒，共编码着19个转移基因。R质粒：又称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因。Col质粒：产生大肠杆菌素因子，编码有控制大肠杆菌素合成的基因。属非结合质粒。6、Col E1质粒的迁移作用：由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移的过程。其中参与迁移的有两种基因：bom 基因：位于Col E1DNA上的特异位点mob 基因：Col E1质粒特有的，其编码的核酸酶作用于bom位点7、细菌质粒的不相容性在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的质粒。也称为质
14、粒的不亲和性。是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。8、质粒的报告基因应用类型：插入失活效应；互补简述如何应用插入失活和-互补（蓝白筛选）来筛选重组子pBR322质粒载体有:抗氨苄青霉素基因(ampr);抗四环素基因(tetr) 互补：LacZ（半乳糖苷酶基因）有两个主要的亚基，亚基 和 亚基， 与 相结合就能表现出半乳糖苷酶活性，能将无色底物X-Gal 变成蓝色。片段基因coli基因组 - 肽基因质粒 将含有- 肽的质粒转化到coli上（ - 互补），形成蓝色菌落； 插入外源基因，使- 肽编码区被破坏，LacZ失活则形成白色菌落。
15、 利用- 互补（蓝白斑筛选）进行重组子的筛选。9、如何对质粒进行人工改造，使其成为载体。（1）减小分子量：可容纳外源DNA更长；（2）改造内切酶位点，具有若干限制酶切单一位点的多克隆位点（人工合成且密集排列）；（3）插入外源基因后，较易导入宿主菌内复制和表达，且不会因接触而转移到另一个细菌；（4）具有一个或几个报告基因。克隆载体：复始起始点、遗传标记、多克隆位点10、pBR322和pUC质粒的各组成部分的来源分别是什么？（1）pBR322主要组成部分的来源1 亲本：pMB1和pSF2124 ; ampr基因来源于pSF2124； tetr基因来源于Psc101; 复制起点（ori）Col E1
16、11、穿梭质粒：是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。专 题 核酸分子的提取及核酸凝胶电泳2、简述提取质粒DNA 的原理及步骤。碱变性法原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。步骤：材料的准备 破碎细胞或包膜，使内容物释放 核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中3、 如何防止RNase污染？ 塑料器皿用0.1%DEPC水溶液浸泡12h以上，高温灭菌后，180烘干6h以上。 在超净工作台上操作。 操作时带一次性手套和口罩。 提取缓冲液中加入RNase抑制剂。1、温和噬菌体：既可
17、引起宿主细胞的裂解死亡，又可将其核算整合到细菌染色体上，使细菌细胞继续生长繁殖，并被溶溶原化的噬菌体。 烈性噬菌体：将噬菌体感染的记住细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，能产生出大量子代噬菌体。溶原化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程。噬箘粒：由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为噬菌粒载体。柯斯质粒：一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。载体，也称粘粒、柯斯载体。4、 PAGE、琼脂糖凝胶电泳和脉冲电泳的区别及其应用范围。电泳技术用途区别琼脂糖凝胶电泳检测总DNA或总RNA的完整性、对PCR产物进行检测以及对核酸进行回收和纯化
18、分辨100bp50kb的核酸片段聚丙烯酰胺凝胶电泳生物多样性检测以及亲子鉴定等分辨1bp1000bp的核酸片段脉冲电场凝胶电泳分离大分子量的DNA分子分辨 50kb的核酸片段2、噬菌体的繁殖方式 溶菌性方式：噬菌体利用宿主的酶类和原料，DNA复制成子代DNA，并装配呈子代噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的噬菌体。 溶源性方式：感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为细菌DNA的一个组成部分。3、噬菌体的类型及体外包装程序（二）体外包装程序 包装反应的底物，按照滚环复制机理合成多连体形式的DNA，在具备噬菌体头部前体的条件下，从cos位点处被切割成单体分
19、子。 将线性单体分子装填到头部外壳里，由于具有粘性末端而发生环化。 把头部和分别组装的尾部结构连成一体，形成成熟的噬菌体颗粒。4、M13 载体的优点和用途;优点： 只含单链DNA，因此可用作对DNA测序的模板及其它基因克隆实验，如异源双链DNA分析，互补RNA的分离及DNA序列分析等； 可用来产生单链的DNA探针以选择和分离互补的RNA； RF型是双链DNA，便于限制酶的识别和切割； RF型DNA经包装后分泌到细胞外而不溶菌； 不存在包装限制问题。用途： 制备测序用单链DNA模板； 用于制备杂交探针； 用于定点突变。6、质粒、 噬菌体和柯斯质粒的包装限制。（1）噬菌体的包装能力控制在为野生噬菌
20、体DNA长度（约48.5 kb）的75%-105%。 蛋白质外壳容纳DNA的能力 噬菌体载体克隆外源DNA的能力（2）柯斯质粒：可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。克隆的外源基因可达45kb，比噬菌体大许多。由于包装限制的缘故，存在最低限值（30kb）。:噬箘粒特点： 噬菌粒载体的分子量较小，约3000bp； 既有质粒的复制起点又有噬菌体的复制起点。在寄主内，可以按正常的双链质粒DNA形式复制，形成的双链DNA既稳定又高产，具有常规的质粒特性（选择性标记、多克隆位点等 在辅助噬菌体的存
21、在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体，包装成噬菌体颗粒后被挤出寄主细胞。 用噬箘粒克隆DNA进行测序，免去从质粒到噬菌体这一亚克隆步骤。（分子量小、克隆能力大；能稳定遗传；可用来制备单、双链DNA。）（一）聚合酶链式反应（PCR）1、 原理：双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，引物与互补DNA结合后，经单链杂交复性，并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）按53方向将引物延伸，合成新生的DNA互补链。2、 反应过程：模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形
22、成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。 变性：通过热处理将待扩增模板的双链DNA变性裂解成单链DNA; 退火：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物杂交结合； 延伸：在适当条件下，DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。723、反应体系和反应条件PCR反应体系：模板：DNA；引物：P1 P
23、2；DNA聚合酶：Taq；原料：dNTP；反应缓冲液；辅助因子：Mg2+Mg2+ 的作用：Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。1 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。2 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。4、引物二聚体：一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段。（引物之间或引物自身存在互补序列）7、Southern 杂交的原理毛细管作用：用限制性内切酶将DNA消化成一定大小的片段，用琼脂糖凝胶电泳分离消化片段，
24、再用毛细管转移等方法将变性的DNA片段转移到滤膜上，然后用标记的ssDNA（单链DNA）或RNA探针对固定在滤膜上的DNA进行杂交。操作程序：用凝胶电泳分离DNA片段 用碱变性也预处理凝胶，并将其放在两端浸在缓冲液中的滤纸上 在凝胶上覆盖一张滤膜 滤膜上加一叠干滤纸，并放上重物 稳定DNA片段，并用X光胶片曝光后得放射自显影照片，并与凝胶谱带比较为何在转移之前需要进行碱变性处理凝胶？使DNA片段保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。8、Southern用途：（1）掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置；（2）构建DNA分子的遗传图（3）分析基因组DNA消化片段、相互关系及长度的多样性（4）
25、转基因生物基因组中外源基因整合及整合位点的鉴定（5）基因操作过程中复杂基因构件的分析鉴定Nornthern blotting（RNA印迹杂交）用途; 检测真核基因的转录水平、转录子的分子大小及相对丰度；是研究真核细胞基因表达的强有力手段。注意：防止RNA的降解8、原位杂交（菌落或噬菌斑杂交）的概念及原理：生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。 第六章 基因文库的构建一、 基因文库的概念基因文库：将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因组遗
26、传信息的材料称为基因文库。注：基因文库与基因库的区别2. cDNA文库:指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆集合。与基因组文库的区别：cDNA文库不含非转录的基因组序列一、 cDNA文库的特征 不含真核基因的间隔序列及调控区，不是真正意义上的基因； 仅包含某种组织或细胞正在表达的基因； 基因总量比基因组文库小得多，易于筛选克隆； 具有时效性，在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织在某种环境条件下的基因表达情况，不能包括该生物体的全部基因。2三种分离mRNA的方法（1）传统的分离方法是用oligo (dT)-纤维素柱分离总R
27、NA；（2）把oligo(dT) -磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA（3）用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA2、cDNA 的合成:第一链的合成: mRNA, 反转录酶 oligo(dT) 核酸末端转移酶，dNTPs： 1. oligo(dT) 引导的cDNA合成法 2. 随机引物引导的cDNA合成法第二链的合成: 用RNaseH酶降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA，加入聚合酶，以第一条cDNA链为模板，降解的mRNA的段片段为引物合成第二链。3cDNA文库构建的程序： （1）分离细胞总RNA，从中纯化出主要含mRNA的分部；（2）合成第一链cDNA；
28、（3）将mRNA-DNA杂交分子转变成双链cDNA分子；（4）将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌寄主细胞增殖。（三） cDNA克隆的优越性 以mRNA为材料；（一些RNA病毒，不经过DNA中间体，对其研究，cDNA是唯一可行的方法） cDNA文库的筛选比较简单易行； 由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性的几率比较低； 克隆在细菌中表达的基因，用作基因序列的测定和发育过程中或组织中基因特异表达 一、应用mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）原理： 用3 -端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3 -端锚定引物和5-端10-mer随机
29、引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳23小时，可显示出50100条长度在1005000bp之间的DNA条带。2. 建立文库的目的，应用范围目的： 便于目的基因的保存、扩增和纯化； 分离克隆目的基因的主要途径； 是复杂基因组作图的重要依据。应用范围： 研究基因的结构、功能和筛选基因工程目的基因； 基因定位、基因调控等方面研究。第七章 目的基因的制取2. 保护基团的作用保证合成反应能够定向地进行，将不需要参加反应的基团，用保护基选择性地保护起来，以获得特定序列。（二） 磷酸三酯法原理 对于参加缩合反应的带5端保护基团的单核苷酸，其磷酸分子中的
30、一个-OH基团已带上适当的保护基团。余下的另一个具有活性的-OH与另一个带有3端保护基团的单核苷酸的5 -OH缩合形成具磷酸三酯键的二核苷酸分子。（四）用寡核苷酸片段组装基因的方式1. 小片段粘接法： 将待合成的目的基因分成若干小片段，每段长1215bp，两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片段，然后通过化学方法合成，并退火形成双链DNA大片段。小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段 优点： 化学合成的DNA片段小，收率高；缺点： 各段的互补序列较短，易在退火时发生错配。2. 补丁延长法 将目的基因的一条链分成若干4050bp大小的片段，另一条链设计成与上述大片段交错互补的小片段（约20bp的补丁）。两组不同大小的DNA单链片段退火后，用klenow酶将空缺部分补齐，最后用T4 DNA连接酶修复缺口补丁延长法： 根据目的基因两条互补链全序列，分别合成20碱基长的单链DNA小片段以及40-50碱基长的单链DNA中片段优点：化学合成
