1、流式细胞仪SOP一.流式细胞术概述 流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。国内使用的流式细胞仪主要由美国BECKMAN-COULTER公司和Becton
2、-Dickinson公司(简称B-D公司)两个厂家生产。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICSALTRA和EPICSXL/XL-MCL,BD公司最新产品为FACSVantage 和FACSCalibur。EPICSXL/XL-MCL和FACSCalibur是临床型;EPICSALTRA和FACSVantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。二.流式细胞仪主要技术指标 1流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测10005000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
3、2流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上600个荧光分子,两个细胞间的荧光差5%即可区分。3前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.5m。4流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到650 nm） 3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。流速控制： LO： 样品流速：12 l /minMED： 样品流速：35 l /minHI： 样品流速：60 l /min功能控制：RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查
4、是否失压。）STANDBY： 无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME束，仪器恢复STANDBY状态。4. 储液箱抽屉： 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘
5、液筒密闭。废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。鞘液过滤器：m过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。5. 上样品区：上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针 Sample Injection Tube，将样本输入流动室，还有就是支撑架 Tube Support Arm、和液滴存留系统 Droplet Containment System。进样针：是一根不锈钢
6、管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。五、开关机操作程序5.1 FACS Calibur 开机1、开启细胞
7、仪电源。2、开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。3、开启计算机。4、确认鞘流液筒有八分满的FACS Flow，确实旋紧 (鞘液筒容量为4L)。5、将废液倒掉，并在废液筒中加入200 ml漂白水(废液筒容量为4L)。6、将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。7、排除液流管路与过滤器中的气泡。8、取下样品管，执行 PRIME 功能两次。9、使用1ml PBS，HIGH RUN 两分钟。可开始分析样品。5.2 FACS Calibur 关机关机前必要动作：清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。1、将样品支持架左移，取 2ml FACSClean（10%Bleach）上样品
8、，让仪器的真空系统抽取约1ml的液体。2、将样品支持架回正，按 HI RUN，然后让 FACSClean 清洗管路10分钟。3、按 Standby，取下样品管，执行 PRIME功能两次。4、取 2ml dH2O，重复上述步骤1-3。5、注意最后只留约 1 ml dH2O 在试管中。6、按 STANDBY 五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作，以保护雷射光源。）7、倒掉废液，并回填 200 ml漂白水。8、将减压阀放在VENT 漏气位置。将鞘流液筒充填至八分满。9、退出软件“File”“Quit”(如有对话选项，选择“Dont save”)。10、确认退出计算机中所有BD应用软件，所有
9、数据数据已储存备份。关闭计算机。“Special”“Shutdown”六、FACSCalibur的日常维护FACSCalibur的设计将仪器的维护工作减至最少，但是，为了保证仪器的正常运转和测定结果的可靠，仍需要进行一些必要的常规维护。清洗液的选择 FACS Clean Fluid：流式细胞仪的常规清洗用液，直接使用，可有效去除仪器管路内的样本、染料等造成的污染。 漂白剂NaClO溶液：流式细胞仪的常规清洗用液。目前市场上的漂白剂有效氯浓度多为5-10%。m滤膜过滤后备用。 FACS Rinse Fluid：流式细胞仪的清洗液，直接使用，可有效去除仪器管路内积聚的蛋白成分。 表面活性剂Trit
10、on等：使用浓度约为1%，m滤膜过滤后备用。使用表面活性剂时，注意上样管中不要加满，也不要反冲，防止操作不当造成液体进入气路，或进入压力控制器。 蛋白酶液：测定血样以后，可以使用蛋白酶液清洗上样管，有效去除加样针、流动池中附着的蛋白成分。m滤膜过滤后备用。 蒸馏水：为了防止管路内残留有清洗液，形成结晶或造成管路接口的腐蚀，在使用清洗液清洗完毕后，一定要用蒸馏水，再次冲洗管路。m滤膜过滤后备用。每日维护实验结束后，请于关机前清洁加样针的外管和内管，防止加样针堵塞或有染料残留。在使用了一些荧光染（如PI、AO、TO等）后，也需要立即进行加样针的清洁。1.准备一只上样管，加入3ml漂白剂（可以直接使
11、用过滤后未稀释的漂白剂）；另一只上样管，加入3ml蒸馏水。2.打开支撑臂，放好有漂白剂的上样管。3.加样针外管跑1ml。4.流速选择HI档，合上支撑臂，加样针内管跑5-10分钟。5.取下有漂白剂的上样管，换上有蒸馏水的上样管。6.打开支撑臂，加样针外管跑1ml。7.流速选择HI档，合上支撑臂，加样针内管跑5-10分钟。8.按下STANDBY按钮。9.检查上样管内剩余的蒸馏水，应不超过1ml。10.关机以后，有蒸馏水的上样管应保持原位，防止加样针有结晶形成。有时某些样本中含有大量蛋白成分，这些蛋白成分在上样针中会有残留，如果不能有效去除这些成分，积聚过多，会影响实验检测。这时建议在处理完含有蛋白
12、成分的样本后，使用含有去蛋白成分的洗液清洗加样针。1.上样管中加漂白剂，清洗加样针（步骤见上文）。2.上样管中加蒸馏水，清洗加样针3.上样管中加FACS Rinse Fluid，清洗加样针4.上样管中加蒸馏水，清洗加样针5.清洗结束后，上样管中剩余1ml蒸馏水。每月维护 流式细胞仪使用一段时间后，在鞘液管路、废液管路和流动池中会有残留的碎片、污染物等，因此，需要定期清洗管路，要求至少每个月做一次，如果处理样本量很大，或经常使用附着性染料（如PI、AO等），则需要增加管路清洗频率。清洁管路时使用含有效氯（NaClO）浓度为1-2%的稀释漂白剂。注意用漂白剂清洗管路完毕后，必须换蒸馏水，再次冲洗管
13、路，以防止管路有漂白剂残留。1.在仪器减压后，取下鞘液筒，倒空。如有必要，应清洗鞘液筒。2.将鞘液滤器短路，使鞘液不流经滤器，直接沿鞘液管路进入流动池。3.鞘液筒中倒入1-2L稀释漂白剂（注意不能使用原浓度）。4.上样管中加入3ml稀释漂白剂。5.流速选择HI档，RUN运行20-30分钟。6.鞘液筒用蒸馏水清洗干净，再加入蒸馏水1-2L。7.取下有漂白剂的上样管，换上有3ml蒸馏水的上样管。8.流速选择HI档，RUN运行20-30分钟。9.鞘液筒中换成鞘液，重新安装好鞘液滤器管路。10.流动池PRIME两遍，PRIME结束后，仪器自动回复到STANDBY状态。11.上样管中加入蒸馏水，RUN运
14、行5分钟。12.仪器进入STANDBY状态，可以进行样本检测。定期维护 需要定期进行仪器检查和清洁，这里主要谈一谈空气滤网的清洁：空气滤网位于鞘液筒上方，可以用吸尘器或水洗的办法清洁。空气滤网需要定期检查，发现滤网脏了，就需要清洗了。1.外抽取下空气滤网。2.清洁滤网，如果水洗处理，应等滤网完全干了以后，再进行安装。3.装回滤网，将其慢慢推回原位。安装时注意滤网的方向，气流由下往上通过。七、FACSComp FACSComp简 介FACSComp是BD公司自动设置仪器的应用软件，它不仅可通过标准微球（CaliBRITE beads）来监测仪器的工作状态，还可以为人类外周血淋巴细胞免疫分群的应用
15、提供常规的、自动化的仪器设置。流式细胞仪包含了一些灵敏的光电元件，为了保证实验结果的一致性，最好每天用CaliBRITE beads来运行FACSComp软件。7.1.1 FACSComp运行条件硬件BD公司生产的FACSCalibur、FACSort或FACScan系列流式细胞仪，若做四色，则必须具备配有FL4荧光探测器的FACSCalibur或FACSort；FACSComp在Power Macintosh和Quadra 650上都能运行；FACSComp可以支持自动进样系统，但要求LoaderManager3.2或更高的版本存在。软件Power Macintosh AcqLibPPC 或
16、更高BDPACDriver1.0.2； BDPACInit 或更高； BDPAC 1.0.2； Quadra 650 BDMAC 3.0 Macintosh系统软件，7.6.1或8.1；对于HLA-B27的调试，需HLA-B27软件3.2或更高的版本；对于FACS Loader，需LoaderManager3.2或更高的版本；试剂CaliBRITE BeadsCaliBRITE beads是已知光散射和荧光强度的标准塑料微球，大小在5-6 um 左右。BD公司生产的beads包括下列5种： 无荧光标记的beads FITC-标记的beads PE-标记的beads PerCP-标记的beads
17、 APC-标记的beads每一种beads都有一个相应的6位编码（lot ID），例如，12493N。其中最 后一位代码决定了下列值：1FSC和SSC的最小separation values（unlabeled bead的后缀）2FL1，FL2和FL3的最小separation values（FITC，PE，PerCP- bead的后缀）3FL4 PMT的靶值（APC-bead的后缀）4FL4的最小separation values（PerCP，APC-bead的后缀）鞘液用鞘液稀释CaliBRITE beads制成新鲜悬液。HLA-B27试剂盒如你准备做HLA-B27的调试，需用HLA-B2
18、7试剂盒中的calibration beads制备悬液，其中beads lot ID的后缀决定了FL1的靶值而HLA-B27 reagent lot ID的后缀决定了样本分析时marker所在的位置。7.1.2 FACSComp的文件类型FACSComp软件可以生成下列类型的文件：Summary Report File无论是对于Lyse/Wash Assay还是Lyse/No Wash Assay，都会生成两个Summary Report File：a text file文本文件和a pict file图象文件。本文件包括每一个参数的channel separation，灵敏度测试的结果，以及
19、当前的FACSComp的仪器设置。Summary Report File的保存位置是：BD File：FACSComp File：DDMMYY folder。HLA-B27 Summary Report FileHLA-B27调试后同样生成两个Summary Report File：文本文件和图象文件，文本文件包括调节FL1和FSC之后仪器的设置。保存位置是：BD File：FACSComp File：DDMMYY folder。Calibration FileFACSComp每一次运行结束都会生成一个新的calibration file，这个文件包括所有的仪器设置以及灵敏度测试的总的结果（T
20、RUE代表所有的参数都通过，FALSE代表一个或几个参数不通过）。这个新生成的文件会自动覆盖原有的文件，因此每一次只会有一个Calib File和一个Calib File.LNW存在。保存位置是：BD File：Instrument Settings File。Lyse/Wash calibration file中仪器的设置可应用于SimuSET，Retic-COUNT；而Lyse/No Wash calibration file中仪器的设置可应用于MultiSET，TriTEST，ProCOUNT和FASTIMMUNE。HLA-B27 Calibration File在进行HLA-B27调试
21、之前，必须通过一次成功的Lyse/Wash Assay，而每一次调试结束后，都会生成一个新的HLA-B27 calibration file。保存位置是：BD File：Instrument Settings File。LeucoCOUNT Calibration FileFACSComp可以对Lyse/No Wash的设置加以修饰生成LeucoCOUNT calibration file，因此，若要保存LeucoCOUNT Calib File，必须通过一次成功的Lyse/No Wash Assay，并且在参量设定时选择LeucoCOUNT。保存位置是：BD File：Instrument Settings
