1、周庆德微生物学习笔记绪 论第一节：微生物学的研究对象与任务一、“微生物”的含义（什么是微生物）非分类学上名词，来自法语“Microbe”一词。是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构的低等生物的通称。（插入）二、生物分界（微生物在生物界的位置） 1、两界系统（亚里斯多德）动物界 Animalia：不具细胞壁，可运动，不行光合作用。植物界 Plantae：具有细胞壁，不运动，可行光合作用。三界：原生生物界 Protista：（E. H. Haeckel, 1866年提出） 2、五界系统R. H. Whitakker, Science, 163: 150-160, 1969原核生物
2、界 Monera：细菌、放线菌等原生生物界 Protista：藻类、原生动物、粘菌等真菌界 Fungi：酵母、霉菌动物界 Animalia：植物界 Plantae：五界系统是以细胞结构分化的等级以及和光合、吸收、摄食这三种主要营养方式有关的组织类型为基础的。六界：加上病毒界。3、三界（域）系统 Woese用寡核苷酸序列编目分析法对60多株细菌的16SrRNA序列进行比较后，惊奇地发现：产甲烷细菌完全没有作为细菌特征的那些序列，于是提出了生命的第三种形式-古细菌(archaebacteria)。随后他又对包括某些真核生物在内的大量菌株进行了16Sr RNA(18SrRNA)序列的分析比较，又发现
3、极端嗜盐菌和极端嗜酸嗜热菌也和产甲烷细菌一样， 具有既不同其他细菌也不同于其核生物的序列特征，而它们之间则具有许多共同的序列特征。于是提出将生物分成为三界(Kingdom)(后来改称三个域)：古细菌、真细菌( Eubacteria)和真核生物(Eukaryotes)。1990年，他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类 ，他又把三界(域)改称为：Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)。并构建了三界(域)生物的系统树。四、微生物特点生命基本特征：生命通过它的耐久性、适应性、它的生长及修复的能力和它的繁殖而延续下去，这是生命的基本的和普遍的特征。新陈代谢，包括外
4、部的和内部的，是一切生命的另一基本特征。控制与调节，是生命的又一基本特征。体积小、比表面积大大小以um计，但比表面积（表面积/体积）大，（插入表），必然有一个巨大的营养吸收，代谢废物排泄和环境信息接受面。这一特点也是微生物与一切大型生物相区别的关键所在。特点1举例乳酸杆菌：120，000鸡蛋：1.5人（200磅）：0.3 2、吸收多、转化快这一特性为高速生长繁殖和产生大量代谢物提供了充分的物质基础。特点2举例重量相同下：乳酸菌：1小时可分解其体 重1000至10000倍乳糖。人：2.5105 小时消耗自身体重1000倍乳糖。3、生长旺、繁殖快极高生长繁殖速度，如E. coli 20-30分钟分
5、裂一次，若不停分裂，48小时2.21043 菌数增加，营养消耗，代谢积累，限制生长速度。这一特性可在短时间内把大量基质转化为有用产品，缩短科研周期。也有不利一面，如疾病、粮食霉变。4、适应强、易变异极其灵活适应性，对极端环境具有惊人的适应力。遗传物质易变异。5、分布广、种类多分布区域广，分布环境广。生理代谢类型多，代谢产物种类多，种数多。五、微生物作用1、在自然界物质循环中作用2、空气与水净化，污水处理3、工农业生产：菌体，代谢产物，代谢活动4、对生命科学的贡献六、分支学科根据不同研究领域和不同研究对象划分第二节、微生物学发展简史“科学的历史就是科学本身。” 歌德中国古代酒文化，“仪狄作酒，禹
6、饮而甘之。”书经“若作酒醴，尔惟曲蘖（nie）”齐民要术提倡轮作制。宋真宗时代（公元998-1022）种痘防天花。二、国外微生物学发展1、微生物的发现形态学时期Antony Van Leeuwenhock，1632-1723第一个报告自己观察的人。他观察了几乎每一个想看到的东西，雨水、污水、血液、体液、酒、醋、牙垢等，发现了微生物，称为“微动体”。2、微生物学的奠基生理学时期Louis Pasteur，1822-1895他的一生给人类生活带来了史无前例的影响。（1）证实了微生物活动和否定了微生物自然发生学说。（2）免疫学预防种痘（3）发酵的研究（4）其他贡献否定自生说关于自然发生的争论：自然发
7、生说（无生源说）：认为微小动物是从无生命的物质自然发生的。生源说：认为微小动物是从微小动物的“种子”或“胚”形成的，“种子”或“胚”存在于空气中。已进行的实验：1665年，Fracesco Redi 腐肉生蛆实验，否定了动物自生说。Spallanzani实验，充分加热的有机汁液中长出微生物原因是由于空气将微生物带进了汁液，因而采取完全密封隔绝的封闭法。18世纪末发现o2 ，意识到o2 是动物生活必需一种气体。Pasteur实验1、首先验证了空气中确实含有显微镜可观察到的“有机体”。2、加热过的空气通入汁液（煮沸过）并不导致微生物生长。3、在一封闭容器内，对完全灭菌的汁液加上一些收集到的微生物，
8、无例外地引起微生物生长。4、设计鹅颈瓶进行实验，最终否定自生说。免疫学贡献Edward Jenner，1796发明种痘，不了解机制。Pasteur 1877研究了鸡霍乱、炭疽病和恐水病，发现钝化病原体可以诱发免疫性和预防疾病。发酵研究相信一切发酵作用都和微生物的存在及繁殖有关。不同的发酵是由不同的微生物引起的。发明巴斯德消毒法。观察丁酸发酵时，发现厌氧生命，提出好氧、厌氧术语。Robert Koch 1843-19101、建立微生物学研究基本技术（1）分离和纯化细菌：划线法，混合倒平板法。琼脂、培养皿（Petri）（2）设计了培养细菌用的肉汁胨培养液和营养琼脂培养基。（3）设计了细菌染色技术2
9、、证实疾病的病原菌学说，提出了柯赫准则。柯赫准则1、某一种微生物，当被怀疑是病原体时，它一定伴随着病害而存在。2、必须能自原寄主分离出这种微生物，并培养成为纯培养。3、用已纯化的纯培养微生物，人工接种寄主，必须能诱发与原来病害相同病害。4、必须自人工接种发病的寄主内，能重新分离出同一病原微生物并培养成纯培养。其他人Serge Winogradsky,185 6-1953,发现微生物的自养生活。Beijerinck M. W.,1851-1931，发现了非共生固氮菌。Joseph Lister,1864,提出无菌外科操作技术。Elie Metchnikoff 发现白细胞的吞噬作用。Ivanovs
10、ky 发现烟草花叶病毒。P. Ehrlich 现代化疗的开始3、现代微生物学发展分子生物学阶段1、现代发酵工业的形成：1941，Florey & Chain 将青霉素投入生产，是通气培养微生物的开端，将微生物学与工程学结合。2、微生物代谢作用研究；1944，Avery 肺炎球菌转化实验，确定DNA是遗传物质，标志着分子生物学的形成。1953，Watson & Crick 提出DNA双螺旋结构以及半保留复制假说。3、分子生物学阶段20世纪70年代，基因工程的发展，工程菌的构建更促进了微生物学的发展。微生物学推动生命科学的发展促进许多重大理论问题的突破对生命科学研究技术的贡献与“人类基因组计划”展
11、望生物技术世纪已经来临，正是你们大展宏图之时，微生物学历史这部没有完成的书，要靠你们书写。努力吧！同学们3节：工业微生物简介1、酿酒工业白酒：四大名酒，五大香型啤酒、黄酒、葡萄酒（威士忌、白兰地、伏特加、朗姆、金酒）2、酒精工业3、溶剂工业（丙酮、丁醇）4、有机酸工业: 乳酸、柠檬酸、衣康酸、延胡索酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸等。5、抗生素工业6、酶制剂工业7、氨基酸工业8、酵母工业9、多糖工业：黄原胶、右旋糖苷、等等10、石油发酵11、生物活性物质：核酸类、维生素等12、其它：微生物农药、沼气发酵、生物制品（菌苗、疫苗）4节：微生物分类 Microbial taxonomy分类主要是探索生物之
12、间的亲缘关系，把它们归纳为互相联系的不同类群。具体任务就是分类、鉴定和命名。一、分类单位与命名（一）分类单位:界,门,纲,目,科,属,种种是最基本的分类单位,它是一大群表型特征高度相似，亲缘关系极其相近，与同属内其它种有着明显差异的菌株的总称。种以下又分亚种(变种),型,类群,菌株(品系)菌株(品系)(strain): 表示任何由一个独立分离的单细胞繁殖成的纯种群体及其一切后代。（二）命名命名按照国际细菌命名法规,采用林奈氏双名法。属名 + 种名 +命名人如大肠杆菌: Escherichia coli (Migula) Castellani & Chalmers 1919属名:名词,大写首字母
13、,一般描绘主要形态或生理特征。种名:形容词,小写,代表一个种次要特征。未确定种名或不指特定的种时，可在属名后加sp.表示。举例真菌界 Fungi真菌门 Eumycophyta子囊菌纲 Ascomycetes原子囊亚纲 Protoascomycetes内孢霉目 Endomycetales内孢霉科 Endomycetaceae酵母亚科 Sacchromycetoideae酵母属 Sacchromyces酿酒酵母 S. cerevisiae Hansen二、分类依据1、形态特征（个体和群体）细胞形态：形状、大小、排列、染色反应等。培养：固体 菌落，半固体 穿刺，液体。2、生理生化反应营养要求：碳源、
14、氮源、营养类型代谢产物：种类、产量、显色反应酶：产酶种类、反应特性3、生态学特征相互关系、宿主种类、与氧关系等。4、生活史5、血清学反应近年又发展了红外光谱，GC含量，DNA杂交等。三、分类方法（一）经典分类法随机地和不系统地根据一些特征进行分类。主要是形态、生理生化特征。（二）数值分类法根据较多特征分类，每一特征地位相同。1、每一菌株为一操作单位，确定很多特征（5060 个）2、比较菌株间的最大相似性阳性和阴性符合的总和- 100%总的测定数 - 无效测定数85%为同种，65%为同属3、据数值绘出矩阵图并转换成树状谱。（三）分子与遗传方法1、DNA碱基组成：GC%相同不能说明是同种，但不同则
15、肯定不是同种。差别10%不是同种，10%可能是同种。2、核酸分子杂交比较碱基顺序的同源性3、16s rRNA寡核苷酸编目分析水解rRNA产生一系列寡核苷酸片段，顺序分析。近年来，采用红外、核磁、电镜等新技术越来越广泛。资料来源：四、分类系统原核生物：伯杰氏细菌鉴定手册第8版，1973伯杰氏系统细菌学手册第9版，1984真菌：Ainsworth (1973)系统酵母：Lodder分类系统菌种鉴定工作三部曲1、获得该微生物的纯培养2、测定一系列必要的鉴定指标3、查找权威性鉴定手册第一章 原核生物的形态、构造和功能1试设计一张表格，比较以下6个大类原核生物的主要特性。 特征细菌放线菌蓝细菌支原体立克
16、次氏体衣原体直径（um）0.2-0.50.5-13-100.2-0.250.2-0.50.2-0.3可见性光学显微镜光学显微镜光学显微镜光镜勉强可见光学显微镜光镜勉强可见过滤性不能不能不能能不能能革兰氏染色阳性或阴性阳性阴性阴性阴性阴性细胞壁有坚韧的细胞壁有坚韧的细胞壁有坚韧的细胞壁缺壁有坚韧的细胞壁有坚韧的细胞壁繁殖方式二均分裂无性孢子和菌体断裂二均分裂二均分裂二均分裂二均分裂培养方法人工培养人工培养人工培养人工培养宿主细胞宿主细胞核酸种类DNA和RNADNA和RNADNA和RNADNA和RNADNA和RNADNA和RNA核糖体有有有有有有大分子合成有有有有进行进行产生ATP系统有有有有有无
17、增殖过程中结构的完整性保持保持保持保持保持保持入侵方式多样直接昆虫媒介不清楚对抗生素敏感敏感（青霉素除外）敏感敏感对干扰素某些菌敏感不敏感有的敏感有的敏感2典型细菌的大小和重量是多少？试设想几种形象化的比喻加以说明。答： 一个典型的细菌可用E.coli作代表，它的细胞平均长度约为2um，宽度约0.5um，形象地说，若把1500个细菌的长径相连，仅等于一颗芝麻的长度，如果把120个细胞横向紧挨在一起，其总宽度才抵得上一根人发的粗细。它的重量更是微乎其微，若以每个细胞湿重约10-2g计，则大约109个E.coli细胞才达1mg重。3试图示G+和G-细菌细胞壁的主要构造，并简要说明其异同。答： 图示
18、如下：G+细菌与G-细菌的细胞壁都含肽聚糖和磷壁酸；不同的是含量的区别：如下表 成分占细胞壁干重的%G+细菌G-细菌肽聚糖含量很高（5090）含量很低（10）磷壁酸含量较高（50）无类脂质一般无（2）含量较高（20）蛋白质无含量较高4试图示肽聚糖的模式构造，并指出G+和G-细菌肽聚糖结构的差别。答：图示如下：G-细菌与G+细菌的肽聚糖的差别仅在于：1）四肽尾的底3个氨基酸不是L-lys，而是被一种只有在原核微生物细胞壁上才有的内消二氨基庚二酸（m-DAP）所代替；2）没有特殊的肽桥，其前后两个单体间的连接仅通过甲四肽尾的第4个氨基酸D-Ala的羧基与乙四肽尾的第3个氨基酸m-DAP的氨基直接相
19、连，因而只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套。5什么是缺壁细菌？试列表比较4类缺壁细菌的形成、特点和实际应用。答：在自然界长期进化中和实验室菌种的自发突变中都会产生少数缺细胞壁的种类，或是用人为的方法通过抑制新生细胞壁的合成或对现成细胞壁进行酶解而获得人工缺壁的细菌统称为缺壁细菌。比较如下： 类型形成特点实际应用L型细菌（L-form of bacteria）在某些环境条件下（实验室或宿主体内）通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异型1没有完整而坚韧的细胞壁，细胞呈多形态2有些能通过细菌滤器，故又称“滤过型细菌”3对渗透敏感，在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落（直径在0.1mm
20、左右）可能与针对细胞壁的抗菌治疗有关原生质体（protoplast）在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。1对环境条件变化敏感，低渗透压、振荡、离心甚至通气等都易引起其破裂2有的原生质体具有鞭毛，但不能运动，也不被相应噬菌体所感染，在适宜条件（如高渗培养基）可生长繁殖、形成菌落，形成芽孢。及恢复成有细胞壁的正常结构3比正常有细胞壁的细菌更易导入外源遗传物质，是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料球状体(sphaeroplast)又称原生质球，是对革兰氏阴性细菌处理后
21、而获得的残留部分细胞壁（外壁层）的球形体。与原生质体相比，它对外界环境具有一定的抗性，可在普通培养基上生长支原体(mycoplasma)在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇， 所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度6试述染色法的机制并说明此法的重要性。答：革兰氏染色的机制为：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物。G+由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次多和交联致密，故遇脱色剂乙醇处理时，因失水而使网孔缩小，在加上它不含类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物牢牢留在壁内，使
22、其保持紫色。反之，G-细菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄和交联度差，遇脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此细胞退成无色。这时，在经沙黄等红色染料复染，就使G-细菌呈红色，而G+细菌则仍保留最初的紫色。此法证明了G+和G-主要由于起细胞壁化学成分的差异而引起了物理特性的不同而使染色反应不同，是一种积极重要的鉴别染色法，不仅可以用与鉴别真细菌，也可鉴别古生菌。7何为“拴菌试验”？它何以能说明鞭毛的运动机制？答： “拴菌”试验(tethered-cell experiment)是1974年，美国学者西佛（M.Silverman
23、）和西蒙（M.Simon）曾设计的一个实验，做法是：设法把单毛菌鞭毛的游离端用相应抗体牢牢“拴”在载玻片上，然后在光学显微镜下观察细胞的行为。因实验结果发现，该菌是在载玻片上不断打转（而非伸缩挥动），故肯定了“旋转论”是正确的。8渗透调节皮层膨胀学说是如何解释芽孢耐热机制的？答：渗透调节皮层膨胀学说认为：芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差 ，皮层的离子强度很高，从而使皮层产生极高的渗透压夺取芽孢核心的水分，结果造成皮层的充分膨胀。而核心部分的细胞质却变得高度失水，因此，具极强的耐热性。关键是芽孢有生命的部位即核心部位的含水量很稀少，为10%25%，因而特别有利于抗热。9什么上菌
24、落？试讨论细菌的细胞形态与菌落形态间的相关性。答：菌落即单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体。因不同形态、生理类型的细菌，在其菌落形态、构造等特征上也有许多明显的反映，故细菌的细胞形态与菌落形态间存在明显的相关性现象，如，无鞭毛、不能运动的细菌尤其是球菌通常都形成较小、较厚、边缘圆整的半球状菌落；长有鞭毛、运动能力强的细菌一般形成而平坦、边缘多缺刻、不规则的菌落；有糖被的细菌，会长出大型、透明、蛋清状的菌落；有芽孢的细菌往往长出外观粗糙、“干燥”、不透明且表面多褶的菌落等等。10名词解释：磷壁酸、L
25、PS、假肽聚糖、PHB、伴孢晶体、基内菌丝、孢囊链霉菌、横割分裂、异形胞、原体与始体、类支原体、羧酶体、孢囊、磁小体。磷壁酸是G+细菌细胞壁结合在细胞壁上的一种酸性多糖，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。LPS（脂多糖）是位于G-细菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖和O-特异侧链3部分组成。假肽聚糖是由N-乙酰葡萄胺和N-乙酰塔罗糖胺糖醛酸以-1，3-糖苷键交替连接而成的，连在后一氨基糖上的肽尾由L-Glu、L-Ala和L、Lys3个L型氨基酸组成，肽桥则由L-Glu1个氨基酸组成。PHB（聚-羟丁酸poly-hydroxybutyrate)，是一种存在于许多细菌细胞质
26、内属于类脂性质的碳源类贮藏物，不溶于水而溶于氯仿，可用尼罗蓝或苏丹黑染色，具有贮藏能量，碳源和降低细胞内渗透压等作用。伴孢晶体是少数芽孢杆菌（如苏云金芽孢杆菌）在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形、方形或不规则形的碱溶性蛋白质晶体。基内菌丝是孢子落在固体基质表面并发芽后，不断伸长、分枝并以放射壮向基质表面和内层扩展，形成大量色浅、较细的具有吸收营养和排泄代谢废物功能的菌丝。孢囊链霉菌是由气生菌丝的孢子丝盘卷而成的孢囊，它长在气生菌丝的主丝或侧丝的顶端，内部产生多个孢囊孢子（无鞭毛）。横割分裂是放线菌的一种分裂的方式，有两种途径进行：1）细胞膜内陷，再由外向内中间收缩，最后形成一完整的横割膜，从而把刨子丝分割成许多分生孢子；2）细胞壁和膜同时内陷，再逐步向内缢缩，最终将孢子丝缢裂成一串分生孢子。异形胞是存在于丝状生长种类中的形大、壁厚、专司固氮功能的细胞，数目少而不定，位于细胞链的中间或末端。原体与始体：具有感染力的衣原体细胞称为原体，呈小球状，细胞厚壁、致密，不能运动，不生长，抗干旱，有传染力。原体经空气传播，一旦遇合适的新宿主，就可通过吞噬作用进入细胞，在其中生长，转化为无感染力的细胞，称为始体。类支原体是侵染植物的支原体，也叫植原体。羧酶体(carboxysome )又称羧化体，是存在也一些自养细胞内的多角形或六角形内含物 其大小与噬菌体相仿，
