1、细胞培养细胞培养环境、设备、耗材与试剂1. 环境：细胞培养需要创造一个尽量无菌的环境，所以基本要求是一间密闭的带有空气净化系统的实验室。实验室要安装能够进行表面杀菌的紫外灯，一般装置在室内顶部，与日光灯分开控制。2. 设备：一般的细胞培养需要二氧化碳细胞培养箱，达到细胞实验操作要求的超净台，倒置显微镜，液氮罐，冰箱，水浴锅，离心机，微量移液器等。3. 耗材：基本的细胞实验耗材包括酒精灯、脱脂棉花、封口胶、细胞培养瓶、细胞培养皿、移液管、50ml离心管等。耗材可以购买细胞培养专用的一次性耗材，也可使用长久性的玻璃器皿。但是如果是使用长久性的玻璃器皿，必须将其用牛皮纸包裹好，然后经过湿热高压灭菌和
2、灭菌后烘干。牛皮纸在放进超净台时才能拆除。4. 试剂：根据培养的细胞种类的不同，需要的试剂也不同。基本要求包括培养的细胞对应的培养液，胎牛血清，L谷氨酸，双抗（青霉素和链霉素），0.25%胰酶以及PBS。1. 试剂可以通过生物公司订购，其中双抗、胰酶和PBS也可以自行购买原料配制。1、配制双抗时要用灭过菌的双蒸水，用一次性无菌注射器进行配制，整个配制过程要在超净台内操作。2. 配制胰酶时要使用灭菌后的双蒸水，配制好可以用带0.22微米微孔滤膜的过滤器进行过滤灭菌，整个过滤灭菌过程要在超净台内操作。3. 配制PBS可以使用不灭菌的双蒸水，配制完成后再经过湿热灭菌。5. 部分试剂的配方1. 100
3、L谷氨酸：L谷氨酰胺0.2M2. 10PBS：1000ml中含NaCl8.5g，Na2HPO4.12H2O30.8g，NaH2PO4.2H2O2.8g3. 100双抗：青霉素10000U/ml，链霉素10000ug/ml4. 胰酶：0.25%胰酶，0.03EDTA6. 细胞完全培养液的配置细胞完全培养液，以293细胞为例，需要含10%胎牛血清、2mmol/L的L谷氨酸的DMEM培养液。配置好的DMEM培养液，根据实验要求的不同，选择是否加入双抗。双抗终浓度为100单位/ml。细胞培养实验基本操作要求1. 每天应该对细胞实验室进行半小时的紫外照射灭菌。紫外辐射对人体有害，灭菌时，人员不能进入细胞
4、实验室。2. 进入细胞实验室操作的人员，应该身着消毒过的白大褂，更换消毒过的拖鞋，操作有毒试剂要带好手套。外来带入的物品，都要经过紫外照射或者酒精擦拭的表面灭菌。3. 裸手进行细胞操作，则要在操作之前用消毒液洗手，并在将手伸进超净台前用酒精擦拭全部手部皮肤。带橡胶手套进行细胞操作，在将手伸进超净台前也要用酒精擦拭手套的整个外表面。4. 试剂要按储存要求保存，在超净台内打开过一次的试剂，储存前要用封口膜封住瓶口，并最好在封口膜上表明打开日期。5. 使用超净台之前，应该将超净台的机玻璃板合上，打开超净台紫外开关进行半小时的紫外杀菌。超净台紫外灭菌完毕后，应关闭紫外开关，打开超净台通风开关，然后才能
5、打开有机玻璃板。一般在使用超净台时，有机玻璃不能离台面太远，保持在20cm以内。6. 超净台灭菌以后，任何拿进超净台的物品都要用酒精擦拭物体的全部表面，然后在酒精未干之前放进超净台。要使用到的细胞培养耗材可以在超净台灭菌前放入其中，跟超净台一起灭菌。而细胞培养要使用到的试剂则不可以放入超净台接受紫外照射。7. 细胞实验要使用到的直接接触细胞的试剂，一般要在37度水浴锅中预热半小时，使其温度接近37度。8. 细胞离开培养箱被进行操作的过程不宜过长，否则由于外界温度和二氧化碳浓度的不适，会导致细胞状态不好甚至死亡。9. 细胞培养用的器皿，包括培养瓶、培养皿等等，要对着酒精灯的火焰打开开口，操作过程
6、开口都要对着酒精灯火焰10cm范围内。细胞培养使用的试剂，在酒精擦拭试剂储存器皿后带入超净台。打开瓶盖之前要再用酒精棉花擦拭瓶口，然后对准酒精灯火焰打开开口。操作过程整个开口都要对着酒精灯火焰10cm范围内。10. 操作过程最重要的原则是保持细胞和试剂无菌，并且避免细胞和试剂之间、试剂和试剂之间的交叉污染。比如已经将移液管伸入细胞瓶里吹打细胞，那么要再吸取新的培养液加到培养瓶中则不能再使用该移液管，一定要更换新移液管再去吸取新的培养液。尽量减少细胞和培养液暴露的时间。细胞的传代和培养（以293细胞为例)1. 传代：一般贴壁细胞长满培养瓶培养面积的90%左右就应该对细胞进行传代。贴壁细胞长满培养
7、面，就会产生接触抑制，影响细胞的状态。1. 对着酒精灯火焰打开细胞培养瓶，用移液管小心吸去培养液，注意移液管不要碰到细胞层，吸液时可将细胞瓶稍微倾斜。2. 吸取2-3mlPBS漂洗细胞，去掉残余血清并平衡盐离子。具体操作为：将PBS从背对着细胞层的一侧加入，倾斜培养瓶，让PBS溶液覆盖整个细胞表面，之后再把PBS溶液吸去。移液管注意不能碰到细胞层。3. 吸取1-1.5ml25%胰酶加入培养瓶，将细胞从培养平面上消化下来。具体操作为：将胰酶从背对着细胞层的一侧加入，倾斜培养瓶，让胰酶溶液覆盖整个细胞表面，默数5s之后迅速把胰酶溶液吸去，残留大约0.2ml胰酶在培养瓶中。移液管注意不能碰到细胞层。
8、将培养瓶盖上，左右倾斜培养瓶，让残余的一点点胰酶溶液再和细胞层反应。1min后轻轻拍打培养瓶侧面。如果肉眼能看见细胞层慢慢从培养平面脱落，则消化成功。否则，再加一点点新胰酶，重复操作。4. 吸去2ml左右完全DMEM培养液加入培养瓶，用移液管吸取培养液和残余胰酶混合物对着培养瓶底壁进行吹打，使以消化的细胞全部脱离瓶壁并分散开来。5. 根据培养的需要确定传代细胞的数量，将细胞悬浮液吸取到新的培养瓶中，再加入适量完全DMEM培养液，并再次吹打细胞。（培养液最终以盖住整个细胞培养瓶的培养面，深度3-4mm，并且不会沾染到培养瓶瓶口为准）6. 最后给新培养瓶做好标记，在超净台内将盖紧的培养瓶瓶盖旋松半
9、圈，然后放入培养箱。培养瓶瓶盖旋松是为了让培养箱内气体能进入培养瓶。2. 培养：不同细胞的培养条件略有不同，293细胞的培养条件是37，5%二氧化碳。细胞培养液中一般含有碳酸氢钠，通过跟二氧化碳的作用来维持培养液的Ph值。培养液中一般用酚红作为Ph指示剂，如果二氧化碳不通畅，培养液偏碱性，则呈现暗红色。二氧化碳通常，培养液偏酸性，呈现橙黄色。培养液偏碱性，会造成细胞无法生长或死亡。所以可以根据培养液颜色来判断瓶盖是否拧得过紧。细胞如果长时间不传代，每隔3天应该给细胞换次培养液。细胞的冻存和复苏（以293细胞为例）1. 冻存：冻存的细胞应该是处于良好的状态。1. 按传代方法把细胞悬浮。2. 将悬
10、浮的细胞进行1000转的低数离心，使细胞沉淀。3. 用含10%DMSO的完全培养基重新悬浮细胞，并把细胞混合液分装到冻存管中，管口最好用封口胶封住。4. 细胞逐步降温有两种方法：A.传统的先把盛放细胞混合液的冻存管放入410分钟，然后放负20，之后是负80过夜，最后移入液氮罐保存。B.把盛放细胞混合液的冻存管放入程序性降温盒，然后在盒子里灌满异丙醇，之后放入负80过夜，最后移入液氮罐保存。2. 复苏：1. 把从液氮罐里取出的冻存管迅速放入37的温水中，并不断摇晃冻存管，使其内部的细胞混合液融化。2. 将冻存管中的混合液移入15ml离心管中，打开冻存管之前要用酒精擦拭冻存管管口。在离心管内迅速加
11、入10ml完全培养液，并轻轻吹打使细胞混匀。3. 1000转离心5分钟，弃上清，再加入10ml完全培养液，吹打混匀。4. 1000转离心5分钟，弃上清。加入6ml完全培养液，吹打混匀后移入培养瓶内正常培养。5. 第二天要给细胞换液。细胞的计数和铺板（以293细胞为例)1. 计数：1. 将细胞计数板和盖玻片清洗干净，并用擦镜纸吸去表面的水滴。2. 把盖玻片盖在细胞计数板的计数区域。3. 将细胞按传代方法悬浮，反复吹打细胞悬浮液使细胞分散均。取15微升左右的细胞悬浮液加入细胞从盖玻片和细胞板贴合的边缘加入，使其慢慢充满盖玻片与细胞板之间的空隙，注意不要留有气泡。4. 把细胞计数板放至显微镜下进行细
12、胞计数。细胞计数板有上下两个区域，每个区域包含9个大格，每个大格又被划分为16个小格。选取一个大格，计数格中的细胞总数。压线的细胞只算上侧和左侧，不算右侧和下侧。每个大格的体积是0.1l，换算可得悬浮液的细胞浓度。2. 铺板（以24孔板为例）：1. 在24孔板每个板中加入0.5ml完全培养基。2. 将细胞悬浮液稀释至6105个细胞/ml，然后用1ml的枪吸取0.5ml细胞，将手抬高至枪头离细胞板3到4cm，缓慢的逐滴滴入孔中。滴液过程注意对准同一个孔的不同位置，以便让细胞分散得更均匀。3. 每滴完一个孔后，应该盖上24孔板，将整个板在超净台平面，水平的前后左右的轻微振荡一下。注意不能把细胞液振
13、到板盖或板子外面。4. 将接种好的24孔板放入培养箱培养。每个孔加入3105个细胞，是使24孔板经过12小时培养就可以盖满整个底面的细胞数量，根据实验的不同要求，可以调整加入的细胞量。其他孔板按照底面积换算。细胞培养常见问题及解决办法原因 解决办法培养基颜色偏紫培养基中溶解的二氧化碳不够 检查培养箱的二氧化碳水平以及确定是否培养瓶瓶口拧得过紧。细胞的状态应该在传一两次代以后才能完全恢复。微生物等造成污染在超净台内的操作过程污染 受污染的细胞要丢弃，培养箱和超净台要彻底消毒除菌。在同个超净台操作过的试剂（培养基等等），应该取一些放培养瓶或皿放入消毒后的培养箱培养一周，确定是否污染，污染了就必须扔
14、掉。如果细胞污染范围比较大，则整个细胞实验室都需要熏蒸消毒。离开超净台后暴露在空气中而受到污染 需要把污染的细胞扔掉细胞状态不好，生长缓慢，漂浮死细胞多培养基营养不够，Ph值不对 更换新的培养基培养，并传代一两次看细胞状态是否恢复二氧化碳浓度或温度不适 检查,校准培养箱传代细胞时胰酶过量或处理时间过长 调整浓度时间某些细胞对双抗耐受性较低，对外界环境比较敏感 审慎处理细胞培养大全第一章?细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因
15、工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（invitroculture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。组织培养：是指从生物
16、体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内
17、细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。第二节细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其
18、他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时
19、也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓
20、度也要定时检查。原代培养一般有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。四、冻存及复苏（可参阅后面有关章节）为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度196，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却
21、速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。五、常用仪器设备无菌室,超净工作台,三重纯水蒸馏器,抽气泵,压力蒸气消毒器,电热恒温培养箱,培养器具，CO2培养箱,恒温水浴锅,倒置显微镜,离心机,无菌过滤器,洗刷装置,细胞计数板和电子细胞技术仪等等。第三节细胞培养的无菌环境一、无菌室无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。无菌室的消毒和防污染：为保持无
22、菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（12小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。此外，还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。二、超净工作台工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。超净
23、台的使用与保养：超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射1030分钟，然后让超净台预工作1015分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。第四节常用培养器皿及清洗消毒细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。一、清洗离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。
24、因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。（一）玻璃器皿的清洗一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤。1、浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。2、刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。3、浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小
25、时，一般过夜或更长。放取器皿要小心。4、冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗23次，晾干或烘干后包装备用。（二）橡胶制品清洗新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/LNaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/LHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50烤干备用。（三）塑料制品的清洗塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50清洗液刷洗，流水冲洗，晾
26、干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（1520遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。（四）包装:对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。二、消毒和灭菌微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因（一）物理消毒法1、紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，
27、间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2米的30W灯可照射9平方米房间，每天照射23小时，期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。2、高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿
28、透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。3、高温干热消毒：干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160以上，并保持90120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。干热灭菌
29、后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。4、过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。（二）化学消毒：新洁而灭，其0.1水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生
30、物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。第二章细胞培养液现代生物技术均通过细胞作为载体来进行，无论是基因治疗、干细胞、克隆技术都在细胞内进行的。细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上
31、讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。随着动物细胞大规模培养技术的迅速发展，作为细胞培养领域中最基本的原料细胞培养基的用量也迅速增加，被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域，如疫苗生产（人用疫苗如乙脑、狂犬、甲肝、乙肝、出血热、麻疹等，兽用疫苗如口蹄、马立克、伪狂犬等），基因药物生产（如EPO、TPA等），临床用单抗（如抗人肝癌单抗、抗人肺单抗、WT3）等。第一节水与平衡盐溶液1、培养用水:体外培养的细胞对水质特别
32、敏感，对水的纯度要求较高。培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。最好用龙头瓶贮存，存放时间一般不应超过2周。2、缓冲溶液、生理盐水、平衡盐溶液：稍后介绍。第二节细胞培养基的基本要求体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。一、营养成分维持细胞生长的营养条件一般包括以下几个方面：1、氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源，同样也是合成
