1、经口毒性实验急性经口毒性试验Acute Oral Toxicity Test1 范围本方法规定了动物急性经口毒性试验的基本原则、技术和要求。本方法适用于评价化学品的急性毒性作用。2 规范性引用文件OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 401. Feb. 1987 )OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 425. Feb. 2001 )USEPA OPPTIS Health Effects Guideline (Series 870.1100 June 1996)3 试验目的3.1 检测化学品
2、对实验动物的急性毒性作用和强度。3.2 为亚急(慢)性等毒性试验提供剂量选择的依据。3.3 试验结果可作为化学品急性毒性分级和标签标识。 定义4.1 急性经口毒性(Acute Oral Toxicity): 一次或在24h内多次经口给予实验动物受试样品后，动物在短期内出现的健康损害效应。4.2 经口半数致死剂量（Oral Median Lethal Dose）: 经口一次或24h内多次经口给予受试样品后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。以单位体重接受受试样品的质量(mg/kg bw或g/kg bw)来表示。4.3 剂量-反应关系(Dose-response Relationshi
3、p)：表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。5 试验基本原则以经口灌胃法给予各试验组动物不同剂量的受试样品，每组用一个剂量，染毒剂量的选择可通过预试验确定。染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行大体解剖。本方法主要适用于啮齿类动物的研究，但也可用于非啮齿类动物的研究。6 试验方法6.1 受试样品的处理受试样品应溶解或悬浮于适宜的赋形剂中，（不溶性固体或颗粒状物质研磨、过100目筛）建议首选水或食用植物油（如玉米油）作溶剂，也可考虑使用其它赋形剂（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）等配成混悬液；不能配制成混悬液时，可配制
4、成其它形式(如糊状物等)，但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。如采用有毒性的溶剂应单设溶剂对照组观察。6.2 实验动物首选健康成年小鼠(18g22g)和大鼠(180g220g)，也可选用其它敏感动物。同性别实验动物个体间体重相差不得超过平均体重的20%。试验前动物要在试验环境中至少适应35d时间。6.3 剂量设计根据所选方法的要求，原则上应设45个剂量组，每组动物一般为10只，雌雄各半。各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜，通常以较大组距和较少量动物进行预试。如果受试样品毒性很低，也可采用最大限量法，即用20只动物（雌雄各半），采用5000mg/kg bw剂量，如未引起动物死亡，可不
5、再进行多个剂量的急性经口毒性试验。6.4 试验步骤6.4.1 试验前实验动物应禁食（一般16h左右），不限制饮水。若采用代谢率高的其它动物，禁食时间可以适当缩短。6.4.2 正式试验时，称量动物体重，随机分组，然后对各组动物用经口灌胃法一次染毒。各剂量组的灌胃体积应相同, 小鼠常用容量为20ml/kg bw，大鼠常用容量为10ml/kg bw。若一次给予容量太大，也可在24内分23次染毒（每次间隔4h6h），但合并作为一次剂量计算。染毒后继续禁食3h4h。若采用分批多次染毒，根据染毒间隔长短，必要时可给动物一定量的食物和水。6.4.3 观察期限及指标观察并记录染毒过程和观察期内的动物的中毒和死
6、亡情况。观察期限一般为14d，观察指标、LD50的计算及试验记录形式分别见附录1-A、1-B、1-D。对死亡动物进行尸检。观察期结束后，处死存活动物并进行大体解剖，如有必要，进行病理组织学检查。6.5 可采用多种方法测定LD50，建议采用霍恩氏法、寇氏法、概率单位-对数图解法、最大耐受量试验和上-下法等(见附录1-B)。7 鉴定报告鉴定报告应包括如下内容：7.1 受试样品名称、理化性状、配制方法、所用浓度；7.2 实验动物的种属、品系和来源（注明合格证号和动物级别）;7.3 实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、动物实验室合格证号；7.4 所用剂量和动物分组，每组所用动物性别、数量及
7、体重范围；7.5 染毒后动物中毒表现和死亡情况及出现时间，大体解剖及病理所见；7.6 计算LD50的方法及其LD50和95%可信限；7.7 列表报告结果（建议的表格形式见附录D）；7.8 结论。8 试验结果的解释通过急性经口毒性试验和LD50的测定可评价受试样品的急性经口毒性、急性经口毒性分级，其结果外推到人类的有效性很有限。亚急性经口（14/28d）毒性试验Sub-acute Oral Toxicity Test1 范围本规范规定了啮齿类动物亚急性经口（14/28d）毒性试验的基本原则、要求和方法。本规范适用于检测化学品的亚急性经口（14/28d）毒性。2 规范性引用文件 OECD Guid
8、elines for Testing of Chemicals （No.407，July 1995）3 试验目的为获得一定时期内反复多次经口染毒受试样品而引起的健康危害,以明确化学物对动物的蓄积作用及其靶器官，并确定其最大无作用剂量和最低有作用剂量，为亚慢性、慢性毒性或致癌试验的剂量设计提供依据。4 定义4.1 亚急性经口毒性（Subacute Oral Toxicity）：实验动物在1428天内，每日经口接触受试样品后所引起的健康损害效应。4.2 剂量（Dose）：是指经口给予受试样品的量，以重量g或mg表示，或是实验动物单位体重的受试样品的量（mg/kg bw）。4.3 蓄积毒性(Cumu
9、lative Toxicity)：受试样品在体内蓄积引起的有害作用，蓄积有两种形式：（1）物质蓄积，即长期反复接触受试样品时，由于吸收速度超过消除速度导致的该化学品在体内逐渐增多；（2）功能蓄积，即受试品虽然在体内的代谢和排出速度快，但其造成的损伤恢复慢，在前一次的损伤未恢复前又发生新的损伤，如此残留损伤的累积称为功能蓄积。4.4 无可见有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）：在规定的试验条件下，用现有的技术手段或检测指标未观察到任何与受试样品有关的毒性作用的最大染毒剂量。4.5 最低可见有害作用水平（Lowest Observed Adv
10、erse Effect Level，LOAEL）：在规定的试验条件下，受试样品引起实验动物形态、功能、生长发育等发生有害改变的最低染毒剂量。4.6 附加组（Satellite Group）：是在试验中增设的一组，该组实验动物数与其他组相同，染毒剂量与最高剂量组相同，在高剂量组染毒停止后需继续观察14d，以研究毒作用的可逆性、持续性和迟发效应。5 试验基本原则以不同剂量受试样品每日给各组实验动物连续经口染毒28d，但在某些情况下，也可进行染毒14d。染毒期间每日密切观察动物的毒性反应，期间死亡或试验结束被处死的动物要进行解剖。6 试验方法6.1受试样品根据试验的目的和受试样品的理化特性，经口染毒
11、可采用灌胃、或将受试样品混入饲料、饮水等方式。受试样品应溶解或悬浮于适宜的赋形剂中，建议首选水，其次是植物油（如玉米油），或考虑使用其它赋形剂（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）。对水以外的赋形剂，应先了解其毒理特性。应确定受试样品在溶质中的稳定性。6.2 实验动物和饲养环境6.2.1 实验动物一般首选健康成年大鼠，其它啮齿类动物也可使用。雌性动物应是未交配过的。大鼠以68周龄（150g左右）为宜，最大鼠龄不超过9 w。在试验开始时，同性别动物体重之间相差不得超过平均体重的20%。6.2.2 饲养环境试验前动物应在清洁级动物房试验环境中适应3d，再随机分配到各试验组和对照组中。动物最好单笼饲养，大
12、鼠群养时每笼不超过5只。动物实验室应符合国家相应规定。6.3 剂量设计动物应随机分配到试验组与对照组中。试验时至少设三个剂量组和一个对照组，还可增设一个附加组，每组实验动物至少应有10只（雌雄各半）。若计划在试验过程中处死动物，应增加动物数。最高染毒剂量的设计应为引起动物明显毒效应但不造成动物死亡，中间剂量应引起较轻的可观察到的毒性效应，低剂量应不出现任何毒效应。剂量组的剂量间距以24倍为宜。对照组除不接触受试样品外，其它条件应与染毒组完全相同。如果试验中接触水平超过每天1000mg/kg.bw尚不能引起可观察到的毒性反应，并且根据文献资料能证明类似结构的化学物质亦不产生明显毒性，就不需要用三
13、个剂量组来进行试验。经饮水或喂饲染毒，应以动物体重调整受试样品在水或饲料中的浓度。6.4 试验步骤每周染毒7d，连续28d。通过调整受试样品溶液浓度使各剂量组经口染毒的容量一致。以喂饲或饮水方式染毒，受试样品的混入应不影响正常的营养。应根据染毒剂量和动物体重配制饲料中受试样品的浓度（mg/kg）；灌胃染毒时，每周称体重一次，以作为调整受试样品给药量的依据。6.5 试验观察6.5.1 临床观察观察期限一般为28d,每天一次,观察并记录皮肤、被毛、眼、粘膜的改变和呼吸系统、循环系统、神经系统、肢体活动、行为方式等变化发生的时间、程度和持续时间。如发现动物死亡或濒危应及时解剖或冷藏后解剖检查，以减少
14、动物同类互残及死后组织自溶。6.5.2 体重和摄食量每日测量一次饲料或饮水消耗量,每周测体重一次。6.5.3 血液学检查试验结束时测定血红蛋白浓度、红细胞数、白细胞总数和分类、血球容积，必要时测定凝血功能如凝血时间、凝血酶原时间、凝血激酶时间或血小板等指标。血液标本应在专用实验室采取，并在适当条件下储存。6.5.4 临床血液生化检查在试验结束时进行。检查指标主要包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、白蛋白（Alb）、总蛋白(TP)。如有必要还应做电解质平衡、钙(Ca)、磷(P)、氯(Cl)、钠(Na)、钾(K)、空腹血糖(Glu)（禁食
15、时间要适当）、碱性磷酸酶(ALP)与总胆红素。在某些情况下，还须检测与肝或其它器官有关的酶和胆酸，以及脂类化合物、激素、高铁血红蛋白、胆碱脂酶(ChE)活性等分析。如出现肉眼可见的脏器改变，可增加与之相应的血液生化指标。还可增加其它脏器以进一步对观察到的毒性反应进行研究。6.5.5 尿液检查一般须进行尿液的常规检查，包括外观、pH值、尿蛋白、尿糖和血细胞。如尿样分析可作为预期或观察得到的毒性指标，则可增加有关的尿液检查项目。6.5.6 大体解剖所有动物皆应进行大体解剖。检查体表、体腔的各开口处，颅、胸、腹腔及其内容物。肝、肺、肾、肾上腺、睾丸(卵巢)、附睾、脾、脑、心脏等脏器应尽快称重，以防水
16、分丢失。计算脏器系数。6.5.7 病理组织学检查6.5.7.1 所有最高剂量组和对照组动物、大体解剖检查有异常的脏器或组织；6.5.7.2 如高剂量组动物的器官或组织有病理组织学的变化，则应检查中、低剂量组的相应器官和组织；6.5.7.3 各剂量组大体解剖有异常的器官和组织；6.5.7.4 附加组动物的被其它试验组证明有病变的器官和组织。6.6 结果统计与评价6.6.1 结果处理试验结果以表格形式总结，内容包括各组动物数、出现损伤的动物数、损伤的类型和每种损伤动物的百分比。采用适当的统计学方法进行评价。6.6.2 结果评价综合临床观察、临床检查、大体解剖、组织病理学检查的结果，对受试样品经口2
17、8天染毒有无毒作用及其毒作用特点，包括受试样品的靶器官、蓄积毒性等做出初步评价；对是否需要进行更长时间的毒理学试验及其剂量和观察指标提出建议。如发现试验组与对照组有显著性差异或能得出剂量效应或剂量反应曲线时，应对无可见有害作用剂量(NOAEL)和最低可见有害作用剂量(LOAEL)初步评价。7 鉴定报告除一般鉴定报告的内容外，还应包括以下方面：7.1 受试样品的配制方法：受试样品掺入饲料和水中的方法及剂量转换的有关计算公式。7.2 动物的分组情况及对照组的选择。染毒剂量的选择。7.3 各组动物染毒开始时间、试验开始时的平均体重、结束时间，染毒方法介绍，染毒过程的描述、染毒过程中动物体重的变化及动
18、物饲料、水的消耗量。7.4 观察次数及持续时间，依动物的性别、组别观察试验中症状出现、消失的时间，症状特点的文字描述，动物死亡及剖检的时间，处死动物的体重及各器官的重量，大体解剖及病理检查所见病变特点的详细文字描述，血液及生化结果并附参考正常值。7.5 各种效应的频数、发生率或均值及标准差。7.6 所用统计学分析方法及计算结果。7.7 可能时绘出剂量-效应或剂量-反应曲线。8 试验结果的解释本项试验结果可提供亚急性经口（28天）染毒的毒作用资料。其结果外推至人的有效性是有限的。亚慢性经口毒性试验Subchronic Oral Toxicity Test1 范围本规范规定了啮齿类动物亚慢性经口毒
19、性试验的基本原则、要求和方法。本规范适用于检测化学品的亚慢性经口毒性。2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (NO. 408, November 1998) USEPA OPPTES Health Effects Test Guidelines (Series 870.3150 June 1996)3 试验目的确定一定时期内经口反复接触受试化学物引起的毒性效应，了解受试样品毒作用的靶器官，取得受试样品亚慢性经口的最大无作用剂量，为确定慢性毒性试验的剂量和初步计算人群接触的安全水平提供依据。4 定义4.1 亚慢性经口毒性（Subchr
20、onic Oral Toxicity）：是指实验动物在其部分生存期（不超过10%寿命期）内，每日反复经口接触受试样品后所引起的健康损害效应。4.2无可见有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）：在规定的试验条件下，用现有的技术手段或检测指标未观察到任何与受试样品有关的毒性作用的最大染毒剂量。4.3最低可见有害作用水平（Lowest Observed Adverse Effect Level，LOAEL）：在规定的试验条件下，受试样品引起实验动物形态、功能、生长发育等发生有害改变的最低染毒剂量。4.4 靶器官(Target Organ)：实验动
21、物出现由受试样品引起的明显毒性作用的任何器官。5 试验基本原则各组实验动物每日经口摄入不同剂量的受试样品，连续染毒3个月（90d），有时候可根据需要染毒6个月（180d），染毒期间每日观察动物的毒性反应。在染毒期间死亡的动物要进行尸检。染毒结束后所有存活的动物均要处死、剖验以及作适当的病理组织学检查。6 试验方法6.1 受试样品 在开始本试验之前，应尽量搜集受试样品现有的各种资料。6.1.1 受试样品的商品名和其他名称（包括CAS号）。6.1.2 受试样品的结构式、分子式和分子量。6.1.3 受试样品的理化性质(可包括：外观、沸点、熔点、折射率、密度、光谱资料、溶解度、挥发性、化学活性、光化学
22、性质、电离度、粒度、密度等)。重要的参数还包括稳定性（包括在赋形剂或饲料中）。6.1.4 受试样品的分析方法。6.1.5 受试样品的生产方法、合成路线和杂质。6.1.6 储存方法要有长期储存受试样品（包括在赋形剂或饲料中）的合适方法。否则需定期制备新鲜样品。6.1.7 人类每日可能接触的水平6.1.8 接受样品的日期应登记。开始试验前应有适当数量的受试样品。样品来源和批号应相同，尽可能使用同一批生产的受试样品，否则，每一批受试样品的纯度和杂质要分别测定。6.2 实验动物和饲养环境6.2.1实验动物常规选择啮齿类动物，首选大鼠。动物断奶后尽早进行试验，尽量使动物在其体重快速增长期有更长的时间接触
23、受试样品。大鼠6周龄最好，不可超过8周龄（体重80120g，但动物体重的变动范围按性别不应超出平均体重的20%）。染毒开始前至少要有5d时间使实验动物适应清洁级动物房饲养环境，并在这段时间内观察实验动物的状态。6.2.2 环境设施 实验动物和动物试验的环境设施应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制。动物可分性别群饲或单笼饲养，群饲时每笼不超过5只。6.2.3 动物的性别和数量实验动物随机分组，每组至少20只，雌雄各半。但是考虑到亚慢性试验的重要性，应适当增加每组雌雄动物数。若计划在试验过程中处死动物，需增加计划处死的动物数。试验结束时的动物数需达到能够有效评价受试样品毒性作用的数量。6.
24、3 剂量设计 试验一般设三个染毒组和一个对照组。对照组动物不接触受试样品，其它条件均与染毒组相同。最高染毒剂量应使动物产生较明显的毒性效应,但不引起过多动物死亡(死亡率不应超过10%)，以免影响结果评价。低剂量组应不出现任何毒性作用。若掌握人群接触水平，则最低染毒剂量应高于人群的实际接触水平。如剂量设计得当，中剂量组可出现较轻的毒性效应，若设多个中剂量组时，应产生不同程度的毒性效应。此外，可另设一附加组作追踪观察，选用20只动物(雌雄各半)，给予最高剂量受试样品，染毒90d，在全程染毒结束后继续观察一段时间(一般不少于28d)，以了解毒性作用的持续性、可逆性或迟发毒作用；也可在试验设计时每组增
25、加一定的动物数，试验结束时每组剖杀部分动物（数量应满足统计分析），部分动物继续作追踪观察。若为染毒目的加入其它溶剂等赋形剂，这些赋形剂不应影响受试样品的吸收或引起毒性作用，必要时应设相应的赋形剂对照组。 如果受试样品的毒性较低，则加入饲料的受试样品比例较大，应注意混入饲料中的受试样品不应超过5%，否则会对动物正常营养产生影响。必要时应定期监测饲料或饮水中的受试样品浓度，观察其均匀性和稳定性。若采用灌胃方式染毒，则每日染毒时点应相同，并定期 (每周)按体重调整灌胃量，维持染毒剂量不变。其它的染毒方式要加以特殊说明。6.4 染毒方法 常用的方法是将受试样品混入饲料或饮水中，每周7d染毒。若受试样品
26、引起饲料和饮水的适口性不良，影响动物正常摄入量，或由于某种原因，受试样品不能加入饲料和饮水中，可采用灌胃法或药囊法，此时每周可染毒57d。试验期间各组动物染毒的方式应完全相同。6.5 限量试验 在试验中，如果剂量预期达每天1000 mg/kg或以上时仍未产生可观测到的毒性效应（但人类接触水平的资料表明需用高剂量进行试验），而且根据相关结构化合物可以预测受试样品毒性时，可不必设三个剂量水平进行试验。6.6 临床观察 试验期内每天至少观察一次，必要时增加观察次数。对附加组还要增加至少28d。 观察期间对动物的任何毒性表现均应记录，记录内容包括发生时间、程度和持续时间。观察应至少包括如下内容：皮肤和
27、被毛、眼和粘膜、呼吸、循环、植物神经和中枢神经系统、肢体运动和行为活动等改变。对死亡动物应进行解剖，对质弱或濒死动物应隔离或处死和解剖。记录每周饲料消耗量，经饮水染毒时还应记录每天饮水消耗量，记录每周体重变化。试验结束时处死动物作相关检查。6.7 临床检查6.7.1 眼科检查 建议在动物染毒前和染毒后，最好对所有实验动物，至少应对最高剂量组和对照组动物，使用眼科镜或其它有关设备进行眼科检查。若发现动物有眼科变化则应对所有动物进行检查。6.7.2 血常规检查和其它血液指标检查 至少应在染毒结束时进行，必要时应在染毒中期也进行检查。如设立附加组，染毒结束时如有异常的指标，附加组追踪观察结束时应进行
28、检查。测定指标至少应包括血球压积、血红蛋白浓度、红细胞数、血小板数、白细胞总数和分类，必要时测定网织红细胞数、凝血功能等指标。6.7.3 血液生化检查 至少应在染毒结束时进行，必要时应在染毒中期也进行检查。染毒结束时如有异常的指标，附加组追踪观察结束时应进行检查。检查指标包括肝功能、肾功能、电解质平衡、碳水化合物代谢等。测定指标至少应包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、总胆红素（TBIL）、白蛋白（ALB）、总蛋白(TP)等，还应根据受试样品可能的毒作用表现补充如下指标：如鸟氨酸脱羧酶、-谷
29、氨酰转肽酶、总胆固醇、甘油三酯、正铁血红蛋白、胆碱酯酶、钙、磷、氯、钠、钾、血糖等。此外，还可根据所观察到的毒性作用进行其它更大范围的临床生化检查，以便进行全面的毒性评价。6.7.4 尿液检查一般不需要进行，只有当怀疑存在或观察到相关毒性作用时才进行尿液检查。6.8 病理检查6.8.1 大体解剖 所有动物均应进行全面的大体解剖，内容包括动物的外观、体腔开口处、胸腔、腹腔等。肝、肾、肾上腺和睾丸等器官应在分离后尽快称重以防水分丢失。应将主要组织器官保存在固定液中，以备日后进行病理组织学检查。6.8.2 脏器称重 心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸的绝对重量和相对重量（脏器系数=脏器重量/体重100%）
30、为必测指标，必要时加测其它脏器重量和脏器系数。6.8.3 病理组织学检查通常至少应包括心、肝、脾、肾、胃、大脑、肺、睾丸（卵巢）、附睾、肾上腺等。根据需要，还可包括脑桥、小脑和大脑皮层、脑垂体、主动脉、气管、胰、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、膀胱、甲状腺（包括甲状旁腺）、胸腺、前列腺、子宫、乳腺、皮肤、肌肉、胸骨(包括骨髓)、淋巴结、眼球等。如果毒性作用提示或作为被研究的靶器官时还可选择检查唾液腺、生殖附属器官、皮肤、眼、股骨(包括关节面)、脊髓(包括颈部、胸部、腰部)、泪腺、雌性乳腺、大腿肌肉等。要先对高剂量组和对照组动物及系统解剖时发现的异常组织作详尽的组织学检查，其他剂量组一般仅在高
31、剂量组有异常发现时才进行组织学检查。在附加组，应对那些在染毒组呈现毒性作用的组织和器官进行检查。中、低剂量组动物也需做肺的病理组织学检查，肺部感染情况可判断动物的健康状况。必要时肝、肾也做同样的检查。6.9 结果统计与评价6.9.1 结果的处理 可通过表格形式总结试验结果，显示试验开始时各组动物数、出现毒性反应的动物数、毒性反应的类型和动物出现毒性反应的百分比。对所有数据应采用适当的统计学方法进行评价。6.9.2 试验结果的评价 亚慢性经口毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和解剖及病理组织学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试样品染毒剂量是否出现毒性反应、毒性反应的发生率及其程度之间的关系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见的损伤、靶器官、体重变化情况、死亡效应以及其它一般或特殊的毒性作用。成功的亚慢性试验应能够提出统计学上有意义的无可见有害作用水平（NOAEL）。7 鉴定报告除一般鉴定报告的内容外，还应包括以下方面：7.1 试验方法；7.2 按性别和剂量的毒性反应数据；7.3 试验期内动物死亡的数量和时间；7.4 毒性作用或其它作用；7.5 每种异常症状出现的时间及其转归情况；7.6 动物体重资料、食物摄入量和/或饮水量资料；7.7 眼科检查结果7.8 血液学检查结果；7.9 临床生化检查结果；7.10 大体解剖所见；7.11 病理组
