1、转基因大豆检测实验设计转基因大豆的检测实验设计生物技术安全评估 092012年5月前言3.实验一 大豆样品的准备 4实验二 大豆DNA的提取和纯化 4实验三 靶标基因的扩增 6实验四 反应产品检测 10实验五 结果分析 12参考文献12前言随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物（Genetically Modified Organism）及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。抗草甘膦（glyphosate）大豆（商品名，roundup ready soybean）是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、
2、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。基于核酸的检测技术主要有PCR 方法和基于PCR 原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR 等等。普通PCR 方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003 年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。这些标准涉及的转基因作物有大豆（SN/T 1195-2003）、玉米(SN/T 1196-2003)、棉花(SN/T 1199-2003)、油菜籽(SN/T 1197-2003)、烟草(SN/T
3、1200 -2003) 和马铃薯(SN/T 1198 -2003)。目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。随后在2004 年又制定了转基因定性检测的国标(GB/T 19495.4-2004)， 该国标中用的方法还是普通PCR。因此，普通PCR 方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。本实验以三种大豆为材料进行比较，通过对其DNA的提取和纯化，靶标基因的获取及琼脂糖电泳分析，从而鉴定所检测大豆样品。采用PCR检测转基因大豆的方法，主要是采用琼脂糖凝胶电泳法，首先检测CAMV-35S启动子进行筛选，然后检测EPSPS抗草甘膦基因。实验一 大豆样品的准备一 样品来源：（原始样品最小质量为：1
4、1200克）1、 阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质（IRMM-410R，Fluka公司）2、 进口转基因大豆样品3、 非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。二 样品加工过程：1、 构成原始样品（原始样品不得低于试验样品的4倍）2、 样品的初步处理（去皮、去壳、除水、除油等应记录初步处理前后样品的质量变化）3、 破碎和研磨4、 缩分5、 实验室样品的制备（实验室样品的最小质量不能小于原始样品最小质量的1/16）6、 存查样品和式样的制备实验二 大豆DNA的提取和纯化（CTAB法）一 实验目的掌握用CTAB法提取真核细胞总DNA的原理、步骤和注意事项。二 实验原理1、 CTAB(hexadec
5、yltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。2、 CTAB提取缓冲液各成分的作用：（1）Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏（2）EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,
6、抑制DNase活性（3）NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中（4）C-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因 组DNA（5）主要作用物质就是氯仿，所以它占有的比例较大，而异戊醇的主要就是防止起泡 泡。三 实验仪器和实验试剂1.仪器：水浴锅 离心机 EP管 电泳仪 研钵2.试剂: 去离子水 乙醇 氯仿-异戊醇 液氮CTAB缓冲液 ：CTAB 20g/L，Tris-HCI 0.1 mol/L(pH8. 0)， EDTA 0.02 mol/L.TE缓冲液：lo mmol/L Tris.，1 mmol/I, EDTA， pH8.0). 酶溶液：5g/
7、l.材料：阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质（IRMM-410R，Fluka公司）、进口转基因大豆样品和非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。四 实验步骤（三种材料分别进行）1、洗干净大豆叶片，用75%的酒精表面消毒3min, 用去离子水冲洗34次2. 称取1g叶片放入灭过菌的研体中，加入液氮捣碎，迅速转入2ml离心管中。3. 加入600l CTAB缓冲液，震荡均匀，65温育30min.4. 加入500ul 酚：三氯甲烷：异戊醇（25:24:1），振荡均匀，12000r/min， 离心15min。5. 吸取上清液，放入另一新管中，加入等体积的异丙醇，12000r/min，离心10min。6.
8、 弃去上清液，加入70%乙醇溶液洗涤，12000r/min，离心1min。7. 弃去上清液，干燥，用50l TE溶液溶解沉淀。8. 加入5l RNA酶溶液，37温育30min。9. 加入400l的CTAB溶液，振荡均匀。10. 加入250l的三氯甲烷：异戊醇，振荡均匀，12000r/min，离心15min。11. 吸取上清液，放入另一个新管中，加入200l的异丙醇，12000r/min， 离心10min。12. 弃去上清液，干燥，用50l TE缓冲液溶解沉淀。五 实验结果获取大豆的DNA。六 注意事项1. 研磨组织块用于DNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品
9、应用液氮速冻并贮于-70的冰箱中保存。2. 整个抽提过程，要尽量避免DNA酶的污染，全程配戴一次性手套，皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染DNA的抽提并成为DNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯，预防微生物污染。本实验亦可用试剂法。（takara公司：首页-产品分类目录-DNA Extraction Kit for GMO Detection）实验三 靶标基因的扩增一 大豆内源基因lectin的检测1、范围本方法规定了大豆物种特异性单拷贝基因序列的常规检测程序。本方法适用于评价从大豆加工产品中提取的DNA质量，并可判断是否有足量的DNA用于基因成分检测。2、原理通过PCR扩增的凝胶电泳分离
10、可得到大小为118bp的大豆Lectin基因片段。3、检测下限本方法能检测0.1ng的大豆DNA。4、试剂 一般要求按照GB/T 19495.12004的要求执行。水10 X PCR缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mmol/L.dNTP溶液：各2.5 mmol/L.引物：A、正向引物大豆Lectin基因（GeneBank? 编号：K00821）5-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3B、反向引物大豆Lectin基因（GeneBank? 编号：K00821）5-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3Taq酶：5 IU/L5、仪器：PCR仪
11、、 电泳仪6、PCR扩增PCR反应体系本方法中中，PCR反应的总体积为25L，反应体系见表A.1。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。表(A?)B.1 PCR反应体系试剂终浓度加样体积/L样品DNA10 ng50 ng1水15.910xPCR缓冲液（不含氯化镁）1x2.5氯化镁溶液（25 mmol/L）1.5 mmol/L1.5dNTP溶液（10 mmol/L）0.8 mmol/L2正向引物（5 mol/L）0.2mol/L1反向引物（5 mol/L）0.2mol/L1Taq酶（5 IU/L）0.5 IU0.1注：如PCR缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为
12、 1.5 mmol/L.PCR反应参数PCR反应参数见表A.2。使用不同的PCR仪，可对参数作适当地调整。表B(A?).2 PCR反应参数预变性10min，95C扩增20s，95C40s，60C40s，72C循环数40最终延伸3min，72C7、结果判断如果PCR产物通过电泳确证，可表述样品DNA溶液中含有来源于大豆的可扩增的DNA。二 转基因大豆DNA(CaMV 35S启动子)筛选检测方法1、范围本方法规定了CaMV 35S启动子不同拷贝数的定性PCR检测方法。本方法适用于转基因大豆CaMV 35S启动子的筛选检测。2、原理通过PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大小为195bp的CaMV 35S
13、启动子基因片段。3、检测下限本方法未确定绝对检测下限。相对检测下限可以检测含有0.1% (质量分数)转基因抗草甘磷大豆粉(IRMM-410)。4、试剂 一般要求按照GB/T 19495.12004的要求执行。水10 X PCR缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mmol/L.dNTP溶液：各2.5 mmol/L.引物：A、正向引物CaMV 35S启动子（GeneBank? 编号：V00141）5-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3B、反向引物CaMV 35S启动子（GeneBank? 编号：V00141）5-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3Taq酶
14、：5 IU/L限制性内切酶 Xmn I （=Asp 700）5、仪器：PCR仪、电泳仪6、PCR扩增PCR反应体系本方法中中，PCR反应的总体积为25L，反应体系见表B.1。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。表B.1 PCR反应体系试剂终浓度加样体积/L样品DNA10 ng50 ng1水15.910xPCR缓冲液（不含氯化镁）1x2.5氯化镁溶液（25 mmol/L）1.5 mmol/L1.5dNTP溶液（10 mmol/L）0.8 mmol/L2正向引物（5 mol/L）0.2mol/L1反向引物（5 mol/L）0.2mol/L1Taq酶（5 IU/L）0.5 IU0.1注：如PCR缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为 1.5 mmol/L.PCR反应参数
