1、分子生物学教案整理版第一章 绪论（2学时）本章重点分子生物学的研究内容。基本要点一、 分子生物学简史基因概念的发展遗传物质与蛋白质的对应关系DNA二级结构的发现DNA复制机制的发现半保留复制Jacob和Monod提出基因表达的操纵子模型遗传密码的破译分离限制性内切酶-重组DNA定向改变生物测序、PCR、分子杂交基因组计划和后基因组时代：1人类基因组计划的主要内容：遗传图分析；物理图分析；转录图分析；基因组序列测定；资料的储存与利用。2后基因组研究：功能基因组学；蛋白质组学。二、 分子生物学的研究内容分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。从分子
2、水平揭示生命的奥秘的学科。它的主要研究内容包括：生物大分子的结构与功能（结构分子生物学）基因表达的调控DNA重组技术基因组结构和功能，生物信息学三、分子生物学展望第二章 DNA与染色体（10学时）本章重点 1DNA双螺旋结构模型要点。2核小体的概念。3DNA的变性、复性及分子杂交。4基因组，基因家族。5DNA的转座。 本章难点DNA在真核细胞内的组装；基因家族；DNA的转座。基本要点一、 核酸的化学组成1 核苷酸中的碱基成分碱基： 嘌呤(A，G) 嘧啶（T，C，U）2戊糖与核苷 核苷酸（脱氧核苷酸）： 核苷（脱氧核苷）与磷酸通过酯键结合。3核苷酸的结构与命名核苷一磷酸（nucleoside m
3、onophosphate，NMP）核苷二磷酸（nucleoside diphosphate，NDP）核苷三磷酸（nucleoside triphosphate，NTP）环腺苷酸（cycle AMP，cAMP） 环鸟苷酸（cycle GMP，cGMP） 二、核酸的一级结构 1DNA和RNA的一级结构 四种核苷酸或脱氧核苷酸按照一定的排列顺序以3，5磷酸二酯键（phosphodiester linkage）相连形成的多聚核苷酸链或脱氧核苷酸（polydeoxy- nucleotides），称为核苷酸序列(也称为碱基序列)。脱氧核苷酸或核苷酸的连接具有严格的方向性，是前一核苷酸的-OH与下一位核苷酸
4、的5-位磷酸间形成3，5磷酸二酯键，构成一个没有分支的线性大分子。DNA的书写应从5到3。 2RNA与DNA的差别 戊糖成分是核糖不是脱氧核糖; 嘧啶为胞嘧啶和尿嘧啶而不含有胸腺嘧啶，U代替了DNA的T。DNA和RNA对遗传信息的携带和传递是依靠核苷酸中的碱基排列顺序变化而实现的。 三、DNA的空间结构与功能1DNA的二级结构双螺旋结构模型 的双螺旋结构的研究背景：Chargaff规则：=T，G=C；不同生物种属的DNA碱基组成不同，同一个体不同器官、不同组织的DNA具有相同的碱基组成。 双螺旋结构模型的要点： 是一反向平行的互补双链结构 亲水的脱氧核糖基和磷酸基骨架位于双链的外侧、而碱基位于
5、内侧，两条链的碱基互补配对， A-T形成两个氢键，G-C形成三个氢键。堆积的疏水性碱基平面与线性分子结构的长轴相垂直。两条链呈反平行走向，一条链，另一条链是。）。 DNA是右手螺旋结构 DNA线性长分子在小小的细胞核中折叠形成了一个右手螺旋式结构。螺旋直径为nm。螺旋每旋转一周包含了10对碱基，每个碱基的旋转角度为36。螺距为3.4nm；碱基平面之间的距离为0.34nm。DNA双螺旋分子存在一个大沟（major groove）和一个小沟（minor groove），目前认为这些沟状结构与蛋白质和DNA间的识别有关。DNA双螺旋结构稳定的维系 横向靠两条链间互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间
6、的疏水性堆积力维持，尤以碱基堆积力更为重要。2结构的多样性 B-DNA(atson-Crick模型结构)； Z-DNA； A-DNA。3DNA的超螺旋结构 DNA在双链螺旋式结构基础上，进一步折叠成为超级螺旋结构。正超螺旋、负超螺旋。四、核酸的理化性质及其应用1核酸的一般理化性质核酸具有较强的酸性。DNA是线性高分子，粘度极大，RNA分子远小于DNA，粘度也小得多。DNA分子在机械力的作用下易发生断裂。嘌呤和嘧啶环中均含有共轭双键，因此对波长260左右的紫外光有较强吸收。这是DNA和RNA定量最常用的方法。2的变性 变性 在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，DNA双螺旋结
7、构松散，变成单链。 加热是实验室最常用的DNA变性的方法。 DNA的增色效应（hyperchromic effect） 加热时，DNA双链解链过程中，内部的碱基暴露，对260nm波长紫外光吸收增加，DNA的A260增加，并与解链程度有一定的比例关系。这种关系称为DNA的增色效应（hyperchromic effect）。 解链曲线 连续加热DNA的过程中以温度对A260的关系作图，所得的曲线。从曲线中可以看出，DNA的变性从开始解链到完全解链，是在一个相当窄的温度内完成的，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50时的温度称为DNA的解链温度（融解温度）（melting temprature，
8、Tm）。在Tm时，核酸分子内50%的双链结构被解开。一种DNA分子的Tm值的大小与其所含碱基中的G+C比例相关，G+C比例越高，Tm值越高。Tm值计算公式：Tm69.3+0.41（%G+C）；20bp的寡核苷酸的Tm计算：Tm4（G+C）+2（A+T）。3的复性与分子杂交DNA复性变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火（annealing）。 DNA的复性速度受到温度的影响，复性时温度缓慢下降才可使其重新配对复性。如加热后，将其迅速冷却至以下，则几乎不可能发生复性。这一特性被用来保持DNA的变性状
9、态，一般认为，比Tm 低25的温度是DNA复性的最佳条件。核酸分子杂交（hybridization）不同来源的DNA单链分子（DNA或RNA）放在同一溶液中，只要含有大致相同的互补碱基序列，经过退火处理，能够重新形成杂种双螺旋，这个过程称为分子杂交。可以用来检验不同物种的同源序列或同源基因。双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子间，也可以发生在那些碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间。核酸分子探针用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知序列的多聚核苷酸的末端或全链就可以作为探针，探针的序列如果与DNA或RNA序列互补，就可以探知核酸分子。五、基因和基因组（一）、基
10、因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列。一个典型的真核基因包括：编码序列外显子(exon)；插入外显子之间的非编码序列内合子(intron)；5-端和3-端非翻译区(UTR) ；调控序列(可位于上述三种序列中)。绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。（二）、基因组(genome)一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。 人基因组3109(30亿bp)，共编码约3万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-Value Paradox)。 六、真核生
11、物基因组（一）、真核生物基因组的特点：真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中；真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(23)。（二）、真核基因组中DNA序列的分类1、高度重复序列(重复次数105)：如卫星DNA(Satellite DNA)。2、中度重复序列（1）中度重复序列的特点重复单位序列相似，但不完全一样；散在分布于基因组中；序列的长度和拷贝数非常不均一；中度重复序列一般具有种属特异性，可作为DNA标记；中度重复序列可能是转座元件(返座子)。（2）中度重复序列的分类长散在重复序列(long interspersed repeated segments) L
12、INES短散在重复序列(Short interspersed repeated segments) SINESSINES：长度105如人Alu序列LINEs：长度1000bp(可达7Kb),拷贝数104-105，如人LINEl。3、单拷贝序列(Unique Sequence)包括大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列。（三）、基因家族(gene family)一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因。可能由某一共同祖先基因(ancestral gene)经重复(duplication)和突变产生。基因家族的特点：基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联
13、重复基因(tandemly repeated genes)，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因 (Pseudogene)a1表示与a1相似的假基因。假基因分类。加工过的假基因(processed pseudogene)。典型的基因家族1tRNA基因 单倍体人基因组中1300个tRNA基因，tRNA基因簇。2rRNA基因l00 copyrRNA基因簇(重复单元28S、18S、5.8s-rRNA)3组蛋白基因30-40 copy定位：7q32-q36组蛋白基因簇(重复单位：H1，H2A，H2
14、B，H3、H4)特点：无intron，Poly(A)- RNA。 4珠蛋白基因类：16p13，基因簇(24Kb)：51213类：11p15，基因簇(60Kb)：5 GrAr3（四）、超基因家族(Supergene family ，Superfamily)由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同。（五）、人类基因组中的重复序列标记1、A1u序列 单倍体人基因组50万-100万拷贝，平均每隔3-6Kb就有一个Alu序列，人A1u序列长300bp：2130bp重复序列；+31bp间隔序列(中间)；两侧7-21bp正向重复(direct repeats)，返座子?Alu
15、序列广泛散布于人基因组，约90%已克隆的人基因含有Alu序列；Alu序列标志。2、可变数串联重复（Variable number tamdem repeat， VNTR）：又称小卫星DNA(minisatellite DNA)，由短重复单位(6-40bp)串联重复(6-100次以上)而成，多位于基因的非编码区，广泛分布。 VNTR多态性分子标记DNA指纹图（fingerprint）；小卫星DNA突变与肿瘤，H-Ras。3、短串联重复（short tandem repeat,STR） 又称微卫星DNA（microstallite DNA），是指2-6个核苷酸组成的重复单位串联重复(10-60次)
16、,两侧为特异的单拷贝序列，人基因组中每l0kb DNA序列至少一个STR序列。CAn，50，000-100，000拷贝新一代遗传标记，人类基因组研究，肿瘤，遗传病。七、 线粒体基因组人线粒体基因组的特点：1人线粒体基因组为16，569bp的双链闭环分子，一条链为重链(H链)，一条链为轻链(L链)，两条链均有编码功能，每个mtDNA分于编码13种蛋白质和24种结构RNA(22rRNA，2tRNA)。2线粒体DNA为母系遗传。3结构基因不含内含子，部分区域有基因重叠，因此病理性mtDNA突变更易发生。4mtDNA突变频率更高。5线粒体DNA突变的表型表达与核DNA不同。八、 细菌和病毒基因组（一）
17、、细菌基因组的特点1功能相关的几个结构基因往往串联在起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构。2结构基因中没有内含子，也无重叠现象。3细菌DNA大部分为编码序列。（二）、病毒基因组的特点1 每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA；2病毒核酸大小差别很大，3103一3106bp；3除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。4大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成。 5真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子。6有重叠基因。八、 染色质和染色体细胞分裂间期染色质(chromatin)分裂期染色体(chromosome
18、)（一）、染色质的基本单位核小体1核小体(nucleosome)结构 DNA绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各一对)核心外1.8周(146bp)，形成核小体核心颗粒。 两个核小体核心颗粒之间有Linker DNA(0-80bp)，核小体核心颗粒+Linker=核小体(长180-210bp)；核小 体DNA Ladder。2组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷富含Lys，Arg的核蛋白，与DNA有高亲和力。组蛋白分类：（1）核小体核心组蛋白，H2A，H2B，H3，H4。分子量较小(102-135aa)作用：盘绕DNA形成核小体 。（2）H1组蛋白：较大(220aa)，作用
19、：与Linker DNA结合后利于核小体稳定和更高级结构的形成。（二）、染色质的高级结构130nm染色质纤丝；2袢环结构(looped domain) ；3细胞分裂期染色体；分裂期染色体一对姐妹染色单体（Chromatid）。有丝分裂中期46条染色体按大小和形状排列的的光学显微镜图像称为人的染色体核型 (Karyotype)。（三）、染色体的结构要素 1着丝粒（centromere）:细胞分裂时染色体与仿锤丝相连结的部位，为染色体的正常分离所必需。 2端粒(telomere)：真核生物线状染色体分子末端的DNA区域端粒DNA的特点：（1）由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb)。人的端粒D
20、NA重复序列：TTAGGC。（2）端粒的末端都有一条12-16碱基的单链3端突出。端粒的作用：防止DNA末端降解，保证染色体的稳定性和功能。九、DNA的转座转座元件(Transposable element)：可移动的DNA元件(mobile DNA elements)，它是指那些可在DNA分子内或DNA分子间转移的DNA片段。转座：转座元件的转移过程。转座的特点：1转座后原来位置的转座元件序列仍然保留,但同时又把新合成的DNA 复本插入到另外一个位点。2 座过程需要转座酶(transposase).它催化断裂和重接两步连续的 过程(需要M2+)。3 座元件插入位置的两端有3-12bp的正向重
21、复序列(靶序列),它是由于转座酶错位切割DNA造成的.这种短正向重复序列是存在转座元件的特征。 转座元件的分类转座子(transposon)：通过DNA复制而转移的转座元件。逆转座子(retroposon)或返座子,通过RNA阶段实现转移的转座元件 (DNA RNA DNA 插入新位点)。逆转座子例：Alu.LINE1.逆假基因(retro-pseudogene)。转座的遗传效应：导致基因重排、插入、缺失。十、RNA的空间结构与功能1信使RNA的结构与功能 细胞核内合成的mRNA 初级产物比成熟的mRNA大得多，这种初级的RNA被称为不均一核RNA (Hetergeneou nuclear R
22、NA，hnRNA)，它们在细胞核内存在时间极短，经过剪接成为成熟的mRNA并移位到细胞质。成熟的mRNA由编码区和非编码区构成，它的结构特点如下：大多数的真核mRNA转录后在5-端加一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化的，这种m7G ppp N m结构被称为帽子结构(cap sequence)。帽子结构具有促进核蛋白体与mRNA的结合、加速翻译起始速度的作用，同时可以增强mRNA的稳定性。在真核mRNA的3末端，有一多聚腺苷酸(poly A)结构，通常称为多聚A尾。一般由数十个至一百几十个腺苷酸连接而成。poly A是RNA生成后加上去的。poly A与mRNA从核内向胞质的转位
23、及mRNA的稳定性有关。 各种mRNA的长短差别很大，mRNA分子的长短，决定翻译的蛋白质分子量的大小。各种RNA分子中，mRNA的半衰期最短，由几分钟到数小时不等，是细胞内蛋白质合成速度的调控点之一。 mRNA的功能是把核内DNA的碱基顺序(遗传信息)，按照碱基互补的原则，转录并转送至胞质，在蛋白质合成中用以翻译成蛋白质中氨基酸的排列顺序。mRNA分子上每3个核苷酸为一组，三联体密码(triplet code)。2转运RNA的结构与功能 转运RNA (transfer RNA，tRNA)是细胞内分子量最小的一类核酸，100多种tRNA都由70至90个核苷酸构成。tRNA的功能是在细胞蛋白质合
24、成过程中作为各种氨基酸的载体并将其转呈给mRNA。 tRNA的结构特点:分子中含10%20%的稀有碱基(rare bases)。稀有碱基是指除A、G、C、U外的一些碱基，包括双氢尿嘧啶(DHU)、假尿嘧啶(，pseudouridine)和甲基化的嘌呤(mG，mA)等(图3-12)。一般的嘧啶核苷以杂环上N-1与糖环的C-1连成糖苷键，假尿嘧啶核苷则用杂环上的C-5与糖环的C-1相连。tRNA核苷酸中存在局部互补配对的区域，可以形成局部双链，进而形成一种茎-环样(stem-loop)结构或发夹结构。中间不能配对的部分则膨出形成环状。tRNA形成三叶草形(cloverleaf pattern)二级
25、结构。DHU环和T环，以及反密码环。 反密码子(anticoden)与mRNA相应的三联体密码子碱基互补。例如负责转运酪氨酸的tRNA(tRNATyr)的反密码子5-GUA-3与mRNA上相应的三联体密码子5-UAC-3(编码酪氨酸)呈反向互补。 不同的tRNA依照其转运的氨基酸的差别，有不同的反密码子。 X射线衍射结构分析发现tRNA的共同三级结构是倒L型。3核蛋白体RNA的结构与功能 核蛋白体RNA(ribosomal RNA，rRNA)约占RNA总量的80%以上。rRNA与核蛋白体蛋白共同构成核蛋白体或称为核糖体(ribosome)，原核生物和真核生物的核蛋白体均由易解聚的大、小两个亚基
26、组成。 真核生物的核蛋白体小亚基由18S rRNA及30余种蛋白质构成；大亚基则由5S、5.8S、及28S三种rRNA加上近50种蛋白质构成。真核生物的18S rRNA的二级结构呈花状，形似40S小亚基，其中多个茎环结构为核蛋白体蛋白的结合和组装提供了结构基础。4其他小分子 细胞的不同部位还存在着另外一些小分子的RNA，它们分别被称为小核、小核仁、小胞质R等。这些小RNA分别参与hnRNA和rRNA的转运和加工。5核酶 某些RNA分子本身具有自我催化能力，可以完成rRNA的剪接。这种具有催化作用的被称为核酶（ribozyme）。 十一、核酸酶核酸酶（nucleases）是指所有可以水解核酸的酶
27、，在细胞内催化核酸的降解，以维持核酸（尤其是RNA）的水平与细胞功能相适应。 按照作用底物分： DNA酶（DNase）、RNA酶（RNase）。 核酸外切酶： 末端外切酶、末端外切酶 核酸内切酶： 作用于链的内部，其中一部分具有严格的序列依赖性（48 bp），称为限制性内切酶。 核酸酶在DNA重组技术中是不可缺少的重要工具，尤其是限制性核酸内切酶的应用更是所有基因人工改造的基础。第三章 DNA的复制与修复（6学时）基本要求1. 掌握与DNA复制、DNA损伤与修复、逆转录过程有关的基本概念。包括：半保留复制，半不连续复制，复制叉，复制子，岡崎片段，前导链，后随链，端粒，端粒酶等。2. 掌握复制的
28、过程，以及复制过程中涉及到的各种酶、蛋白因子；并掌握原核生物与真核生物复制的相同点与不同点。3. 掌握逆转录过程，熟悉逆转录酶的应用。4. 了解引起地中海贫血和镰形红细胞贫血的分子机制。重点DNA分子在生物体内的合成有三种方式：（1）DNA指导的DNA合成，也称复制，是细胞内DNA最主要的合成方式。遗传信息储存在DNA分子中，细胞增殖时，DNA通过复制使遗传信息从亲代传递到子代。（2）修复合成，即DNA受到损伤（突变）后进行修复，需要进行局部的DNA的合成，用以保证遗传信息的稳定遗传。（3）RNA指导的DNA合成，即反转录合成，是RNA病毒的复制形式，以RNA为模板，由逆转录酶催化合成DNA。
29、真核生物的DNA合成过程与原核生物基本相似，但机理尚不十分清楚，以原核生物为例介绍其复制过程。基本要点一、DNA的复制1. 中心法则：遗传信息从DNA通过转录流向RNA，RNA通过翻译指导合成蛋白质，这种遗传信息的传递规律称之中心法则。少数RNA也是遗传信息的贮存者，RNA能逆转录为DNA，是对中心法则的补充。2. 复制（replication）：即DNA的生物合成，以DNA为模板指导合成相同的DNA分子，使遗传信息从亲代传递到子代的过程。RNA病毒的遗传信息储存于RNA分子中，可进行RNA复制并反转录合成DNA。2. 半保留复制（semiconservative replication）：D
30、NA复制时，亲代DNA双螺旋结构解开，分别以解开的两股单链为模板，以dNTP(dATP、 dGTP 、dTTP 、dCTP)为原料，按照碱基互补的原则，合成与模板链互补的新链，从而形成两个子代DNA双链，其结构与亲代DNA双链完全一致。因子代DNA双链中的一股单链源自亲代，另一股单链为合成的新链，形成的双链与亲代双链的碱基序列完全一致，故称为半保留复制。4. 复制叉（replication fork）：原核生物DNA的复制从单一起点开始，双螺旋结构被打开，分开的两股单链分别作为新DNA合成的模板，DNA合成从起点开始双向单向进行，与单一起点相连的局部结构形状呈“Y”型，称复制叉结构。5. 半不连续复制：复制过程中，催化DNA 合成的DNA聚合酶只能催化核苷酸从53方向合成，以3 5链为模板时，新生的DNA以53方向连续合成；而以53为模板只能合成若干反向互补
