1、食品生物化学实验实习指导学生实验实训一 蛋白质的颜色反应一、目的1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。二、原理1.双缩脲反应 所谓双缩脲是指二分子尿素加热（约1800C）缩合的产物。此双缩脲在稀碱溶液中能与硫酸铜发生反应，生成紫红色络合物，所以称为双缩脲反应。反应式如下：一切蛋白质和含有两个肽键以上的多肽化合物都能与碱性硫酸铜发生反应，其反应性质及产生的颜色与双缩脲与CuSO4反应的结果一样，而且肽键越长显色越深，有粉红、紫红、蓝紫色。该反应常用于蛋白质的定性、定量分析。应当指出，该反应的干扰因素较
2、多，一些含有一个肽键和一个NH2CsNH2， -CH2NH2等基团的物质也有双缩脲反应，并且NH3对此反应具有严重干扰，因而NH3与铜离子可生成深蓝色的铜氨化合物，因此，可以说蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽2.茚三酮反应 除脯氨酸，羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的a氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物的存在。该反应分两步进行，
3、首先是氨基酸被氧化，产生CO2、NH3和醛，而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所生成的还原型茚三酮再与另一分子水合茚三酮及氨缩合生成有色物质。反应如下： 此反应的适宜pH值为57, 同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色，该反应十分灵敏，1：500000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，因此是一种常用的氨基酸定量方法。三、仪器设备 试管，试管架，吸量管，酒精灯，滴管，滤纸，电吹风等。四、试剂与材料1、蛋白质溶液：取5ml蛋清，用蒸溜水稀释至100ml，搅拌均匀后，用纱布过滤。2、尿素粉末 3、1%硫酸铜溶液 4、10%氢氧化钠溶液5、0.5%甘氨酸溶
4、液6、茚三酮水溶液 取0.1mg茚三酮溶于50ml水中，配制后应在两天内用完，放置过久，易变质失灵。7、0.1%茚三酮乙醇溶液 称取0.1g 茚三酮，溶于100ml 95%乙醇中，临用前配制。五、操作步骤1.蛋白质的双缩脲反应（1）取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火加热使尿素熔化，熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后，加10%NaOH溶液1ml，振荡混匀，再加入1%CuSO4溶液2滴，振荡之，观察出现粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。（2）取另一支试管，加1ml卵清蛋白质溶液和10%氢氧化钠溶液2ml，摇匀，再加1%CuSO4溶液2
5、滴，随加随摇，观察紫红色的出现。2.茚三酮反应（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和0.5%甘氨酸溶液各1ml，再各加入0.5ml0.1%茚三酮水溶液混匀，在沸水溶液中加热1-2min，观察颜色由粉红色变成紫红色再变蓝。（2）在一小片滤纸上滴1滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴0.1%的茚三酮乙醇溶液1滴，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点出现。六、注意事项1.蛋白质双缩脲反应时硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色Cu(OH)2，此外在碱溶液中氨或铵盐作用，生成深蓝色之络离子Cu(NH3)42+,妨碍此颜色反应观察。2.茚三酮反应必须在PH 57进行。实验实训四 酶的特性实验一、目的通过本实验了解
6、温度；pH对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂对酶的作用；酶的专一性。加深对酶的性质的认识。二、原理淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。 1温度对酶活力的影响 酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为3740，植物酶的最适温度为5060。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100，其活性并无明显改变，但在100的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活性，
7、但不能使酶失活。 2pH对酶活性的影响 酶的活力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为68。3.激活剂与抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响 酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。4.酶的专一性 酶具有高度的专一性。淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用Benedict试剂检查糖的还原性。三、仪器与设备 试管及试管架，恒温水浴锅，刻度吸管，滴管，50 ml锥形瓶四、试剂和材料1.
8、 新配制的溶于0.3氯化钠的0.3淀粉溶液250 ml； 2.稀释20倍的唾液 50 ml 用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流人量筒并稀释20.0倍（稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整），混匀备用。3.碘化钾碘溶液 50 ml 将碘化20g及碘10g溶于100 ml水中。使用前稀释10倍。4. 0.1 mol/L柠檬酸溶液400ml；5. 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液600ml；6. 1氯化钠溶液50 ml；7. 1硫酸铜溶液50 ml；8. l硫酸钠溶液50 ml；9.pH试纸 pH5、pH5.8、pH6.8、pH8四种；10.0.1淀粉溶液150 ml；11
9、. 2蔗糖溶液150 ml；12.溶于03氯化钠的1淀粉溶液（需新鲜配制）150 ml；13.蔗糖酶溶液 称取活性干酵母100g于研钵中，加入少许蒸馏水及石英砂，研磨提取1h，加蒸馏水定容至500ml。14.Benedict氏试剂 称取柠檬酸钠85 g，无水碳酸钠50 g于400 ml水中，另溶 8.5g硫酸铜溶于50 ml热水中，将冷却后硫酸铜溶液缓缓倾入檬酸钠无水碳酸钠溶液中，定容500ml。可长久保存。五、操作步骤1.温度对酶活性的影响取3支试管，编号后按下表加入试剂：管号123淀粉溶液(ml)1.51.51.5稀释唾液(ml)11-煮沸过的稀释唾液(ml)-1摇匀后，将1、3号两试管放
10、入37恒温水浴中，2号试管放入冰水中。10分钟后取出（将2号管内液体分为两半），用碘化钾碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放入37水浴中继续保温10分钟后，再用碘液实验，结果如何？2pH对酶活性的影响 取4个标有号码的50 ml锥形瓶。用吸管按下表添加0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1 mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.08.0的4种缓冲液。锥形瓶号码0.2mol/L磷酸氢二钠(ml)0.1mol/L柠檬酸(ml)pH15.154.855.026.053.955.837.722.286.849.720.288.0从4个锥形瓶中各
11、取缓冲液3 ml，分别注入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加05淀粉溶液2 ml和稀释200倍的唾液2 ml。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于37恒温水浴中保温。待向第4管加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾一碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加12滴碘化钾碘溶液。添加碘化钾碘溶液的时间间隔，从第1管起，亦均为1分钟。观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。3.激活剂与抑制剂对唾液淀粉酶的影响取4支试管按下表操作。管号12341%淀粉溶液（ml）1.
12、51.51.51.5稀释唾液（ml）0.50.50.50.51%硫酸铜溶液（ml）0.51%氯化钠溶液（ml）0.51%硫酸钠溶液（ml）0.5蒸馏水（ml）0.537恒温水浴，保温10分钟碘化钾碘溶液（ml）23232323现象*保温时间可以根据各入唾液淀粉酶活力调整4.酶的专一性实验（1）淀粉酶的专一性 按下表操作。管号1234561%淀粉溶液（滴）4442%蔗糖溶液（滴）444蔗糖酶溶液11煮沸过的蔗糖酶溶液（ml）11蒸馏水1137恒温水浴15分钟Benedict试剂（ml）111111沸水浴23分钟现象解释实验结果（提示：唾液除含淀粉酶外还含有少量麦芽糖酶）。（2）蔗糖酶的专一性 按
13、下表操作。管号1234561%淀粉溶液（滴）4442%蔗糖溶液（滴）444蔗糖酶溶液11煮沸过的蔗糖酶溶液（ml）11蒸馏水1137恒温水浴15分钟Benedict试剂（ml）111111沸水浴23分钟现象解释实验结果。附：实验结果总结（一）温度对酶活力的影响管号呈现的颜色解释结果122号剩一半3（二）pH对酶活力的影响管号呈现的颜色解释结果1234（三）唾液淀粉酶活化和抑制管号呈现的颜色解释结果第3管的意义1234（四）酶的专一性（1）淀粉酶的专一性管号现象解释结果123456（2）蔗糖酶的专一性管号现象解释结果123456实验实训五 维生素C含量的测定2，6-二氯酚靛酚滴定法一、目的掌握滴
14、定法测定Vc含量的原理和操作。二、原理维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。它是具有L系糖构型的不饱和多羟化合物，属于水溶性维生素。维生素C分布很广，植物的绿色部分及许多水果(桔类、草莓、山楂、辣椒等)的含量更为丰富。维生素C具有很强的还原性。在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，抗坏血酸易被氧化而破坏。在中性和微酸性环境中，抗坏血酸能将染料2，6二氯酚靛酚还原成无色的还原型2，6二氯酚靛酚。同时将抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸。氧化型的2，6二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。因此，当用2，6二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏
15、血酸尚末全部被氧化时，滴下的2，6二氯酚靛酚立即被还原成无色。但溶液中的抗坏血酸一但被氧化时，则滴下的2，6二氯酚靛酚立即使溶液呈现红色。所以，当溶液从无色转变成微红色时，即表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。从滴定时2，6二氯酚靛酚标淮溶液的消耗量，可以计算出被检物质中抗坏血酸的含量。该法简便易行，但有下列缺点：1在生物组织内和组织提取物内，抗坏血酸还能以脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的形式存在。它们同样地具有维生素C的生理作用，但不能将2，6二氯酚靛酚还原脱色。2生物组织提取物和生物体液中常合有其他还原性物质，其中有些也可在同样实验条件下使2，6二氯酚靛酚还原脱色。3在生物组
16、织提取物中，常有色素类物质存在，给滴定终点的观察造成困难。 三、仪器、试剂和材料1.仪器锥形瓶(50ml)，小研钵， 吸管(1ml、10ml)，漏斗，滤纸，容量瓶(100ml)， 微量滴定管(5ml)，分析天平，研钵。2.试剂和材料（1）松针、桔皮、新鲜水果或蔬菜。 （2）1草酸溶液：溶1g草酸于100ml蒸馏水中。（3）2草酸溶液：溶2g草酸于100ml蒸馏水中。（4）标准抗坏血酸溶液（0.1mg/ml）：溶解50.0mg纯抗坏血酸粉状结晶于1草酸中，然后稀释到500ml（棕色容量瓶）。在使用前临时配制。（5）1%盐酸溶液。（3）2，6二氯酚靛酚钠溶液：将50mg2，6二氯酚靛酚溶解于约20
17、0ml含有52mg碳酸氢钠的热水中。冷后，稀释到250ml。装入棕色瓶内。放在冰箱里保存。2，6二氯酚靛酚不稳定，每周必须重新配制。四、操作步骤1.提取（1）松针：洗干净，用纱布或吸水纸吸干表面水分。用分析天平准确地称取样品约1.0g。放入研钵中，加1盐酸溶液510ml，一起研磨。放置片刻，将提取液滤入50ml容量瓶。如此返复抽提23次。最后用1盐酸溶液稀释到刻度并混匀。每次量取5或10ml放入小锥形瓶内进行滴定。（2）新鲜蔬菜或水果样品：将用水冼净，用纱布或吸水纸吸干表面水分。用分析天平准确地称取样品约20.0g。放入研钵（或组织搅碎机）中，加2草酸溶液100ml，一起研磨（或打成浆状）。称
18、取浆状物5.0g，放入50ml容量瓶，用2草酸溶液稀释到刻度。静置10min，过滤（最初数毫升滤液弃去）。滤液备用。2.滴定（1）标准液滴定准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0ml（含0.1mg抗坏血酸）置100ml锥形瓶中，加9ml1%草酸，微量滴定管加0.1%2，6二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持15s即为终点。根据所用染料的体积计算出1毫升染料相当于多少mg抗坏血酸（K值）。（2）样液滴定准确吸取滤液2份，每份10.0ml，分别放入两个100ml锥形瓶中，滴定方法同标准液。同时用2%草酸溶液10ml做空白对照五、计算： 维生素C(mg/100g) m= (V-V0)KW100 式中：m100g样
19、品中含有抗坏血酸的质量（mg）；滴定样液时所用去染料的体积数（ml）；0滴定空白时所用去染料的体积数（ml）；每毫升染料相当于抗坏血酸的质量数（mg/ml）；通常为（0.088 mg/ml）10ml样液相当于含样品质量数（g）六、注意事项：1.样品提取时，用2草酸溶液可抑制抗坏血酸氧化酶，而1草酸溶液因浓度太低，不能抑制抗坏血酸氧化酶。2.滴定过程宜迅速，一般不能超过2min。3.滴定所用染料不应少于1ml或高于4ml，如果样品含抗坏血酸太高或太低，可酌量增减样液。实验实训七还原糖含量的测定3,5二硝基水杨酸比色法一、目的掌握3,5二硝基水杨酸比色法测定还原糖的原理及方法。二、原理植物体内的还
20、原糖，主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。在碱性条件下，还原糖与3,5二硝基水杨酸共热，3,5二硝基水杨酸被还原为3氨基5硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。三、仪器、试剂和材料1.仪器刻度试管，分光光度计、恒温水浴箱、大试管、25ml比色管、100ml容量瓶、500ml棕色容量瓶（1个）、100ml容量瓶（2个）、移液管(1ml 、2ml、10 ml)、50ml量筒（2个）、玻璃漏斗、快速过滤滤纸（1盒）、方格坐标纸（2张）
21、、天平。2.材料面粉、苹果3.试剂（1）1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移至100ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀备用（可冰箱内保存）。（2）3,5二硝基水杨酸试剂：将6.3g3,5二硝基水杨酸和262ml2mol/l NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水中，再加5g结晶苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。（3）2mol/l NaOH：准确称取40g NaOH，置于500ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解，加蒸馏水定容至500ml。四、操作步骤1.
22、葡萄糖标准曲线的制作取9支大试管（或25ml刻度试管），编号，按下表操作空白（0）12345678葡萄糖标准液（ml）00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.00.80.60.43,5二硝基水杨酸（ml）1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加热将各管摇匀，在沸水浴中加热5min冷却立即冷水浴冷却至室温蒸馏水加蒸馏水定容至25ml将各试管混匀，在540nm波长下，用空白（0号）管调零，分别读取18号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。2.样品中还原糖含量的测定（1）提取准确称取3g样品，置
23、于研钵中，加少量蒸馏水研磨成糊状，转移至100ml锥形瓶中，加50ml蒸馏水，搅拌均匀，置于50恒温水浴箱中保温20min，使还原糖浸出。过滤，用20ml蒸馏水清洗残渣，将两次滤液全部收集在100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为待测液。（2）显色和比色取4只大试管（或25ml刻度试管），编号，按下表操作123还原糖待测液111蒸馏水（ml）1113,5二硝基水杨酸（ml）1.51.51.5加热将各管摇匀，在沸水浴中加热5min冷却立即冷水浴冷却至室温蒸馏水加蒸馏水定容至25ml将各试管混匀，在540nm波长下，用标准内曲线空白（0号）管调零，分别读取13号管的吸光度。五、结果计算计
24、算待测样吸光度的平均值，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出样品中还原糖的百分含量。其中样品稀释倍数为：抽取液总体积/测定时取用体积六、注意事项标准曲线制作与样品还原糖含量应同时进行，一起显色和比色。实验实训十一琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制观察一、实验目的1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。二、实验原理存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥
25、珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。三、仪器、材料1、试剂（1）1/15 mol/l Na2HPO4溶液：称取Na2HPO42211.8g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。（2）1.5%琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g，用蒸馏水溶解并定容至100ml。（3）1%丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1g，用蒸馏水溶解并定容至100ml。（4）0.02%甲稀蓝溶液。（5）液体石蜡。2、器具（1）恒温水浴箱
26、（2）研钵或组织匀浆机3.材料猪心四、实验操作1.猪心制备液：称鲜猪心1.52.0g，放于组织匀浆机中，加入等体积的石英砂及1/15 mol/l Na2HPO4溶液34ml，研碎成浆，再加入1/15 mol/l Na2HPO4溶液67ml，放置1小时，不时摇动，离心，取上清液备用。2.取4支试管，编号并按下表操作：试剂管号猪心制备液（滴）1.5%琥珀酸钠溶液（滴）1%丙二酸钠溶液（滴）蒸馏水（滴）0.02%甲烯蓝15510225（先煮沸）510235555245105523.将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!）4.各管置于37水浴中，半小时内观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间，比较其速度并说明原因。然后将第1管用力摇动，观察其有何变化？为什么？五、思考题1、本实验中液体石蜡起什么作用?2、各管中的反应体系配好后为什么不能再摇动?3、制备肝浆时用磷酸缓冲液，可否换用蒸馏水，为什么？
