1、WB方法经验总结WB经验总结来源于丁香园论坛，由张慧慧长沙 湘雅附二推荐来dxy好多年了，这些年陆陆续续回复了一些帖子，可是回来回去，发现大家提的问题，还是那么几个，没有从根本上有所提高，确实出乎意料。看过很多总结经验的帖子，不知道该如何评价，要么抄书本，要么人云亦云，缺乏自己的东西，新手参考这些当然难获进益。实在受不了，这些混淆视听的东西，本人把这么多年的回复，略作整理完善拼凑成?WB实战指南?，欢送行家批评指正。首先，摆摆自己的经验。鄙人做WB有8、9年了，平均下来两天跑一张多的蛋白胶；文章嘛，凑数的单篇有上24+，一作单篇15+系国内完成；注：当年的IF，现在逐年递减没个标准。其次，由于
2、一些机缘的因素，在实验室WB体系完善的过程中，很多靠自己摸索；说实话，碰了一鼻子灰，差不多能碰到的问题都经历了，因此我敢写这样一个咚咚给大家分享。再次，我再强调一点，对我们这类人来说，实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求；如何缩短操作时间，使实验进行的更有效率也是我们所追求的，因此本文会针对两个普遍采用的却可以看成浪费时间的操作，Bradford法蛋白定量和立春红染膜做专门批判，这在以前的WB操作指南是绝无的，甚至叛离被视为经典的分子克隆。可是，请记住，经典是人定的。话不多废，开始：样品制备：变性条件SDS LB直接裂解：用常温或者高温预热过预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗
3、忘，LB久煮某些性质会改变的1*SDS LB或者略高1.5*直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDS LB都是过量的因此不一定要严格参考SDS LB稀释比；如果SDS LB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。这时候常规做法有两种，1. 再煮5min。常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；2.如果10min煮样后，仍然吸不起来，才适当增加SDS LB，继续煮；也可以对样品进行超声。煮样时间假设过长，蛋白会凝固，此时以失去继续WB的意义，请丢弃判断标
4、准：出现明显的蛋白沉淀和水分层此方法的缺点，SDS LB煮过的样品如果用来做IP，需要特殊方法，因此，这种制备方法制备的样品有使用局限。非变性裂解法不讨论诸如核抽提、亚细胞器别离等等了，其实类似裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。俺前boss nature文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20g/ml leupeptin, 10g/ml pepstatin A and 10 g/ml aprotinin)此裂解液可用于抽
5、提核蛋白，其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵，其实用0.5mM PMSF替代这三种就好了；如果还要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4现加现用，10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。此方法的优点：NaCl浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较为温和，便于随后的IP等试验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如0.15M生理盐浓度、0.3M、0.6M高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠及0.8-1.2M；0.3M及以下适合IP试验，0.6M及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细
6、胞。用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用于破坏核膜结构；可用到1%，但此时染色体会析出，沉淀粘稠。组织块裂解：组织块较大用匀浆的方法最适宜，现在有不少转头很小的匀浆器。当组织超微量的时候，比方50mg新鲜癌组织，我采用的方法是1. 低温剪搅碎，成肉糜状。2. 锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击控制力量，尽量防止弄破锡箔纸，进一步破碎；反复屡次。3. 用上述细胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用无血清培养基培养细胞，收集上清液用于WB检测；如果含量过低，需要用TCA沉淀富集。理论上，从普通培养基中收集分泌蛋白，此时对细胞生长条件的影响最小，是最正确的实验条件；但是这存在隐忧。因为含血清
7、的培养基中含有非常丰富的BSA牛血清白蛋白之类的蛋白质，除非你进一步别离纯化，否那么直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦，尤其当你的蛋白在60-46 kDa之间的时候；用“任何抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片非常强的信号。因为此区间蛋白主要是BSA浓度过于富*非特异性粘附“任意抗体，从而最终被识别。同理，采用SDS LB裂解细胞制备样品前，通常要用PBS洗涤，其目的之一是去除培养基中的BSA。采用无血清培养基收集细胞上去除了改变细胞的生理状态外可能激活未知信号途径，诸如AKT等，还会出现的问题是：1. 即使采用了无血清收集上清，仍然有大量杂蛋白，但相对好很多。2. 选用了上清，由于蛋白浓度太
8、稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。a. TCA沉淀对半定量操作要求非常高，因为很容易沉淀不充分或者离心操作丧失，尤其在离心过程，离心管的摆放非常讲究，要180度翻转离心两次。b。重新溶解时，由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。实际上，如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定量的WB实验检测不同样品间的差异。这里面有实验操作细节的麻烦经验之谈，我曾经参与的cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的数据是cell lysis；偶尔用到上清，也只是作为富集纯化该蛋白的原料，为进一步分析做准备。样
9、品制备完，应立即低温保存-20度短期几天；-80度长期；例外，IP用样品应直接进行IP，防止冻融破坏蛋白质间弱的相互作用。SDS LB煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS沉淀；SDS 4度就会沉淀，何况-80度。上样前应加热充分溶解，否那么从加样口向下拖带SDS LB不够，样品未充分溶解也会出现类似拖尾；上样过大也会。在样品制备过程中，另一个需要注意的问题是，从样品制备的起始阶段就要注意定量问题；WB本身系统误差有20%，太细微的差异经常忽略不计。细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织的大小称重开始，裂解液的体积都是精确定量的，操
10、作过程也尽量防止蛋白损失。有人会说可以电泳前蛋白定量，我将下一节讨论蛋白定量的不科学性，以及裂解液成分对定量的干扰。【补充1】：细胞有凋亡或生长速率差异时，有一个最直接的方法针对这个问题，实际上将细胞收集下来以后，经过离心，去除PBS，这时候你可以拿出事先准备好的标准体积去比对，误差小于50ul的因为标准品差值可以设定为50ul),所以根本上肉眼偏差至多只有10ul细胞体积，这种小差异在WB结果中可以忽略不计。其实标准品有多种好处，平时可以用于离心时平衡；可以废物利用一些用过的effendorf管。最好不要用纯水做标准品，我喜欢稀释一些SDS LB做标准品，因为有蓝黑色比照下，可以更精确估计体
11、积。这相比照测标准曲线，再一一读值还是快很多；蛋白电泳：电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。经验之谈，8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的影响都问题不大300KDa蛋白如何，没有尝试过。电泳一般采用恒流，45mA-55mA应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；此条件适合gibco model V16型，胶宽20cm。采用恒流的优点，保证最快速度完成电泳电压会逐渐增大，省时且减少扩散；但是由于电泳速度过
12、快时会发热而溶胶，所以你必须想方法散热。散热不好，条带出现波浪状。考前须知：1聚丙烯酰胺的30%母液会降解，要4度避光保存。2APS会失效，10%APS一般保质期才一个月左右。-20度分装长期保存。3注意Tris buff的PH值，以及平时所用的水的PH值。PH值改变会使带型非常怪异，所有蛋白和溴酚蓝压成一条细线即便在别离胶中，如果溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部4上下层式电泳装置假设漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装置漏液，那么装置处于短路状态，液体会过热。SDS-PAGE胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。5配胶用
13、玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净的害处很多。尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒摸上去疙疙瘩瘩，其害处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。如果是RNA的超薄胶，胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，非常难于去除；蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。玻板没洗净的另一个害处是，由中学物理知识可知，玻璃外表越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡夹在玻板和胶之间，这个关系不大；严重的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。为防止拔梳子时的错动，可在电泳缓冲
14、液中拔梳子比水更好，有SDS润滑。判断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；最好用洗洁精之类，洗衣粉、肥皂都不好用。6上样时，不要把tip深入胶孔过深或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头，可能会错开胶和玻板，样品会泄露。7未加样的孔应添加高浓度SDS LB平衡，否那么最外侧条带会拉宽变形。通常20ul样品含5ul 4*SDS LB，可用8-8.5ul 4*SDS LB平衡。同理，点marker的lane也要参加同样体积的LB。LB假设在室温放置太久和新鲜的在比重上会有差异，在新旧LB靠近的地方，条带会拉宽或挤压变形。因此，同一块胶上，煮样及填空白所用LB应一致。LB应-20度保存。8增加上
15、样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰。增加上样量的另一个害处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭一晃而灭或者条带中空。仍以6孔板80%以上集合度为例，细胞裂解液和SDS LB通常都是投入200ul最少80ul，这样面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致，而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6u
16、l，最少2.5ul，最多10ul，10ul时内参根本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不可以多上样，再多对WB结果影响不大没有的仍然没有，且条带都很丑。9. 不同样品上样时，可考虑将样品体积调成一致或类似。如果一组IP样品和一组细胞裂解液样品，前者通常洗脱体积为15ul，刚好+5ul 4*SDS LB到达常规20ul上样体积；后者第8点提到只上5ul，同样+5ul SDS LB比重同，不会互相挤压，最好补加10ul DDW使总体积一致。通常这样不同条件获得的样品，中间最好用“空白泳道隔开空白仅指无蛋白，仍应参加8-8.5ul 4*SDS LB，这样才能确保每条带都很美观。10. S
17、DS PAGE胶配好暂时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间拔去梳子和底边边条后的间隙，用保鲜膜包裹防止液体蒸发，短期室温或稍长期4度保存。个人习惯为，灌好别离胶用饱和的正丁醇灌满上层，保鲜膜包裹，次日再灌堆积胶。两种方案都可以。所以如果预计次日工作量较大，可以提前灌好SDS PAGE。样品是否一定需要定量再上样？不是的，这是浪费时间的一个操作。我们首先来讨论一下蛋白定量的科学性。蛋白定量首先需要一个参照系标准蛋白，参照蛋白通常选择BSA，也就是说你所谓的定量是对应于BSA的浓度的一个参照值。这里面存在一个问题，即忽略了蛋白折叠和空间构象对光吸收、折射的影响；不同的蛋白折叠和构象还会影响颜料分子的嵌
18、入。因此你其实默认将所有的蛋白等同于BSA在溶液中的折叠状态、光吸收情况下，然后做出的一个相对判断，这就存在一个“系统误差还不算上测量误差等等，就已经很不准确了。其次，裂解组织或细胞的时候，那些裂解液中，某些溶剂本身会使Coomassie G250或者Bradford法实际也是Coomassie染色显色，尤其是去污剂之类；例如NP40，就会使Coomassie显蓝色，可以完全覆盖掉蛋白与Coomassie作用产生的蓝色。因此，如果你的裂解液里面含有这类物质，所谓的蛋白定量实际是NP40颜色和蛋白染色的叠加，根本不会符合标准蛋白曲线的线性规律，自然定不准。【需要说明：我目前只知道NP40会这样，
19、因为我们从来不去定量，没有做过更深入的研究。】实际上保证你的内参一致，是从样品制备开始的，上节末尾有提到，不赘述。如果你从制备样品时就注意过定量问题，实际上通常内参差异不会太大。如果真的有差异，通常我们会先跑少量的样品，目的是让Actin或tubulin更清晰、不会粘连、不会过曝光。从而在第二轮跑正式结果前，根据第一轮的内参的荧光信号做微调，大致能做到相当；最多可能需要第三轮。以上的试验可以精确到0.1ul差异我很多体外生化试验之前的调整酶量就是这样进行，此时根本不可能有足够的蛋白让你去定量。当然凭曝光强弱调整上样量的前提是，你的WB技术很稳定，很可靠，这是需要相当多的经验积累，如果你一时掌握
20、不了，可以让经验更丰富的师兄师姐或者导师帮助。顺便提到，有人问过用Quantity One等定量软件对光密度定量后计算差异从而调整上样体积是否可以？不可以。 因为WB结果经过多重放大，精确计量只代表相对于对照组的相比照值，与实际比值还是有误差，所以按计算值更改上样量仍会出现偏差。如果非要做定量的话，要注意你的裂解液配方，把每种溶剂都先参加到显色液中尝试一下，防止那些本身会显色的物质出现在你的裂解液中；当然，某些物质的去除可能影响对组织蛋白的提取。所以这是一个两难的问题。转印转印效率对WB结果的影响并不如书本和网络上宣扬的那么大！首先必须澄清的是，很多时候新手会把WB结果无信号归咎于转膜不够充分
21、，实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高，真正取决定性因素的是抗体识别能力的强弱，以及如何正确使用抗体，这个问题下节讨论。有一个简单的例证，Biorad提供的3mm厚滤纸初次使用时，通常转膜效果不理想从预染的marker深浅可知，但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响建议少用这种新滤纸做那种含量特别稀少或者转膜非常困难的蛋白。没有很好的策略可以解决这个新滤纸的问题；尝试过浸泡会泡烂的、预电泳会稍微好点等等，效果均不理想。通常，最初一两次的使用就是用于转一般蛋白。每次用完后清水稍微冲洗一下外表盐分要控制水流；水流太大，纸张会烂掉的，晾干再用；只要没冲烂可以一直反复使用。其次，尽管转膜效率
22、不起决定性作用，但由于WB的流程相对较长，所以每个步骤的叠加作用会被级数放大，因此在试验的每个步骤我们仍会力求更好，因此以下仍会深入探讨如何提高转膜效率。针对提高转膜的效率，个人认为最先应该考虑到的是仪器的选用。这里不是歧视“made in China，国内的厂家很少注重不断提高自己产品的品质，走低端策略，对于电泳仪这种技术含量不高的仪器倒可以凑合；但说到转膜仪，能把一个简单的匀场电极做好的还真不多就我道听途说的，国外厂家为了使电极之间场强更加均匀，那种大块金属板外表是镀过极薄的白金层；因此转膜效率和均匀方面孰优孰劣不言而喻。目前，个人使用过的国产电转槽湿转唯Tanon仿Biorad的还可以算
23、替它们免费打个广告吧，Tanon仿biorad mini3型电泳仪，在某些方面主要是操作上还优于Biorad原装；目前我认为“中国制造的灵魂就是仿造并超越前者；半干转仪一律进口，用过Biorad、amersham和英国公司的scieplas。PS：批评一下Biorad。Biorad的半干转仪，其硬质塑料外壳会莫名其妙的碎裂绝非摔裂、磕碰，因为底面一般放在桌上后除定期需要清洗去除残留盐渍，根本不会移动；即便如此它自然就会碎裂，以致于其核心组件未坏的情况下，因外壳碎裂不得不报废该仪器其外壳里包裹电源线，外壳碎裂，电源那么无法接通，导致仪器报废我们先后买过3台都是这样的毛病，其间间隔了3年，不能肯定
24、近来Biorad有没有改进这个问题；如果没有，我想市场迟早会被其他公司所取代对这三款产品，Biorad的外壳有明显的质量缺陷，容易过早报废；amersham独特的蜂窝式设计确实对转膜效率有所提高，但蜂窝式使得与“三明治的接触面减少，电转时散热不太好，做大蛋白半干转仪也可以做大蛋白转膜，效率确实不如湿转，但抗体好、蛋白丰度一般时仍可采用长时程3hrs转膜需要在4度冰柜或cold room进行；英国的产品，价格较高，公司不太知名国内不一定有代理，但质量和散热都非常好。这里谈到了半干转和湿转。这两种转印方法各有优劣。湿转适合所有的蛋白，转膜效率最正确，但靡费试剂、溶液，对普通分子量大小的蛋白转染操作
25、时间长于半干转下文会具体给出条件；半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。蛋白分子大小如何界定呢？习惯上认为150KDa以上为大蛋白，其他均属于小蛋白，当然这只是一个相对标准。因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转，那么刚刚提到的amersham半干转仪的缺陷实际上没太多实质意义，何况还可以外加条件弥补；而且用半干转做大蛋白转印本来就是高手在悬崖上跳舞，此时转膜效率是否更高已经没有任何意义我说过转印效率对WB结果不起决定因素。湿转、半干转缓冲液配方请参考分子克隆，有必要指出的是，实际上用半干转缓冲液进行湿转效果也非常理想，通常这种缓冲液可以反复使用屡次30V，35V附近的时候，保险
26、会自动跳掉、切断电转仪电源。至于UK的，即使整张大板胶室温电转3hr以后，最大电压仍为18V因此足见其散热性能的优良。注明：以上半干转仪时间的要求是针对PVDF膜的，这里面有一个很有趣的问题。尽管厂家一再说明PVDF膜比NC膜对蛋白的截留更高但NC带负电性，理论上它的吸附量应该更高，所以通常同样使用TBST这种低盐洗液背景比PVDF膜高，但PVDF膜对小分子的截留明显不如NC膜，因此交联在预染marker上的颜料小分子很容易穿过PVDF膜，造成转膜过度的假象除可考虑提升甲醇浓度至25%外，也可以考虑增加marker的上样量；NC膜没有这种问题，所以通常它的转膜时间也是小蛋白1hr、大蛋白3hr
27、s，电流控制在200-300mA16cm*9cm大胶300mA，如果胶面积小很多可以考虑降低，实际上相当于2.5-3mA/cm2左右。NC膜唯一不如PVDF膜的地方，在我看来是它的强度：枯燥的膜易碎。当然目前某些厂家为解决这个问题，将NC成分涂在另一种介质的外表，这种膜的支持强度和PVDF膜类似，但转膜效率稍差于纯NC膜，且有明显的正反面；因此制作转印三明治的时候要特别注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22uM孔径的转印膜，但也不是一定必须。对于大蛋白转印，很多书本建议采用低浓度胶，如6% SDS-PAGE。但实际操作发现，6%太软，制作转印三明治的操作非常麻烦；且内参如Acti
28、n、tubulin都在45KDa附近，而6%胶底边溴酚蓝指示60KDa左右，除非采用坛子上有人提过的灌不同浓度的胶或者梯度胶，否那么需要同时跑两块胶，因此也不是很推荐。个人经验认为300KDa以下8%胶底边36KDa都可以胜任，可以适当调整选择7-8%胶可以兼顾内参和大蛋白。转膜最好在低温进行高温会局部溶胶或降低转膜效率，尽管很多半干转仪没有具体要求，但用预冷过的电转液湿滤纸比未预冷的转印效率更高。因此，有条件建议湿转、半干转均在低温4度进行。此外，湿转缓冲液可以考虑转印前-20度预冷，时间不能长于2hrs，否那么电泳液冻结；mini3型有内置冰槽的，冰槽置-80度预冷。制作转膜三明治的过程中
29、，书中强调过滤纸、胶、膜的大小最好一致，否那么没有胶、膜隔开局部的滤纸会因为直接接触而产生局部短路，降低内阻增加电压流，造成升温过快。但进口仪器随厂原包装附带的滤纸有限，如果每次都切割新滤纸，消耗过快、初次使用的膜转膜效率不高，且增加额外的操作。因此，实际上滤纸大一些也不太要紧，但是我会选择已经切割好的和胶面积最接近的滤纸；通常膜的大小会严格控制在与胶面积一致或略小一点点。操作时在保证每一层均无气泡的前提下，叠好后再碾压几个来回，力道要均匀、恰好；力量过大，胶会被拉伸，条带会扭曲、变形。碾压的目的不是为了驱赶气泡完全可以做到叠加的时候每一层都无任何气泡；诸如采用多层薄滤纸时可以一张张的叠加，更
30、重要的作用是让膜和胶贴得更紧密。可以理解的是，对于蛋白分子的大小而言，胶和膜之间的间距是数十万倍计的，因此更紧密的接触无疑是转膜成败的关键。胶和膜需不需要泡呢？不少公司实验讲座时提出泡胶、泡膜，实际操作中没有发现泡和不泡的转膜效率有多大差异。实际上，胶只需要在电转液中浸一下即可可以减少与滤纸或者膜之间的气泡；而膜也只要湿掉沾上电转液即可，同样多沾些缓冲液会有利于减少气泡PVDF要先用甲醇湿润再投入缓冲液；NC直接进缓冲液。如何监控转膜的效率呢？在早期，鄙人亦依据分子克隆的介绍，采用立春红染膜。只是后来发现此操作不仅增加额外的操作时间，而且不能说明任何问题，于是抛弃之。首先，立春红也包括考染胶的
31、灵敏度和HRP-ECL体系的灵敏度相差太远，即使立春红染膜无颜色，也无法提示WB结果会不会失败考染胶无颜色也不能说明转膜充分了，除非你银染，你仍然得继续后面的操作；相反靶蛋白区域有颜色，亦无法提示靶蛋白就转膜完全了，也许只是另外一个分子量大小相近的蛋白。因此，无论立春红染膜失败或成功，你都必须进行后续的操作。而立春红染胶不仅增加额外的操作时间，而且增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白都不好。那么为什么不采用更直观的预染marker做转膜监控的依据呢？理论上，同时转膜、颜色是交联到蛋白上的，因此颜色有多深说明有多少蛋白转印到膜上，非常直观、不会增加任何额外的操作固定marker的上样量非常必要。
32、当然上面提到针对PVDF膜，由于对小分子截留的局限，颜料分子会在高强度的转印过程中从交联的蛋白上脱落并穿过膜颜料与蛋白交联得过深会使整个lane糊掉；太紧多可改变蛋白构象使迁移率改变。所以多数情况下颜料和蛋白之间是一种不稳定的交联，这意味着在某些条件下，颜料会从交联的蛋白上脱落，又因为膜分子孔径以及膜对不同物质吸附能力的差异，颜料小分子会轻易穿过膜到滤纸反面，而蛋白那么被牢固的截留在膜上，造成转膜过度的假象。现在你知道有这种局限，要么更换NC膜；要么采用上面提到的非常稳定的转膜条件、注意必要的细节，就可从根本上忽略掉其对转膜效率的指示，而把预染的marker仅仅作为一个分子量大小的指针，当然同时可确认之前的转膜操作无误没有插反电极，放反膜，也可为后续抗体孵育操作时膜的正反面做必要的提示。不同公司预染的mar
