1、第四章遗传毒物在体内的代谢转化p71 第四章遗传毒物在体内的代谢转化 第一节几个基本概念 包括环境遗传毒物在内的外源化学物的体内代谢转化过程，对于毒理作用的表现十分重要。遗传毒物的代谢转化取决于许多因素，首先是不同物种在代谢途径和代谢能力方面的种属差异，对这个问题的了解将极大地影响我们将动物实验数据向人类作出的合理外推；其次，个体的年龄、性别、营养和健康状况等方面的不同，也会影响到代谢能力差异；特别重要的是不同个体遗传背景方面的差异，不同人种集团(group)或不同地域居民群体问，甚至同一群体内不同个体间与代谢有关基因多态性结构或频率分布特征的差异，都将会导致不同个体经历同一毒物同一剂量水平暴
2、露后生理反应的明显差异1。1生物转化(biotransformation) 环境物质，包括众多遗传毒物，通过消化道、呼吸道和皮肤等途径进入机体后，在体内不同酶系的催化下会发生一系列生物化学反应，使得物质化学结构发生变化，这个过程称为生物转化，也有称为代谢转化的。参与催化外源物质生物转化的酶称为外源物质代谢酶。由于生物体面临的化学外环境千变万化，在质的构成和量的水平上都处于动态变化中，特别是相当一部分环境化学物是原先自然界所没有的，主要是从西方工业革命开始以来的几百年内，尤其是进入20世纪以后，作为人类活动的结果才引入地球环境的。适应于这样的外环境条件，生物体外源物质代谢酶有以下几个鲜明特点：一
3、般都具有较广的底物谱，底物专一性一般不是非常严格，可以催化结构相关甚至并不相关的许多化合物的同一种或同一类代谢反应。NN基N-般都构成家族或超家族，家族内不同成员编码的产物(同工酶)，各有其最适底物谱，其底物谱之间又互相覆盖。除了个别基因在体内是以“构成形”稳定表达外，不少是受诱导后才表达的，即遵循“需要才生产”的“经济原则”。2代谢减毒(metabolic detoxification) 人体每天通过食物、饮水、呼吸或皮肤接触吸收的环境有害物质，包括各种遗传毒物，主要通过尿液和胆汁两大途径排出体外，上述两大排出途径都要求被排除物质具有一定水溶性，实际上除了少数环境遗传毒物本身具有较大极性外，
4、绝大多数是高脂溶性，必须通过代谢反应改变分子结构以便增加极性。一般说来，为了达到有效的减毒，代谢过程往往具备(或部分具备)以下特征：代谢产物必须有足够的水溶性。代谢产物对机体有害效应较弱，不至于造成严重的毒理作用。有关的酶系必须具有较广的底物谱。并非所有的代谢过程都能导致外源物质毒性的减弱或消除，在有些情况下，代谢过程恰恰使代谢物的毒性比母体化学物更高，或表现新的毒理效应。p723生物活化( bioactivation) 生物活化又称代谢活化( metabolic activation)遗传毒性物质或其代谢中间物分子的亲电子中心和遗传物质DNA链上的亲核中心产生共价结合是启动(initiati
5、on)化学致癌作用的关键事件，在癌的促进( promotion)和进展(progression)中也起到一定的作用。大量的化学致癌物在环境中是以“前致癌剂”的形式存在的，必须通过体内代谢，转化为亲电子的“最终致癌剂”( ultimate carcinogen)才得以表现致癌活性。4代谢基本过程 遗传毒性物质在体内的代谢过程基本上可分为两大阶段，即所谓的工相反应和相反应过程（表4 -1）。外源化学物质的体内代谢通常是通过环环相扣的一系列步骤完成的。通过和某些内源性物质，如还原型谷胱甘肽、葡糖醛酸等的结合来增加水溶性，结合作用要求化合物分子上具有适当的功能基团，这些功能基团必须通过专门的代谢步骤引
6、入或予以暴露，这个功能基团化的过程通常就称之为工相反应，随之的结合反应则称之为相反应。根据所引入或予以暴露的功能基团的性质，这些基团又可分为亲电子的和亲核的两大类，环氧桥（环氧化基团）和a，一不饱和羰基是典型的带亲电子碳原子的结构；醇羟基和酚羟基，氨基和巯基以及羧基是重要的亲核基团。亲电子基团由于容易和富电子对象，如脱氧核糖核酸、核糖核酸以及蛋白质等生物大分子结合，导致致突变性和细胞毒性，一般说来，亲核物质不与体内生物大分子共价结合，对生物体危害效应一般也比较小。相结合反应通常终止了亲电子物质和DNA以及蛋白质共价结合或与受体结合的能力，同时提高了分子极性，加速了毒物被排出体外的速度，相反应在
7、大多数情况下代表了机体的减毒倾向2。表4-1遗传毒性物质基本代谢过程 I相代谢反应 相代谢反应 定义 主要包括的反应类型 定义主要包括的反应类型将非极性，脂溶性的物质转变为更具极性的物质，通过I相反应引入相应的功能基团，为下一步相反应的结合反应创造条件1氧化反应：环氧化作用、羟基化作 用；O、N、S去烷基化作用，以氧取 代杂原子；脱氢作用2还原反应：重氮还原、N还原、羰基还 原3水解反应：酯水解、胺水解、环氧化 物水解外源物质及其代谢中间物与某些内源物质分子的结合反应。产物往往更富亲水性，也就更容易以水溶形态被排出体外1谷胱甘肽结合2葡糖醛酸化3硫酸盐化4乙酰化5甲基化 第二节 I相代谢反应
8、一、氧化一还原反应1依赖于细胞色素P - 450的单加氧酶系 就其最佳底物的数量及可催化代谢反应的多样性来看，在所有和I相代谢反应有关的酶系中，依赖于细胞色素P - 450的单加氧酶系（cytochrome P- 450 - dependentp73monxygenases)所起的作用最重要。其核心部分是细胞色素P一450(cytochromeP一450EC l14141)，几乎所有的人体组织器官中都有细胞色素P一450的存在，尤以肝脏细胞内质网上含量最多。 真核生物中和遗传毒物代谢有关的细胞色素P一450几乎都是膜结合蛋白，主要嵌合在细胞的内质网结构上。实验室里通常通过组织匀浆破碎细胞，应用
9、差速离心，首先去除细胞碎片和线粒体组分，上清液再次离心，细胞色素P一450就随着内质网碎片即所谓微粒体结构沉降在10 0009沉淀中。P一450是一个血红素蛋白，通常P一450血红素内的铁原子以三价铁形式存在，在某些还原剂作用下，三价铁可被还原为两价铁，还原型细咆色素P一450和一氧化碳结合差光谱在450nm处有一个主要吸收峰，这是细胞色素P一450区别于其他血红素蛋白的一个显著特征，就由此得名为“P一450”。 依赖于细胞色素P一450的单加氧酶系主要以以下方式催化底物的代谢：这一基本过程是一个单加氧过程，氧分子中的一个氧原子和底物结合，另一个则还原为水，这里需要NADPH作为质子供体。在反
10、应中P一450与底物及氧原子直接结合，和NADPH不直接作用。大多数细胞色素P一450首先和底物结合，然后才和分子氧结合并活化分子氧，这样机体就免于被所产生的活性氧成分伤害；在有竞争性抑制剂存在的情况下，抑制剂通过和P一450活性中心结合，启动活性氧的产生，而不伴随其他物质的氧化，从而对机体造成损伤。在有些情况下，NADH取代NADPH在反应中的作用。P一450催化反应必须有适当的电子来源，为了使氧分子中的0一O键断裂，血红素铁首先必须通过电子传递链得到两个电子而被还原，根据P一450在细胞内的定位不同，生物体有两种不同的电子传递链：为定位于内质网的P一450提供电子的是NADPH细胞色素P一
11、450还原酶，它本身也是一个内质网定位酶，通过N末端的“尾巴”穿越内质网，分子的大部分在内质网的细胞质方向，这个酶有两个结构域(domain)，各有一个黄素分子，两个电子从NADPH经FAD和FMN，最后到达P一450的血红素铁；对线粒体定位的P一450(如CYPllAl、CYPllA2、CYPllBl、CYP24、CYP27A1、CYP2781)，电子传递链的组成有所不同，在这里铁氧化还原蛋白是P一450的直接电子供体，铁氧化还原蛋白不含有黄素，替代黄素位置的是铁硫簇，铁氧化还原蛋白被铁氧化还原蛋白还原酶(一种黄素蛋白)所还原，电子从NADPH经铁氧化还原蛋白还原酶和铁氧化还原蛋白，最终到P
12、一450；还有个别P一450从细tga色素b5得到电子。 以下列举P一450催化的几个典型反应： 1)双键环氧化：2)羟基化作用： 脂肪族碳羟基化：芳香碳羟基化：p743)杂原子去烷基化： 7-乙氧基，9-羟基-3-异吩噁唑酮(7 -乙氧基试卤灵)CYPIA12，9-羟基-3-异吩噁唑酮（试卤灵） 4)杂原子氧化：4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-酮(NNK)一N-氧化NNK5)脱氢反应： 除了催化上述的反应外，P - 450还可能催化其他一些反应，如偶氮还原、氮还原以及还原脱卤等；在甾体激素合成过程中P - 450也可以催化C-C键断裂，例如CYP11A1在胆固醇转化为孕烯醇酮过
13、程中的侧链断裂作用；以及取代环己烷的芳烃化作用，如CYP19在将睾酮转化为雌激素时就起了芳烃化酶的作用。 所有的细胞色素P- 450基因都属于一个超基因家族，基因根据其序列同源性归为不同的基因家族和亚家族，氨基酸序列同源性高于40%者归为同一家族，高于55%以上者归人同一亚家族。目前有约1000个不同的细胞色素P - 450基因完成了序列测定，分别属于74个基因家族，目前已知有17个人类P - 450基因家族，其中有20个亚家族已在人类基因组中定位3。参与人体代谢的主要为c YP1至CYP3家族以及CYP4家族部分成员的基因产物（表4=2）。表4-2人类细胞色素P- 450主要基因家族及代谢催
14、化功能 基因家族 代谢催化功能 C YPI 药物代谢（2个亚家族，3个基因） C YP2 药物及甾体代谢（10个亚家族，15个基因，8个假基因） C YP3 药物代谢（1个亚家族，3个基因，2个假基因） C YP4 花生四烯酸或脂肪酸代谢（5个亚家族，9个基因，2个假基因） C YP5 凝血噁烷A2合成酶（1个亚家族，1个基因） CYP7A 胆汁酸生物合成，甾体核的7-a羟化酶（1个亚家族成员） C YP7B 大脑组织专一的7-a羟化酶（1个亚家族成员） C YP8A 环前列腺素合成酶（1个亚家族成员） C YP8B 胆汁酸生物合成（1个亚家族成员） C YP11 甾体生物合成（2个亚家族，3
15、个基因） C YP17 甾体生物合成（1个亚家族，1个基因）17 -a羟化酶 C YP19 甾体生物合成（1个亚家族，1个基因）形成雌激素 C YP21 甾体生物合成（1个亚家族，1个基因，1个假基因） C YP24 维生素D降解（1个亚家族，1个基因） C YP26A 视黄酸羟化酶（1个亚家族成员） C YP26B 可能为视黄酸羟化酶（1个亚家族成员） C YP27A 胆汁酸生物合成（1个亚家族成员） C YP2 7B 维生素D，l-a羟化酶，活化维生素D3（1个亚家族成员） C YP39 功能不明（1个亚家族成员） C YP46 胆固醇24 -羟化酶（1个亚家族成员） C YP51 胆固醇
16、生物合成（1个亚家族，1个基因，2个假基因）羊毛甾烯醇14 -。去甲其醢p75表4-3已完成序列测定的CYP基因 IA1.1A2.181 2A6, 2A7 , 2A7PT * * , 2A7PC, 2A13 , 286 , 287P, 208 , 209 , 2C18 , 2C19 , 2D6 , 2D7P, 2D7AP,2D8P ,2D8BP ,2El , 2FI ,2Fl P ,2G1 ,2J2 ,2R1 ,2S1 ,3A4,3A5,3A5PI ,3A5P2,3A7,4A11 ,481 , 4B2 ,4F3 , 4F8 , 4F9P , 4F10P , 4F11 , 4F12 , 4X1
17、, 421 , SA1 7A1.781 8A1 ,88111AI ,IIBl ,1182 , 17 1921AIP,21A2 , 24 26A1,2681 27A1.2781 39 46 51 , 51P1 , 51P2原先命名的2C10、3A3和4A9可能是实验矫作物，已从名录中撤消。一命名中数字后的字母P表示该基因是一个不可能产生功能蛋白质的假基因。2含黄素的单加氧酶系催化的反应 含FAD的单加氧酶系（flavin-containing monooxygenases，FMO，EC l.14 .13.8）主要存在于肝脏、肾脏和肺中，也是微粒体酶，FMO与依赖于细胞色素P- 450的单加氧酶系
18、(CYP)在功能上有交叉，虽然两者在催化机制上完全不同。许多体外实验手段可以区别各种FMO和CYP的催化活性，首先FMO对热不稳定，在没有NADPH存在的条件下，50保温1min，就可以使FMO全部失活；CYP对非离子性去垢剂不稳定，1% Emulgen911可使之失活，而FMO几乎不受影响；也可用抗原一抗体结合来进行研究，由分离纯化的细胞色素P- 450制备的抗体不仅能区分FMO和CYP的活性，而且还可以区分不同种类CYP的活性，但FMO与本身抗体相结合却不影响活性表现；抑制剂也可以用于微粒体中各种FMO和CYP的活性的区分。 FMO催化反应历程主要包括如下几个步骤：首先FAD被NAPH还原
19、，氧化态NAP+仍然结合在酶分子上不脱落，并和氧结合形成过氧化物，由于FAD的活性中心由非亲核性、高度亲酯的氨基酸所组成，因此生成的过氧化物还比较稳定，随后在底物被氧化时，4a -羟基过氧化黄素转化为4a -羟基黄素，最后一步是4a -羟基黄素恢复到初始的氧化态FAD，释放出氧化态NAP+。 由于FMO氧转移能力显著低于CYP，因此前者主要限于催化所谓“软性”亲核中心的代谢，如亲核N、S杂原子的氧化，生成N-氧化物或S-氧化物，以及由叔胺生成N-氧化物，由仲胺生成羟胺和硝酮，伯胺生成羟胺和肟。肼以及一些含碘、砷、硼的化合物也可作为含FAD单加氧酶的底物。 目前发现FMO只有一个基因家族，包括5
20、个均为单一成员的亚家族，分别命名FM01FM05。人类基因组中FMO家族集中在lq区段内，编码产物同源性在p765060左右4。以上5个同工酶的表达有显著的种属专一性和组织专一性，人肝脏中最主要表达的是FM03，肾脏中主要为FM01。不同的FM0具有不同的物理性质，其底物特异性也不同，例如FM02适合催化正辛胺等脂肪族长链伯胺的N一氧化，而对FM01来说，长链伯胺不是合适底物，冬眠灵等短链季胺才是合适底物。3依赖于过氧化物酶活性的氧化过程 与前述过程不同，由过氧化物酶催化的外源化合物氧化过程不需要NADPH及NADH参与，它通过耦联过氧化氢或过氧化物的还原来氧化其他化合物，其中的过氧化物酶活性
21、并不限于过氧化物酶(peroxidase，P0，EC l1117)，多种其他酶都能提供这种活性，因此我们在此统称为过氧化物酶活性。在外源基因毒物代谢中起过氧化物酶活力作用的主要有前列腺素H合成酶(PHS)，主要分布于肾髓、血小板、血管内壁、肠道、脑、肺和膀胱上皮等处；乳腺上皮的乳过氧化物酶以及血液白细胞中的髓过氧化物酶。其中研究最多的是前列腺素H合成酶，PHS具有双重活性，环氧化酶活性将花生四烯酸转化为环状的内过氧化物一氢过氧化物PGG2，同时其过氧化物酶活性将氢过氧化物转化为相应的醇PGH2，就此与外源化合物的氧化过程耦联。 PHS等过氧化物酶活性在细胞色素P一450活性较弱的肝外组织中遗传
22、毒物代谢活化过程中起重要的作用。例如在肺部，7，8一二羟基苯并芘的9，10一环氧化可由上皮细胞中含量很高的15一脂氧化酶所催化，在皮肤里这个代谢可由皮肤脂质过氧化过程中产生的过氧化自由基促进，提高肺癌和皮肤癌的发病风险。膀胱上皮中P一450活性很低，而PHS量较高，可以活化联苯胺、4一氨基联苯、2一氨基萘等芳香胺，形成可与DNA加合的代谢中间物，在膀胱癌致癌过程中发挥作用。 二、水解反应1酯酶催化的反应 酯酶(esterases，EC 311)其实是一个很庞杂的概念，它除了能催化羧酸酯水解外，还可以催化许多其他有机物质，如酰胺、硫酯、磷酸酯以及酸酐的水解；另一方面，羧酸酯或磷酸酯键的裂解也可能
23、由其他酶所催化。和其他代谢酶系不同的是，直到现在为止，还没有一个比较合理的酯酶分类命名系统。l953年Aldridge的命名系统，在今天看来虽然差强人意，但由于在毒理学方面还有部分实用价值，因此文献中仍在使用。根据Aldridge的定义，能够水解磷酸酯键的为A酯酶；可被磷酸酯抑制的为8酯酶；既不能水解磷酸酯也不为其抑制的为C酯酶。一般认为A酯酶活性中心中包括半胱氨酸；而B酯酶则包括丝氨酸，对B酯酶而言，有机磷酸酯对丝氨酸羟基的不可逆修饰导致了酶活性被抑制。目前已经分离纯化或已克隆基因的酯酶绝大多数属于B酯酶类型。 乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase)也属于B酯酶，乙酰胆碱酯
24、酶在动物神经活动中起中断神经递质乙酰胆碱的作用，有机磷类(还有氨基甲酸酯类)杀虫剂的毒性机制就在于有机磷对活性中心丝氨酸羟基的修饰，抑制乙酰胆碱酯酶活性。 芳香族酯类是A酯酶的最佳底物，在有些文献中A酯酶又被称为芳香基酯酶。A酯酶对磷酸酯键的水解作用是哺乳动物对有机磷农药最主要的减毒代谢途径之一。哺乳动p77物A酯酶活性显著高于昆虫，对有机磷物质的种属差别毒力是这一类杀虫剂分子设计基础之一。酯酶对有机磷类毒物的减毒作用，除了对磷脂键的水解作用(主要是具有较大V。值的A酯酶)外，还可能通过体内超量合成(overproduction)的酯酶蛋白和有机磷物质共价结合形成对毒物的“扣押”Cseques
25、tration”)作用，有效降低毒物在靶部位有效浓度，对于大量的具有较小Vmax值和Km值的A酯酶以及几乎所有的B酯酶来说，后一种机制可能更为重要。 关于C酯酶，目前积累的实验事实还非常有限，惟一可以肯定的是乙酸酯是其最佳底物，因此文献中也有称为乙酰基酯酶的。 酯酶在人体各种器官内均有表达，迄今为止，还没有关于某一物种或某一组织器官酯酶种类总数目的确切数据。酯酶大多数是糖蛋白，翻译产物糖基化修饰程度的差异可造成同一基因的产物以多种形态出现，又由于大多数酯酶是多聚体蛋白质，因此最终可以确定的基因组内酯酶活性基因总数一定将比以等电聚焦电泳或非变性胶电泳谱判别的酯酶N-c酶条带数目要少。2环氧化物水
26、化反应 环氧化物水解反应(epoxide hydration)是由环氧化物水化酶(epoxide hydrases，EH，EC 3323)主要催化碳一氧三圆环环氧桥结构的开环，水解高度亲电子的环氧化物。由于碳一氧键的高度极性以及不稳定性，环氧化物是高度活化的，很容易和DNA、蛋白质等生物大分子共价结合，形成加合物，从而导致细胞毒性或遗传物质突变。哺乳动物体内的环氧化物水化酶可分为两类：一类是膜结合的，存在细胞的内质网上，称为微粒体环氧化物水化酶(microSomal epoxide hydrase，mEH)；另一类存在于细胞质中，称为可溶性环氧化物水化酶(soluble epoxide hyd
27、rase，sZH)。两者之间氨基酸水平上的同源性小于15，但其空间构象却基本一致。从外源基因毒物体内代谢的角度看，mEH的重要性要远远超过sEH。 环氧化物水化酶在几乎所有的人体器官(肝、肺、肾、胰、皮肤、睾丸和卵巢等)来源的微粒体组分中都有分布，在某些器官，如肝脏和肺中，环氧化物水化酶活性的组织分布和细胞色素P一450基本上是重合的，这就在组织学上保证了由后者催化生成的氧化物能及时地被水解。 就基因家族而言，mEH是一个特例，与前述的细胞色素P一450超家族(CYP)，以及后面的谷胱甘肽S一转移酶基因家族(GST)和N一乙酰基转移酶基因家族(NAT)不同，mEH基因家族是单一成员家族，目前只
28、发现了一种人mEH基因。 mEH对底物结构有一定的要求，它首先要求底物分子必须是高度脂溶性的，同时要求环氧桥反式位置上无取代基，不致于对酶一底物结合造成空间障碍，mEH最典型的底物是多环芳烃的代谢物。虽然mEH催化环氧化物的水解在绝大多数情况代表了解毒或减毒倾向5，但也有相反的情况，例如它催化7，8一环氧化苯并芘水解阻止了该环氧化物自发异构化为毒性较低的7一酚或8一酚，生成7，8一二羟基苯并芘，然后在其他酶的进一步催化作用下，生成具有极高致突变能力的7，8一二羟基9，10一环氧苯并芘，至此，mEH就无能为力了。p78 第三节 相代谢反应 相代谢应(phaseII metabolism)主要包括
29、结合谷胱甘肽(glutathione)、葡糖醛酸(glucuronate)、硫酸盐化(sulfation)、乙酰基化(acetylation)、甲基化(methylation)。绝大多数相代谢反应都伴随着分子亲水性的增加，从而促进遗传毒物排出。在许多情况下，1I相反应以工相反应，特别是细胞色素P一450催化反应产物为底物，但也可直接以母体化合物为底物。 一、谷胱甘肽结合 谷胱甘肽S一转移酶(glutathione Stransferases，GST，EC 25118)催化内源还原性谷胱甘肽GSH(图41)与遗传毒物或其代谢中间物(大多是I相反应酶催化反应的结果)分子上的亲电子碳原子的结合，此外
30、它还可催化底物分子上亲电子杂原子(如O、N及S)和GSH的结合，增加分子的亲水性。图41谷胱甘肽结构 谷胱甘肽S一转移酶广泛分布于人体各重要组织器官，肝脏、肾脏、肠道、肺部等处活力最高，体内GST有两大类：可溶性的，或称细胞质GST，占GST总活力的95以上；膜结合的微粒体GST，表现的活力不到总活力的5。在外源化学物体内代谢作用方面，细胞质GST起的作用更为重要。细胞质GST酶蛋白都以二聚体形式存在。所有的细胞质GST基因都从属于单一的超级基因家族，超家族内部众多成员根据DNA序列同源程度又分属于6个家族，旧命名法以希腊字母分别标记为GST、家族，也有写作GST alpha，mu，pi，thita，sigma，kappa家族；新的命名系统以英文字母取代原来的希腊字母，改为GSTA、M、P、T、S、K家族，但是旧的系统仍有人在使用6|。GSTMl基因位于人1号染色体，GSTTl基因位于22号染色体，GSTPl在11号染色体。 肝脏内谷胱甘肽生理浓度很高(约10 mmolL水平)，因此不能排除某些外源化合物和还原性谷胱甘肽的非酶促结合，GST酶通过谷胱甘肽巯基的去质、子化(GSH-，GS一)
