1、细胞免疫治疗,吴艳峰2015-11-12,细胞治疗是指采用经体外操作过的自体、异体或者异种的细胞用于疾病或损伤的治疗、预防。用于肿瘤、艾滋病、肝炎、糖尿病、器官移植、心血管疾病、脊髓损伤、帕金森病等领域,肿瘤的继承性免疫治疗治疗性细胞疫苗腺体细胞移植神经细胞及心血管细胞移植为基础的细胞治疗技术以镇痛和抗衰老的牛肾上腺细胞和羊胎细胞的异种细胞治疗技术,体细胞治疗已经成为多种疾病的有效治疗方式,细胞免疫治疗,细胞免疫治疗是指采用经体外操作过的自体、异体或者异种的免疫细胞用于疾病或损伤的治疗、预防。包括淋巴细胞、树突状细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞以及其他免疫相关细胞用于免疫相关性疾病的治疗或预
2、防，包括肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的细胞免疫治疗。,肿瘤的免疫治疗/生物治疗,抗体肿瘤疫苗树突状细胞疫苗过继细胞治疗细胞因子,肿瘤免疫治疗方兴未艾Cancer immunotherapy holds considerable promise,以树突状细胞为基础的治疗性肿瘤疫苗使肿瘤个性化治疗成为可能Dendritic-Cell-Based Therapeutic Cancer Vaccines might enable the development of next-generation curative therapies for individuals with cancer,在研
3、的多种治疗性疫苗将能够启动新的T细胞，并诱导慢性活化的非保护性的CD8+T细胞成为健康CD8+T细胞，进而形成CTL发挥抗肿瘤效应，还可以产生长寿记忆性CD8+T细胞从而能够快速产生新的效应T细胞，分泌细胞毒分子，从而防止肿瘤复发。,Palucka K et al.Immunity.2013;39(1):38-48,多肽,重组蛋白,肿瘤细胞,病毒载体,核酸,细菌,过继性T细胞回输是肿瘤免疫治疗的又一个新兴领域Adoptive T Cell Transfer for Cancer Immunotherapy in the Era of Synthetic Biology,免疫耐受一直是限制免疫治
4、疗发展的一个瓶颈。工程T淋巴细胞能够表达高亲和力抗原受体，有望克服免疫耐受。目前面临的主要挑战是工程T细胞对肿瘤的特异性识别能力的增强和大规模细胞培养体系的建立。,Kalos M et al.Immunity.2013;39(1):49-60,美国Dendreon公司进行了树突状细胞疫苗(PROVENGE)治疗雄性激素非依赖的晚期前列腺癌患者的期临床试验（2009.4.28），结果显示：PROVENGE治疗组的患者中位生存时间高于安慰剂组患者4.1个月（25.8个月 vs 21.7个月）PROVENGE治疗组的患者三年生存率比安慰剂组高出38%（31.7%vs 23%）IMPACT study
5、的结果p=0.032，高于预期的p=0.043，治疗组死亡风险比对照组降低了22.5%（HR=0.775）PROVENGE的安全性良好，显著延长患者的中位生存时间，提高三年生存率。,Nat Rev Drug Discov.2011;10(8):591-600.,肿瘤免疫治疗历史沿革,Enthusiasm phase,Skepticism phase,Renaissance phase,Explosion phase,肿瘤过继性细胞免疫治疗已成为肿瘤的第四种治疗模式,特异性T细胞免疫治疗可实现晚期恶性黑色素瘤的50%以上的CR+PRScience,2002NEJM,2008可显著提高晚期恶性黑色
6、素瘤患者的生存期PNAS,2002 T细胞特异性基因修饰 TCR转基因可实现晚期恶性黑色素瘤患者的PRScience,2006 白血病患者的CRSci Transl Med,2011,非特异性细胞免疫治疗 T细胞可显著延长术后患者的无复发生存期The Lancet,2000韩国KFDA IV期临床证实 可显著延长患者的生存期美国II期临床(NK-92)日本III期临床(T细胞)韩国III期临床(T细胞),国际上批准临床应用的过继性细胞治疗产品,日本：厚生省医疗技术：T细胞NK细胞NKT细胞韩国：FDA产品：Immuncell-LC（T细胞）,限制肿瘤免疫应答的因素,细胞免疫治疗分类,主动性细胞
7、免疫治疗（细胞治疗性疫苗）被动性细胞免疫治疗（过继性细胞治疗）,1985,Cellular Immunotherapy,where have we been,LAK,TIL,CD3AK,CIK,NK,NKT,T,CTL,Tumor cell vaccine,Dendritic Cell vaccine.,Adoptive Cellular Immunotherapy,2008,Cell Based Tumour Vaccine,淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine activated killer cells,LAK)肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating lymph
8、ocytes,TIL)CD3 单克隆抗体激活的肿瘤杀伤细胞(Anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells,CD3AK)细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer ceils，CIK)自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK)细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)树突状细胞(Dendritic cells,DC)、,免疫平衡状态,免疫平衡状态,过继性免疫治疗(Adoptive immunotherapy),体外分离细胞,离体扩增、培养、活化,自体回输,诱
9、发机体特异性抗肿瘤免疫,淋巴因子激活的杀伤细胞Lymphokine-activated killer cells,LAK,LAK的发现1980年，美国癌症研究所的Rosenberg实验室首次报道了荷瘤小鼠的脾脏淋巴细胞或肿瘤患者的外周血淋巴细胞在含有IL-2的培养液中短期培养可以诱导出一种非特异性的杀伤细胞，能杀伤新鲜分离的实体瘤细胞和多种肿瘤细胞株。其中很多是对CTL和NK不敏感的肿瘤细胞。目前尚未发现LAK细胞特有的表面标志，许多实验表明，LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。,LAK的临床应用1984年11月Rosenberg研究组经美国FDA批准，首次应用IL-2与LAK协同治疗25
10、例肾细胞癌、黑素瘤、肺癌、结肠癌等肿瘤患者。治疗用LAK细胞数量在0.618.41010，IL-2用量2.8105-3.32106 U/kg。其中11例肿瘤缩小超过50，1例黑素瘤完全消退。1988年该研究组总结了IL-2与LAK细胞协同治疗222例肿瘤患者，其中16例患者肿瘤转移灶完全消退，26例患者肿瘤消退50以上，该疗法对转移性肾细胞癌、黑素瘤、结肠癌和非何杰金氏淋巴瘤患者的疗效较显著。有报道乳腺癌、膀胱癌局部联用IL-2进行治疗也获得明显疗效。,由于IL-2用量大，在治疗过程中可出现毒副反应，最常见和最严重的毒副作用是出现毛细血管渗漏综合征(CLS)，主要表现为全身性水肿和多器官功能失
11、调，可引起胸腹腔积液、肺间质水肿和充血性心力衰竭。引起CLS的机理可能与内皮细胞损伤和产生血管活性物质有关。,肿瘤浸润淋巴细胞Tumor infiltrating lymphocyte,TIL,1986年Rosenberg研究组首先报道了TIL。TIL细胞表型具有异质性：一般来说绝大多数：CD3阳性细胞不同肿瘤来源：CD4+/CD8+T细胞比例有差异 多数情况下以CD8+T细胞为主随着体外加IL-2培养时间的延长，CD25+细胞百分率由低逐渐升高。NK细胞的标记(CD16，CD56)在TIL体外加IL-2培养过程中有先增高后降低的趋势。,用机械处理和酶消化方法，从肿瘤局部分离出肿瘤浸润的淋巴细
12、胞，加入高剂量IL-2体外培养，残存的肿瘤细胞7-13天全部死亡。与来自PBMC的LAK细胞比较，其特点是:(1)杀伤活性强 50-100 倍，因此在治疗中可以减少效应细胞和IL-2的用量，而且对LAK治疗无效的晚期肿瘤仍有一定治疗效果；(2)主要由CD8阳性细胞诱导而来,在动物实验中发现TIL杀伤肿瘤作用具有特异性；,(3)宿主的抑制状态有利于TIL的杀伤作用,因此治疗时加用环磷酰胺(Cy)100mg/kg可明显提高疗效，可能与免疫抑制药能消除抑制性细胞或因子，增强过继免疫治疗作用有关，因而可减少IL-2的用量，降低毒副反应；(4)可从手术切下肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中获得淋巴细
13、胞，经加IL-2培养后，其生长、扩增能力强于LAK细胞。已有报道应用TIL治疗14例转移性肺癌等晚期肿瘤患者,其中4例肿瘤缩小50以上，副作用明显低于IL-2/LAK疗法。,肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗转移性黑色素瘤,2002.Science,TIL治疗后转移性黑色素瘤患者腋窝（上）、骨盆（中）及腹腔内（下）巨大转移灶的消退,TIL治疗后转移性黑色素瘤患者肝脏巨大转移灶的消退左：治疗前；右：治疗后,应用LAK或TIL细胞治疗肿瘤今后发展的方向是:提高LAK细胞的纯度，应用活化LAK细胞贴壁的特性，纯化粘附LAK(adherent-LAK,A-LAK)细胞，在IL-2诱导下数量可增加100倍，
14、而且抗肿瘤转移的作用比LAK强20-50倍。改变过继回输细胞在体内的分布，如改变注射细胞途径和方法，达到局部/区域继承免疫疗法的目的。与其它细胞因子如IL-12、IFN、TNF-和CSF联合治疗，增强LAK的杀伤活性。将某些细胞因子(如IL-2、TNF等)cDNA转染LAK或TIL，用于基因治疗。,CD3抗体激活的杀伤细胞CD3 McAb activated killer cells,CD3AK,抗CD3单抗与IL-2协同，能显著提高LAK细胞的数量和杀伤活性。抗体含量在1020 ng/ml即可达到刺激杀伤活性的高峰，体外培养数天后即可出现明显的杀伤活性。CD3AK激活需要单核细胞存在，其增殖
15、速度和细胞毒活性均高于LAK。所有的CD3+CD8+T细胞和1-6CD3+CD4+T细胞可诱导出CD3AK。CD3AK已开始应用于临床。,细胞因子诱导的杀伤细胞cytokine-induced killer cell,CIK,1991年斯坦福大学医学院骨髓移植中心首先报道了这种具有高增殖力和高细胞毒性的细胞因子激活的杀伤细胞；1994年Schmidt-wolf报道了体外大量增殖CIK细胞的方法。增殖后的CIK细胞主要为CD3+CD56+(50%以上)，在正常人外周血中极其罕见(1-5%)。绝大多数细胞共表达CD2、TCR/、CD5和CD8与LAK比较：不需NK细胞活化 不需持续给以大量IL-2
16、 增殖活性和细胞毒性更高,由IFN-、CD3单抗、IL-1、IL-2等细胞因子在体外诱导并大量扩增的具有杀伤肿瘤活性的细胞，是目前国际上广泛应用的肿瘤免疫治疗手段。,特点：1）高增殖活性 加入细胞因子后迅速增殖，在培养第22天增殖曲线达顶峰；CD3+CD56+细胞增加1000-6000倍；28-30天达平台期，细胞毒活性亦达峰值；2）高细胞毒力 CIK细胞对肿瘤细胞的抑制指数为1.5-3.5，LAK细胞为0.5-1.5；3）杀瘤作用谱广泛，非MHC限制性,4）细胞来源丰富 正常或患者（CML、MM、ALL、AML、淋巴瘤、结肠癌、乳腺癌、肾癌）的骨髓单个核细胞或外周学单个核细胞、干细胞均可诱导
17、获得CIK细胞；5）对多耐药性肿瘤细胞同样敏感 阿霉素、常春藤新碱等6）不受免疫抑制剂CSA、FK506影响7）抵抗肿瘤细胞诱发的效应细胞Fas-FasL凋亡 细胞内表达抗凋亡基因和保护基因8）对正常骨髓前体细胞毒性很小,CIK细胞不仅对白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液系统肿瘤治疗有效，对肾癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、卵巢癌等细胞系均有极强的杀伤活性（6090）。将CIK细胞与树突状细胞和肿瘤细胞系抗原联合应用，能够进一步提高对肿瘤的杀伤活性。最适合放、化疗后、手术后或骨髓移植后的患者。毒副作用：轻度发热、畏寒、疲乏等，较轻且可自行缓解,分2-3次静脉回输体内,采集病人外周血单个核细胞,
18、加入多种细胞因子培养,扩增、活化、诱导成为CIK细胞,发挥抗肿瘤作用,到达病变部位直接清除残存肿瘤细胞调节和增强全身免疫机能防止肿瘤复发及转移,CIK的临床应用,经IL-2基因转染的CIK治疗肺、肝、淋巴结转移性肾癌(1)、直肠癌(7)、淋巴瘤(2)的I期临床试验结果：10例经CIK治疗后，患者血清-IFN、GM-CSF和TGF-水平均升高，外周血CD3+T细胞均显著增加，外周血淋巴细胞杀伤活力均升高。1例完全缓解，3例病情得到稳定。,国内对87例急性白血病患者进行了CIK细胞治疗，其中84例血液学缓解期接受CIK治疗的持续完全缓解(CCR)率为75%，中位CCR期为26月；2例（2/3）脾脏
19、肿大明显缩小，均CCR至今（12及16月）。,CIK后持续完全缓解（CCR）概率,CIK治疗后不同型患者的CCR概率（CR期）,CIK治疗后CR期患者追踪,CIK治疗后骨髓残留异常染色体和/或白血病标志消失,IgH/TCR 14/14转阴t(15;17)和/或PML/RARa 3/3转阴t(8;21)和/或AML1/ETO 2/2转阴,有微小残留白血病的ALL儿童在停化疗后用CIK的疗效,化疗12月后仍残留IgH和/或TCR（+）者，自愿选择CIK或单纯化疗 CIK组：14/14 IgH和/或TCR转阴 中位随访18月，均CCR 单纯化疗：6/14 IgH和/或TCR转阴 8/14 复发,国内
20、1999-2001年对256例各种中晚期肿瘤患者（包括乳腺癌、肺癌、肠癌、胃癌、淋巴瘤等）进行了1-4疗程CIK治疗治疗后部分缓解和轻度缓解为207例（80.86%）随访 1年生存期为96.06%2年生存期为92.96%3年生存期为88.38%生存质量卡氏评分提高率为88.28%经治疗后对心、肝、肾功能均未引起不良反应，仅数例有一过性发热，24小时即正常。,国内对13例原发性肝癌进行CIK治疗，肝癌患者血清平均病毒载量由治疗前1.85 106 HBV DNA拷贝/ml降低为治疗后1个月8.75 105，2个月1.44 105，3个月1.41 105,如何建立高效的、稳定的、记忆的、特异的过继性
21、细胞免疫治疗？,TCR engineering of lymphocytesfor use in ACT,将CAR克隆入病毒载体,患者,表达CAR的人T细胞-CART,体外扩增,单克隆抗体MAb,TCR,First-Generation(prototype)CAR,The introduction of CARs recognizing tumor antigens through single-chain variable fragments(scFvs)isolated from antigen-specific monoclonal antibodies(mAbs)linked to i
22、ntracellular signaling domains,scFv structure,50,Second-and Third-Generation CAR,Newer Generation CARs Constructs(The fourth-generation CAR),TRUCKs:T cells Redirected for Universal Cytokine Killing CAR redirected T cells which constitutively produce a transgenic protein(payload)and release the prote
23、in upon CAR engagement of target.a nuclear factor of the activated T cell(NFAT)-responsive expression cassette for the inducible expression of a transgenic cytokine,for example,IL-12.TRUCK cells with inducible release of IL-12 attract and activate innate immune cells to the targeted tumor lesion whi
24、ch in turn eliminate cancer cells not recognized by CAR T cells.,用于嵌合型抗原受体改造的靶点,CAR-T研究进展双特异性抗体,Immunol Rev.2014.257:107-26.,CAR-T的挑战与风险,挑战：寻找新靶标、研发新技术,树突状细胞与 肿瘤免疫治疗,加工处理和提呈抗原的过程,抗原可分为内源性抗原(病毒、细胞内感染细菌、肿瘤抗原)与外源性抗原(绝大多数细菌或其它病原、异物)。,抗原提呈,+,融合,裂解,酸提,合成,提取,mRNA,抗原肽,抗原肽,裂解物,vector,cDNA,转染,肿瘤细胞,树突状细胞的抗原致敏,
25、抗原提呈,肿瘤细胞,DC,恶性黑色素瘤、前列腺癌、恶性淋巴瘤、白血病、其他实体瘤（结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝胰管壶腹癌、胃癌、食管癌、转移性肾癌、儿童青少年好发的间叶组织来源的肉瘤）的免疫治疗。,树突状细胞瘤苗的临床应用,获批上市或III期临床在研的树突状细胞疫苗,已报道的树突状细胞治疗黑色素瘤患者生存期统计,Lancet Oncol 2014;15:e25767,Last update:Nov 14,2013.,已报道的树突状细胞治疗脑肿瘤及肾癌患者生存期统计,Ralph Steinman,Ralph,however,pursued his studies of DCs relen
26、tlessly.He used to tell his laboratory members and colleagues：“just do the experiment”！,抗原致敏的人树突状细胞III期临床试验,APDC联合化疗治疗转移性大肠癌疗效,微囊化人工细胞,人工抗原递呈细胞,亚细胞成分的细胞疫苗,细胞治疗技术不断创新,个体化细胞治疗产品临床级规模化制备技术基于磁性粒子的细胞分离纯化技术细胞治疗产品的体外诱导分化技术细胞治疗产品的修饰技术细胞治疗产品的药效学评价技术细胞治疗产品的质量控制关键技术,肿瘤对免疫的贡献好像要比免疫对肿瘤的贡献大,Immunologist,Doctor,我有办法了！,Vaccine,ACT,Gene modifier,McAb,Immunologist,Doctor,Cao X.Nature Immunology.2008;9:339,Inhibitor,Response,Escape,Enhancer,？,Enhance the“Enhancer”Suppress the“Suppressor”,
