1、大规模细胞培养技术大规模细胞培养技术简介大规模培养技术应用简介 通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。 上世 纪 60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空 纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、 疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增， 以传统的生物化学技术从动物组织获 取生物制品已远远不能满足这一需求。 随着细胞培养的原理与方法日臻完善， 动 物细胞大规模培养技术趋于成熟。所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条 件下(设定 ph、温度
2、、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生 物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多 种原代细胞及人二倍体细胞、 cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞 )、 Vero 细胞 (非洲绿猴肾传代细胞， 是贴壁依赖的成纤维细胞 )等，并已成功生产了 包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、 单克隆抗体等产品。在过去几十年来， 该技术经有了很大发展， 从使用转瓶 (roller bottl
3、e) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业 化或者说是规模化生产： 一是在工艺生产时不能大规模制备产品； 二是非批量生 产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。随着生物技术的发展， 迫切需要大规模的细胞培养， 特别是培养表达特异性蛋白 的哺乳动物细胞， 以便获得大量有用的细胞表达产物。 采用玻璃瓶静置或旋转瓶 的培养方法， 已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。 因而必须为工业化生产开 创一种新的技术方法。自 70
4、年代以来，细胞培养用生物反应器有很大的发展， 种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培养生物反应器有空气提升反应器， 中空纤维管反应器， 无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。 八十年代以来， 人们 逐渐开始以生物反应器培养代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。动物细胞是一种无细胞壁的真核细胞， 生长缓慢， 对培养环境十分敏感。 采用传 统的生物化工技术进行动物细胞大量培养， 除了要满足培养过程必需的营养要求 外，有必要建立合理的控制模型，进行 pH 和溶氧( DO)的最佳控制。细胞生 物反应器可通过微机有序地定量地控制加入动物细胞培养罐内的空气、 氧气、氮 气和二氧化碳四种气体的流量，使其保持最佳的
5、比例来控制细胞培养液中的 pH 值和溶氧水平，使系统始终处于最佳状态，以满足动物细胞的生长对 pH 值和溶 解氧的需要。如为提高或达到一定的溶氧水平可改变通入培养罐内气体中氧气和 氮气的比例来实现控制 DO值的目的。采用二氧化碳 /碳酸氢钠( CO2/NaHCO3) 缓冲液系统来控制培养液的 pH 值是一种较好的方法。现在，由于动物细胞培养技术在规模和可靠性方面都不断发展， 且从中得到的蛋 白质也被证明是安全有效的，因此人们对动物细胞培养的态度已经发生了改变。 许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗， 尤其是那些相对较大、 较复杂或糖基 化( glycosylated )的蛋白质来说， 动物细胞
6、培养是首选的生产方式。 60 年代初， 英国 AVRI 研究所在贴壁细胞系 BHK21 中将口蹄疫病毒培养成功后，从最初的 200ml 和 800ml 玻璃容器开始，很快就放大到 30L 和100L 不锈钢罐的培养规模。 使用的是基于 Eagles 配方的培养基，补充 5% 成年牛血清和蛋白胨。 1967 年以 后，Wellcome (现为 Cooper 动物保健)集团分布于欧洲、非洲和南美洲 8 个国 家的生产厂商， 应用此项技术工业规模化生产口蹄疫疫苗和兽用狂犬疫苗， 已掌 握了 5000L 的细胞罐大规模培养技术。目前已实现商业化的产品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊 髓
7、灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗、 及 干 扰素、血纤维蛋白溶酶原激活剂、凝血因子和、促红细胞素、松弛素、生长 激素、蛋白 C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽释放酶及 200种单克隆抗体等。 其中， 口蹄疫疫苗是动物细胞大规模培养方法生产的主要产品之一。 1983 年，英国Wellcome 公司就已能够利用动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。美国 Genentech 公司应用 SV40 为载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物 细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。英国 Wellcome 公司采用 8000L Namalwa 细胞生产 干扰素。 英国 Cellt
8、ech 公司用气升式生物反应器生 、和 干扰素；用无血清培养液在 10000L 气升式生物反应器中培养杂交瘤细胞生产 单克隆抗体。美国 Endotronic 公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细胞 生产出免疫球蛋白 G、A、M 和尿激酶、人生长激素等。第二节 大规模培养常用方法根据动物细胞的类型， 可采用贴壁培养、 悬浮培养和固定化培养等三种培养方法 进行大规模培养。一、动物细胞生长特性及培养温度1.细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差3.需氧少，不耐受强力通风与搅拌4.群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）5.培养过程产品分布细胞内外，成本高6
9、.原代培养细胞一般繁殖 50 代即退化死亡依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为两类： 贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长， 大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。非贴壁依赖型细胞： 无需附着于固相表面即可生长， 包括血液、 淋巴组织 细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。培养细胞的最适温度相当于各种细胞或组织取材机体的正常温度。 人和哺乳动物 细胞培养的最适温度为 3537 。偏离这一温度，细胞正常的代谢和生长将会受到影响，甚至死亡。总的来说，培养细胞对低温的耐力比高温高。温度不超过 39时，细胞代谢强度与温度成正比；细胞培养置
10、于 3940 环境中 1h ，即受 到一定损伤，但仍能恢复；当温度达 43以上时，许多细胞将死亡。当温度下 降到 3020 时，细胞代谢降低，因而与培养基之间物质交换减少。首先看到 的是细胞形态学的改变以及细胞从基质上脱落下来。 当培养物恢复到初始的培养 温度时，它们原有的形态和代谢也随之恢复到原有水平。二、贴壁培养( attachment culture )是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培 养。1.生长特性： 贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于细胞培养器皿 (板、瓶、片、皿) 壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。 一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单
11、层。2.贴壁培养的优点：容易更换培养液； 细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液， 清洗 后直接加入新培养液。容易采用灌注培养， 从而达到提高细胞密度的目的； 因细胞固定表面， 不 需过滤系统。当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。 同一设备可采用不同的培养液 / 细胞的比例。适用于所有类型细胞。3.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长；4.细胞贴壁的表面：要求 TC 技术处理后具有净阳电荷和高度表面活性。对微载 体而言还要求具一定电荷密度； 若为有机物表面， 必须具有亲水性， 并带阳电荷5.贴壁培养系统：主要有转
12、瓶、中空纤维(后面专题介绍)、玻璃珠、微载体系 统(后面介绍)等。转瓶培养系统： 培养贴壁依赖型细胞最初采用转瓶系统培养。 转瓶培养一 般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段， 或作为生物反应器接种细胞准备的一 条途径。细胞接种在旋转的圆筒形培养器 -转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转， 使细胞交替接触培养液和空气，从而提供较好的传质和传热条件。 转瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只需简单的增加转 瓶数量等优点。但也有其缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小， 细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受到限制等。现在使用的转瓶培养系统包括二氧化碳培养箱和转瓶
13、机两类。反应器贴壁培养 此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不因为 搅拌而跟随培养液一起流动， 因此比较容易更换培养液， 不需要特殊的分离细胞 和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品； 但扩大规模较难， 不能直接监控细胞的生长情况， 故多用于制备用量较小、 价值 高的生物药品。CelliGen、CelliGen PlusTM和 Bioflo3000 反应器是常用的贴壁培养式生物反应器， 用于细胞贴壁培养时可用篮式搅拌系统和圆盘状载体。 此载体是直径 6 毫米无纺 聚酯纤维圆片，具很高表面积与体积比( 1200cm2/g )，利于获得高细胞密度。 篮式搅拌系统
14、和载体培养是目前贴壁细胞培养使用最多方式，用于杂交瘤细胞、 Hela细胞、 293 细胞、 CHO细胞及其它细胞培养。此种方式培养细胞，细胞接 种后贴壁快。三、悬浮培养( suspension culture )：是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过 程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养， 如杂交瘤细胞等； 是在微生物发酵的基础 上发通起来的。无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细 胞培养方式，它能减少后期纯化工作， 提高产品质量， 正逐渐成为动物细胞大规 模培养的研究新方向。四、固定化培养( immobilization culture )：是将动物细胞与水不溶性载体
15、结合 起来，再进行培养。上述两大类细胞都适用，具有细胞生长密度高，抗剪切力和 抗污染能力强等优点， 细胞易于产物分开， 有利于产物分离纯化。 制备方法很多， 包括吸附法、共价贴附法、离子 /共价交联法、包埋法、微囊法等。1.吸附法:用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法 (adhesion)。操作操简便、条件温和、是动物细胞固定化中最早研究使用的方 法。缺点是：载体的负荷能力低，细胞易脱落。微载体培养和中空纤维培养是该 方法的代表，稍后专门介绍。2.共价贴附法 :利用共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法称为共价贴 附法( attachment by covalent
16、 bonding )。此法可减少细胞的泄漏，但须引入 化学试剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。3.离子 /共价交联法 :双功能试剂处理细胞悬浮液， 会在细胞间形成桥而絮结产生 交交联作用，此固定化细胞方法称为离子 /共价交联法(cross-linking by covalent bonding )。交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。4.包埋法:将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法称为包埋法( entrapment )。优点是：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗 机械剪切。缺点是：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子基 质不
17、能渗透到高聚物网络内部。 一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化， 常用载 体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白。5.微囊法( microencapsulation ):是用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微 囊里，细胞不能逸出， 但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜； 囊内是种微 小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。 微囊直径控制在 200- 400m为宜。制备中应注意：温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作； 所用试剂和膜材料对细胞无毒害； 膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过； 膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。五、抗
18、凋亡策略在细胞大规模培养中的应用 生物反应器动物细胞大规模生产过程中， 细胞凋亡在细胞死亡中占主要部分。 最 近研究显示在大规模培养生物反应器中细胞的死亡中 80% 是凋亡所导致 ,而不是 以前所认为的坏死。 而在大规模细胞培养中， 细胞死亡是维持细胞高活性和高密 度的最大障碍。 理论上讲， 防止或延长细胞死亡， 可以极大提高生物反应器生产 重组蛋白的产量。细胞凋亡由一系列基因精确地调控， 是多细胞生物发育和维持稳态所必需的生理 现象。已知凋亡的最终执行者是 Caspase 家族，它们均为半胱氨酸蛋白酶，各 识别一个 4 氨基酸序列，并在识别序列 C 端天冬氨酸残基处将底物切断。 Caspas
19、e 含有可被自身识别的序列，可以切割活化自身而导致信号放大，并作用于下游 Caspase成员，从而形成 Caspase 家族的级联放大， 最终作用于效应蛋白， 引起 细胞凋亡。所以在大规模培养时干扰细胞在培养中凋亡的发生， 提高细胞特异性抵制遇到压 力而引起凋亡的能力， 有利于提高细胞的培养密度、 延长细胞的培养周期， 从而 提高目标产品的产量 2-3 倍。1.营养物质抗凋亡在常规生物反应器构造中，营养耗竭或缺乏培养基中特殊的生长因子则引起凋 亡，例如血清， 糖或特殊氨基酸的耗尽。 培养基中添加氨基酸或其它关键营养可 抑制凋亡、 延长培养时间从而提高产品的生产。 大规模培养中细胞凋亡主要由于
20、营养物质的耗竭或代谢产物的堆积引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原 因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞在无血 清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更容易发生凋亡。2.基因抗凋亡 与凋亡相关的一系列基因产物可对其进行正、 负向的调控， 因此可通过导入相应 基因来调节细胞凋亡的机制。 Bcl-2 基因是目前最为有效的抗凋亡基因，在多种 细胞系中均表现出很强的抗凋亡活性。3.化学方法抗凋亡凋亡发生时细胞许多部位发生生化物质的改变， 有些变化如改变细胞氧化还原条 件产生活性氧在凋亡信号阶段发生，其它的如破坏线粒体膜电位、激活 caspase 则发生在凋亡效应
21、阶段，这在绝大多数细胞死亡中是相同的。因此 ,阻止这些生 化物质的改变可能阻止或至少延迟细胞凋亡的发生， 运用化学物质可抑制信号效 应阶段的发生，被认为是抗调亡策略之一。大规模培养技术的操作方式深层培养可分为：分批式、流加式、半连续式、连续式、连续式和灌注式五种。一、分批式培养( batch culture ) 是细胞规模培养发展进程中较早期采用的方 式，也是其它操作方式的基础。 该方式采用机械搅拌式生物反应器， 将细胞扩大 培养后， 一次性转入生物反应器内进行培养， 在培养过程中其体积不变， 不添加 其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、 培养基的操作方式。该
22、方式的特点 :操作简单。培养周期短， 染菌和细胞突变的风险小。 反应器系统属于封闭 式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、 pH 值和通气外，不 进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；直观反映细胞生长代谢的过程。 因培养期间细胞生长代谢是在一个相对固 定的营养环境，不添加任何营养成分 ,因此可直观的反映细胞生长代谢的过程 ,是 动物细胞工艺基础条件或 小试 研究常用的手段；可直接放大。 由于培养过程工艺简单， 对设备和控制的要求较低， 设备的 通用性强， 反应器参数的放大原理和过程控制， 比较其它培养系统较易理解和掌 握，在工业化生产中分批式培养操作是传统的、常用的方法，其工
23、业反应器 (Genetech) 规模可达 12000L 。分批培养过程中，细胞的生长分为五个阶段：延滞期、对数生长期、减速期、平 稳期和衰退期，见图 1。分批培养的周期时间多在 3-5 天，细胞生长动力学表现 为细胞先经历对数生长期 ( 48-72h )细胞密度达到最高值后， 由于营养物质耗劫 或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。 收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。二、流加式培养( feeding culture )1.流加式培养是在批式培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统， 悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞， 细胞初始接种的培养基体
24、积一般为终体积 的 1/2 1/3 ，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩 的营养物或培养基， 从而使细胞持续生长至较高的密度， 目标产品达到较高的水 平，整个培养过程没有流出或回收， 通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止 回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。2.流加培养特点：流加培养根据细胞生长速率、 营养物消耗和代谢产物抑制情况， 流加浓缩 的营养培养基。流加的速率与消耗的速率相同， 按底物浓度控制相应的流加过程， 保证合理的培养环境与较低的代谢产物抑制水平。培养过程以低稀释率流加， 细胞在培养系统中停留时间较长， 总细胞密度 较高，产物浓度较高
25、。流加培养过程须掌握细胞生长动力学， 能量代谢动力学， 研究细胞环境变 化时的瞬间行为。 流加培养细胞培养基的设计和培养条件与环境优化， 是整个培 养工艺中的主要内容。在工业化生产， 悬浮流加培养工艺参数的放大原理和过程控制， 比较其它培养系 统较易理解和掌握，可采用工艺参数的直接放大。流加培养是当前动物细胞培养中占有主流优势的培养工艺， 也是近年来动物细胞 大规模培养研究的热点。 流加培养中的关键技术是基础培养基和流加浓缩的营养 培养基。通常进行流加的时间多在指数生长后期， 细胞在进入衰退期之前， 添加 高浓度的营养物质。可以添加一次，也可添加多次， ? 中性 pH 值部分溶解， 可采用泥浆
26、的形式进行脉冲式添加； 其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕动泵 进行缓慢连续流加。4.流加式培养分为两种类型：单一补料分批式培养和反复补料分批式培养。? 单一补料分批式培养是在培养开始时投入一定量的基础培养液，培养到一定 时期，开始连续补加浓缩营养物质， 直到培养液体积达到生物反应器的最大操作 容积，停止补加， 最后将细胞培养液一次全部放出。 该操作方式受到反应器操作 容积的限制，培养周期只能控制在较短的时间内。? 反复补料分批式培养是在单一补料分批式操作的基础上，每个一定时间按一 定比例放出一部分培养液， 是培养液体积始终不超过反应器的最大操作容积， 从 而在理论上可以延长培养周期，直至培养
27、效率下降，才将培养液全部放出。三、半连续式培养( semi-continuous culture )1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。 采用机械搅拌式生物反应器 系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取 出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基， 让其生长至一定的密度， 在细 胞生长至最大密度之前， 用新鲜的培养基稀释培养物， 每次稀释反应器培养体积 的 1/23/4 ，以维持细胞的指数生长状态， 随着稀释率的增加培养体积逐步增加。 或者在细胞增长和产物形成过程中， 每隔一定时间，
28、 定期取出部分培养物， 或是 条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的 培养基继续进行培养的一种操作模式。 剩余的培养物可作为种子， 继续培养， 从 而可维持反复培养， 而无需反应器的清洗、 消毒等一系列复杂的操作。 在半连续 式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量， 经过几次的 稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。2.半连续式特点：? 培养物的体积逐步增加；? 可进行多次收获； 细胞可持续指数生长， 并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平， 培养过程可延 续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便， 生产效率高，可长时期进行生产， 反复收获产
29、品， 可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。 在动物细胞培养和药品生产中 被广泛应用。四、连续式培养( continuous culture )1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。 该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后， 为了防止衰退期的出现， 在细胞达最 大密度之前， 以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基； 同时，含有细胞的 培养物以相同的速度连续从反应器流出， 以保持培养体积的恒定。 理论上讲， 该 过程可无限延续下去。2.连续培养的优点是反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定状态下生长。 稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。 在稳定
30、状态下细胞所处的环境 条件如营养物质浓度、产物浓度、 pH 值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长 速率可维持不变。 细胞很少受到培养环境变化带来的生理影响， 特别是生物反应 器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺， 维持在一个较低的水平， 从而使他们的利 用效率提高， 有害产物积累有所减少。 然而在高的稀释率下， 虽然死细胞和细胞 碎片及时清除， 细胞活性高最终细胞密度得到提高； 可是产物却不断在稀释， 因 而产物浓度并为提高； 尤其是细胞和产物不断的稀释， 营养物质利用率、 细胞增 长速率和产物生产速率低下。3.连续式培养不足： 由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染； 在长周期的连续培
31、养中，细胞的生长特性以及分泌产物容易变异； 对设备、仪器的控制技术要求较高。 、 连续式培养操作使用的反应器多数是搅拌式生物反应器， 也可以是管式反 应器。4.连续式培养的特点：细胞维持持续指数增长； 产物体积不断增长；可控制衰退期与下降期。五、灌流式培养( perfusion culture )1.灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后， 在细胞增长和产物形成过程 中，不断地将部分条件培养基取出， 同时又连续不断地灌注新的培养基。 它与半 连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基时， 绝大部分细胞均保留在反应 器内，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。灌流式培养常使用的生物反
32、应器主要有两种形式。 一种是用搅拌式生物反应器悬 浮培养细胞， 这种反应器必须具有细胞截流装置， 细胞截留系统开始多采用微孔 膜过滤或旋转膜系统，最近开发的有各种形式的沉降系统或透析系统。中空纤维生物反应器是连续灌流操作常用的一种。 它采用的中空纤维半透膜， 透 过小分子量的产物和底物， 截流细胞和分子量较大的产物， 在连续灌流过程中将 绝大部分细胞截留在反应器内； 近年来中空纤维生物反应器被广泛应用于产物分 泌性动物细胞的生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。另外一种形式是固定床或流化床生物反应器， 固定床是在反应器中装配固定的篮 筐，中间装填聚脂纤维载体， 细胞可附着在载体上生长， 也可固定在载体纤维之 间，靠上搅拌中产生的负压， 迫使培养基不断流经填料， 有利于营养成分和氧的 传递，这种形式的灌流速度较大， 细胞在载体中高密度生长。 流化床生物反应器 是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应， 适合于固定化细胞 的培养。2.灌流式培养的优点：细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度，一般可达 10
