1、973项目国家自然科学基金项目申请书人多能干细胞多能性维持和发育潜能差异的系统研究973项目、国家自然科学基金项目申请书_人多能干细胞多能性维持和发育潜能差异的系统研究项目名称: 人多能干细胞多能性维持和发育潜能差异的系统研究 首席科学家: 康九红 同济大学 起止年限: 2011.1 至 2015.8 依托部门: 教育部 上海市科委二、预期目标 总体目标: iPS 细胞系为研究对象，以探索其多能性及稳定 本项目以不同来源的 ES 和维持、向特定谱系分化的潜能、临床有效性及安全性差异的分子机制，并通过比 较研究差异，建立 ES 和 iPS 细胞系在临床应用中的标准和根据不同目的筛选 ES 和 i
2、PS 细胞系的便捷方法为总体目标。为此，我们整合国内优秀团队，利用当前 最先进的研究手段和技术，从细胞学、分子生物学、发育学、基因组学、表观基 因组学和生物信息学等方面进行研究。通过本项目的实施，将获得一批有自主知 识产权的重要成果，提高国家科研实力，揭示 ES 和 iPS 细胞系间种种差异的机 制，建立根据不同目的筛选适合 ES 和 iPS 细胞的标准和方法，加快 ES 和 iPS 细胞的临床应用。 五年预期目标: 揭示细胞内部预编程并决定不同 ES 和 iPS 细胞系多能性及稳定维持差异的 1. 分子、表观遗传机制和信号转导网络; 揭示细胞内部预编程并决定不同 ES 和 iPS 细胞系向
3、RPE 定向分化及治疗视 2. 网膜退行性眼病有效性和安全性差异的分子、表观遗传机制和信号转导网 络; 揭示细胞内部预编程并决定不同 ES 和 iPS 细胞系向 NPC 或 DA 定向分化及治 3. 疗帕金森病有效性和安全性差异的分子、表观遗传机制和信号转导网络; 通过比较分析，初步制定出较为普遍的判断 ES/iPS 细胞系分化潜能以及临 4. 床安全性标准，以及根据不同临床目的(帕金森治疗等)筛选适合 ES 和 iPS 细胞的基本标准和经济便捷方法。 预期该项目完成时有多于 80 篇的研究论文发表在高水平的国际学术刊物上， 5. 其中影响因子大于 5 的 30-50 篇，影响因子大于 10
4、的 10-20 篇;申请专利 5-10 项。 培养博士后 10-15 人，博士研究生 30-50 人名，培养和壮大国内干细胞及 iPS 6. 细胞的研究队伍。三、研究方案 项目研究采用多学科交叉，多课题组合作的方式进行，第一课题组负责鉴定 iPS 细胞多能性差异，与第四课题合作研究其机制和临床标 不同来源人类 ES 和准，并为其它课题组提供优秀的 ES 和 iPS 细胞。在此基础上，第二、第三课题 分别利用两个成型的动物模型，鉴定 ES 和 iPS 细胞分化潜能及临床安全性差异， 与第四课题合作研究其机制和临床标准。 具体研究方案如下:图 1:项目总体研究方案和技术路线 课题一 不同(来源)人
5、类 ES 和 iPS 细胞系多能性及其稳定维持的差异及预编 程机制 1. 人类多能干细胞的获得 结合已有小鼠技术和平台，主要利用华东干细胞库、中科院上海生科院干细 胞库和北京干细胞库已有的人 ES 和 iPS 细胞系的资源，结合项目组成员已有的 10 多株不同人 ES 和 iPS 细胞系开展研究多能性的细胞、分子和体内评价工作。 2(不同来源多能干细胞多能性的确定、多能性及稳定维持潜能的差异分析 细胞形态学分析、核型分析、免疫组织化学方法、PCR 方法。主要的检测 特征:细胞核大小、核质比、克隆扁平度、边缘光滑度、细胞周期、群体倍增时 间、核型、分子标记(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-
6、4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct4、 Nanog、Sox2、E-cadherin、Brachyury、Pax6、APF)重要基因的表达:端粒酶基因、细胞周期相关基因、关键的 hESCs 标记分 子基因 nanog 等;重要的表观遗传修饰稳定性指标:oct4 等基因区域 DNA 甲基 化、特征性 miRNA、和 X 染色体失活;稳定传代数。 类胚体 EB 分化成三胚层的能力及差异:多能干细胞消化成单细胞，在 10%DMEM 中悬浮培养，培养至第 7 天左右，收集形成球状的 EB，抽提 mRNA， 反转，利用实时定量 PCR 手段检测各胚层基因的表达;同时，将收集到球状 EB 转移到
7、细胞培养皿中，使其贴壁分化，并进行给胚层标记物的荧光染色鉴定。 畸胎瘤形成能力及差异:将不同来源的多能干细胞收集后注射到 NOD,SCID 小 鼠大腿内侧皮下。待畸胎瘤形成至 2cm 左右时，摘除畸胎瘤，制备成石蜡切片， 行 HE 染色，检测畸胎瘤含各胚层组织的情况。 根据这些结果，为课题二、三、四提供多能性、稳定性及分化潜能不同的细 胞株。 3(不同来源多能干细胞多能性及其稳定维持差异的分子机制解析(与课题四合 作) 利用高通量测序技术，鉴定多能性稳定维持具有显著差异的 ES 与 iPS 细胞 系的 microRNA 和 mRNA 表达谱，基因组测序、以及组蛋白 H3 几个特定位点的 乙酰化
8、和甲基化修饰全基因组图谱。利用比较基因组学和计算生物学的手段，分 析和鉴定在多能性及其稳定遗传中起核心作用的转录因子、microRNAs 及其靶基 因、关键信号通路分子等其它分子(课题四)。利用基因操作技术、分子生物学 手段、iPS 形成、多能干细胞全能性及稳定维持等功能分析等，研究上述发现的 转录因子和 microRNAs 在多能性稳定维持等相关过程中的功能，阐明不同 ES/iPS 细胞系间多能性及其稳定维持潜能差异的分子、表观遗传机制和信号转导网络。图 2:课题一技术路线 课题二 ES 和 iPS 细胞向 RPE 分化，治疗视网膜变性眼病有效性和临床安全性间 的差异及预编程机制 1. 建立
9、并完善不同来源的人 ES 和 iPS 细胞诱导分化为 RPE 的实验技术 以 H1、H2、H9、Hsf1、Hsf6 等 ES 细胞系，以及人成纤维细胞、脂肪干细胞、 羊膜干细胞等不同来源的 iPS 细胞系为实验材料，通过对各种相关信号通路、表 观遗传修饰、转录因子进行调控，建立安全高效、简便快捷的多能干细胞诱导分 化为 RPE 的技术。2. 对不同来源的 ES/iPS 细胞分化为 RPE 的潜能进行鉴定，评估不同来源的 ES/iPS 细胞诱导分化为 RPE 的分化潜能差异 通过检测类视色素形成活性、RPE 特异分子标记等指标，对不同来源的多能 性干细胞体外诱导分化 RPE 的速度、效率及分化后
10、细胞功能进行比较，揭示不同 来源多能干细胞向 RPE 诱导分化的潜能差异。 3. 利用rpe65-/-小鼠和RSC大鼠两种视网膜疾病动物模型，检测不同来源多能干 细胞体外分化得到的RPE在视网膜退行性眼病治疗能力和致瘤性上的差异 将RPE细胞移植入模型动物眼睛的视网膜下腔，监测眼类视色素水平、眼杯 内Rpe65 催化活性、RPE内吞噬小体数量，绘制RPE细胞存活曲线，并通过网膜电 图标记术(electroretinography, ERG)检测移植动物的视觉改善效果，通过光 学显微镜和电镜观察移植动物的眼睛的显微结构的改变。利用重症联合免疫缺陷 (severe combined immunod
11、ificiency,SCID)小鼠检测不同多能干细胞来源的RPE 体内致瘤性。 4(在已鉴定不同来源多能干细胞系向 RPE 分化潜能差异的基础上，采用各种组 学手段，筛选出具有 RPE 分化倾向的多能干细胞特异性分子标志 采用表观基因组学、转录组学、蛋白质组学等组学技术对不同来源的多能性 干细胞进行研究，在 DNA、RNA、蛋白质和染色质水平寻找 RPE 细胞分化趋向的 特异性分子标志。 5. 筛选并鉴定决定多能干细胞向 RPE 分化的关键因子 分析和鉴定 ES 和 iPS 细胞定向分化为 RPE 的过程中及 RPE 在体内修复损伤 中起核心作用的转录因子、microRNAs 及其靶基因和关键
12、信号分子。 6. 根据以上数据，阐明不同来源多能干细胞定向分化为 RPE 潜能差异及临床有 效性和安全性差异的产生机制及调控网络 利用基因操作技术、RPE 定向分化试验、干细胞功能分析、RPE 动物模型和 分子生物学技术等，研究上述发现的关键因子在 ES 和 iPS 细胞定向分化为 RPE 中，以及在分化为 RPE 后在体内成瘤过程中的功能，阐明不同 ES/iPS 向 RPE 定 向分化、治疗视网膜退行性眼病的临床有效性及安全性差异的分子、表观遗传机 制及信号转导网络。7(制定来源于 ES/iPS 细胞的 RPE 临床安全性指标，建立筛选适合于分化为 RPE 的 ES 和 iPS 细胞的基本标
13、准和技术体系。 基于上述工作，制定来源于 ES/iPS 细胞的 RPE 临床安全性指标，建立筛选 适合于分化为 RPE 的 ES 和 iPS 细胞的基本标准和技术体系。 不同来源ESC 不同来源iPS RPE分化趋向性分子标志 与多能干细胞亚分类 定向分化为RPE 分化后:分子水平 移植后:分子水平(眼类视 RNAi /基因敲除/转基因 (类视色素形成活 色素水平、眼杯内Rpe65 技术研究多能干细胞分化 性、RPE特异分子标 催化活性)分析、细胞水平 趋向调控机制 记)分析;细胞水平 (RPE内吞噬小体数量、 (细胞形态、增值速 RPE细胞存活曲线)分析、 度等)分析 生理功能(EGR)研究
14、 人工干预多能干细胞分化 趋向使其扭转为RPE趋向 多能干细胞差异评估及分类 MeDIP/ChIP-Seq技术分析表观遗传修饰差异 人工干预多能干细胞分化趋向 使其扭转为RPE趋向 Whole transcriptome sequencing分析RNA组差异 临床应用研究 MALDI/TOF、2DE技术分析蛋白质表达谱差异 图 3:课题二技术路线图 课题三 ES 和 iPS 细胞向 DA NPC 分化、治疗帕金森病有效性和临床安全性间的 差异及预编程机制 1. 人多能干细胞向 DA NPC 定向分化、治疗帕金森病有效性及致瘤性的差异 研究多能干细胞在体外向 DA NPC 分化能力的差异。采用五
15、部法诱导多能 干细胞向 DA NPC 的定向分化，从分子、细胞和功能学水平上评估不同来源的 ES/iPS 细胞系向 DA NPC 方向分化的能力的差异进行半定量和定量的分析。 DA NPC 植入小鼠和食蟹猴帕金森模型后的功能比较。将 6-OHDA 通过立 体定位仪手术单侧注射到小鼠的脑纹状体以造成帕金森模型。术后两周经腹腔注射 Amphetamine 并进行行为学测试小鼠单侧向左或向右旋转的比率。将行为学 稳定的小鼠保留进行多巴胺神经元移植手术。将 DA NPC 细胞移植入小鼠同侧 病变的纹状体区域或者中脑黑质区域。以后每隔一周做一次 Amphetamine 诱导 的行为学试验。细胞移植后一个
16、月和 3 个月后结束试验，取脑做病理及染色分析。 一部分标本做多巴胺的 HPLC 定量，Western Blot，和电生理试验以测试植入细 胞是否整合到现有的神经通路中去。同时，观测这些细胞系来源的细胞在体内的 致瘤能力等安全性指标的差异。 双侧帕金森病食蟹猴模型的建立:通过小剂量静脉注射神经毒素MPTP 0.2mg/kg，建立稳定的双侧帕金森病模型。用99mTc-TRODAT-1 SPECT(单光子 发射计算机体成像术)成像确认纹状体多巴胺转运(DAT)摄取率较对照组减少 超过 60,时认为模型稳定。双侧模型由于与临床病人的表现更为接近，因此有 利于进行帕金森病治疗的研究。用DA NPC细胞
17、移植到造模稳定的模型猴一侧的 纹状体处，术后通过行为学观察细胞治疗是否导致猴运动系统的功能改善。行为 学评价每周进行两次，共八周。八周后用SPECT检测纹状体多巴胺转运(DAT) 的摄取率。临床观测终止后，对部分脑标本进行病理及免疫染色分析，部分标本 做HPLC检测纹状体的多巴胺含量以及Western Blot检测相关蛋白的表达量。并观 测这些细胞系来源的细胞在体内的致瘤能力等安全性指标差异。 2(人多能干细胞分化为 DA NPC、治疗帕金森病有效性及致瘤性差异的分子机 制(与课题四合作) 利用高通量测序技术，分别鉴定利于和不利于向 DA NPC 定向分化的 ES 与 iPS 细胞，以及成瘤性
18、强和成瘤性弱的 ES 与 iPS 细胞的 microRNA 和 mRNA 表 达谱，DNA 甲基化图谱，基因组测序，以及组蛋白 H3 几个特定位点的乙酰化 和甲基化修饰的全基因组图谱。利用比较基因组学和计算生物学的手段，分析和 鉴定在 ES 和 iPS 细胞定向分化为 DA NPC 过程中，以及在分化为 DA NPC 后再 在体内成瘤过程中起核心作用的转录因子、microRNAs 及其靶基因、其它分子等 (课题四)。利用基因操作技术、DA NPC 定向分化试验、干细胞功能分析、 NPC 小鼠模型和分子生物学技术等，研究上述发现的转录因子和 microRNAs 在 ES 和 iPS 细胞定向分化
19、为 DA NPC 中，以及在分化后在体内成瘤过程中的功能，阐明不同 ES/iPS 向 DA NPC 定向分化、治疗帕金森病的临床有效性及安全性差 异的分子、表观遗传机制及信号转导网络。 不同来源 iPS 不同来源ESC 在体外对不同品系的分 化潜能，效率及质量 定向分化为DA NPC 进行比较和鉴定 移植入食蟹猴的 移植入小鼠的 帕金森模型 帕金森模型 鉴定比较移植细胞在体内的分化能力，整合 能力，生存能力，增殖和致瘤能力，以及对 模型动物的相关运动系统的修复能力 多能干细胞差异的评估及分类 MALDI/TOF、2DE技术分析 MeDIP/ChIP-Seq技术 全转录组sequencing分析
20、 蛋白质表达谱差异 分析表观遗传修饰差异 mRNA及mRNA组差异 与课题四合作，寻找关键调控因子并通过RNAi /基因敲除/转基 因技术研究其功能，机制及临床应用标准研究探索 图 4:课题三技术路线 课题四 决定 ES 和 iPS 细胞多能性、分化潜能及临床安全性差异的关键因素及临 床判断指标 1. 不同细胞系基因表达和表观基因组高通量数据的获得利用课题一、二、三鉴定的多能性及稳定维持、RPE、DA NPC 定向分化潜 能、临床有效性和安全性具有显著差异的细胞系，采用 ChIP-seq 等高通量技术， 获取系列细胞系的 microRNA 谱、基因表达谱、基因组测序、DNA 甲基化谱、 以及组
21、蛋白 H3 几个特定位点的乙酰化和甲基化修饰的全基因组图谱。 2(人多能干细胞多能性、临床安全性、以及定向分化为 RPE、DA NPC 差异的 分子机制和临床指标探讨(与课题 1-3 合作) (1)利用比较基因组学和计算生物学的手段，分析和鉴定引起不同多能干细胞 系多能性及稳定维持、向 RPE、DA NPC 定向分化、以及临床有效性和安全性等 方面差异的重要转录因子、microRNAs 及其靶基因、信号转导分子等其它分子。 (2)与课题 1-3 合作，利用基因操作技术、分子生物学手段、iPS 细胞形成、 RPE、DA NPC 定向分化试验、多能干细胞功能分析和动物模型研究等，探究所 发现的重要
22、分子在相关过程中的功能，并阐明其机制和调控相关过程的网络。 (3)在阐明机制和构建网络的基础上，通过生物信息学分析、各种组学数据和 开放的数据平台，以及已有的文献报道，预测上述发现的分子和细胞学差异中， 哪些差异是最关键的，选择一些这样的分子、细胞学指标、特定基因位点的表观 遗传特征性修饰等，作为多能干细胞临床应用判断的候选指标。 (4)与课题 1-3 合作，在大量不同的人 ES 和 iPS 细胞系中检测这些分子的表达 和修饰状态，并结合这些细胞多能性标准检测、分化实验，以及体内移植后成瘤 等方面的分析，探索建立一套适合于临床筛选多能性和临床安全性好的标准和便 捷方法，以及适合于临床筛选利于
23、RPE、DA NPC 分化，适合治疗视网膜眼病及 帕金森病的多能干细胞的标准和便捷方法。 (5)结合现有的小鼠多能性细胞平台，探究所得候选指标的表达和修饰状态， 对小鼠多能性细胞多能性标准、分化实验和体内移植后成瘤等方面的影响，以验 证适于临床筛选多能性和临床安全性好的标准和便捷方法。多能性好/不好(课题一的研究结果);利于/不利于 RPE 定向分化(课题二);利于/ 不利于 DA NPC 定向分化(课题三);成瘤性强/不成瘤的 ES/iPS 细胞系(课题二、三) 获取系列 microRNA 表达谱;mRNA 表达谱;特定位点组蛋白修饰高分辨率图谱; DNA 甲基化高分辨率图谱;生物信息学分析
24、、各种组学数据和开放的数据平台 计算、分析、筛选出与一些与多能性维持、RPE、DA NPC 定向分化、临床安全性相 关的关键 microRNA、特征位点表观遗传修饰、关键转录因子及其它关键分子 和课题一、二、三合作，利用基因操 和课题一、二、三合作，在不同 作，揭示 microRNA 和转录因子等在 ES、iPS 细胞以及小鼠 iPS 中反复 多能干细胞多能性、分化潜力和临床 验证，探索适合于临床应用，能判 安全性等中起决定作用的分子和信 断 ES 及 iPS 细胞多能性、临床安 号的机制 全性等的标准和经济便捷方法图 5:课题四技术路线 四、年度计划 研究内容 预期目标 通过细胞形态学分析、
25、核型分析、免 确定不同来源人 ES 和 iPS 细胞系的 疫组织化学方法、PCR方法等检测不 各自多能性状况，为后续分化研究等 同ES和iPS细胞系的细胞核大小、核 提供多能性、稳定性及分化潜能不同 质比、克隆扁平度、边缘光滑度、细 的细胞株; 胞周期、群体倍增时间、核型、分子 标记(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、 将不同来源的 ES/iPS 细胞系诱导分 TRA-1-60、TRA-1-81、Oct4、Nanog、 化为 RPE 细胞。建立诱导效率更高、 Sox2、E-cadherin、Brachyury、Pax6、 RPE 产生速度更快的诱导分化方案; APF)等特征。并确定不同
26、ES和iPS 细胞系的端粒酶基因、细胞周期相关 完成 IPSC 的诱导以及鉴定工作，完 基因、关键的 hESCs标记分子基因 第 善 ES 或 iPS 向神经前体细胞或多巴 nanog等关键基因的表达情况; oct4 胺神经细胞分化的方法; 等基因区域 DNA甲基化、特征性 miRNA、和X染色体失活;稳定传代 获得目标细胞的 microRNA 谱、 数等重要的表观遗传修饰稳定性指 标;以及体内体外分化成三胚层细胞 mRNA 表达谱、DNA 甲基化图谱以 的能力分析; 及组蛋白 H3 几个特定位点的乙酰一 搜集多种不同来源的多能干细胞系， 化 建立快捷高效的 RPE 体外诱导技术; 和甲基化修
27、饰的全基因组图谱; 从正常对照病人以及帕金森病人身 鉴定出在不同 ES/iPS 细胞系多能 上获得成纤维母细胞标本; 年 从不同组织来源的原代细胞制备非 性、RPE、DA NPC 定向分化、安全 整合型的人 iPS 细胞; 性差异中起关键作用的 microRNAs 构建人 TH-reporter 的慢病毒载体， 及其靶基因。 用来转染 NPC 并通过表达组织特异 性 TH 及 GFP 情况，筛选易于分化为 DA 神经元的细胞系; 利用课题 1-3 鉴定的多能性及稳定 维持、RPE、DA NPC定向分化潜能、 临床有效性和安全性具有显著差异 的细胞系，采用 ChIP-seq 等高通量 技术，以及
28、比较基因组学的手段，分 析鉴定在不同 ES/iPS 细胞系多能 性、RPE、DA NPC 定向分化、安全 性差异中起关键作用的 microRNAs 及其靶基因。 研究内容 预期目标 对比分析不同 ES 和 iPS 细胞系的分析确定不同来源多能干细胞多能 细 胞生长、形态、克隆形成特性; 性及稳定维持潜能的差异，为课题后 发育多能性标志性蛋白的免疫荧光 续分化研究提供多能性、稳定性及分 染色和细胞流式分析及细胞周期特 化潜能不同的细胞株; 性等细胞水平上的差异; 从分子、细胞、功能等层次评估各种 第 研究内容 预期目标 通过细胞形态学分析、核型分析、免 确定不同来源人 ES 和 iPS 细胞系的
29、 疫组织化学方法、PCR方法等检测不 各自多能性状况，为后续分化研究等 同ES和iPS细胞系的细胞核大小、核 提供多能性、稳定性及分化潜能不同 质比、克隆扁平度、边缘光滑度、细 的细胞株; 胞周期、群体倍增时间、核型、分子 标记(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、 将不同来源的 ES/iPS 细胞系诱导分 TRA-1-60、TRA-1-81、Oct4、Nanog、 化为 RPE 细胞。建立诱导效率更高、 Sox2、E-cadherin、Brachyury、Pax6、 RPE 产生速度更快的诱导分化方案; APF)等特征。并确定不同ES和iPS 细胞系的端粒酶基因、细胞周期相关 完成 I
30、PSC 的诱导以及鉴定工作，完 基因、关键的 hESCs标记分子基因 第 善 ES 或 iPS 向神经前体细胞或多巴 nanog等关键基因的表达情况; oct4 胺神经细胞分化的方法; 等基因区域 DNA甲基化、特征性 miRNA、和X染色体失活;稳定传代 获得目标细胞的 microRNA 谱、 数等重要的表观遗传修饰稳定性指 标;以及体内体外分化成三胚层细胞 mRNA 表达谱、DNA 甲基化图谱以 的能力分析; 及组蛋白 H3 几个特定位点的乙酰一 搜集多种不同来源的多能干细胞系， 化 建立快捷高效的 RPE 体外诱导技术; 和甲基化修饰的全基因组图谱; 从正常对照病人以及帕金森病人身 鉴定
31、出在不同 ES/iPS 细胞系多能 上获得成纤维母细胞标本; 年 从不同组织来源的原代细胞制备非 性、RPE、DA NPC 定向分化、安全 整合型的人 iPS 细胞; 性差异中起关键作用的 microRNAs 构建人 TH-reporter 的慢病毒载体， 及其靶基因。 用来转染 NPC 并通过表达组织特异 性 TH 及 GFP 情况，筛选易于分化为 DA 神经元的细胞系; 利用课题 1-3 鉴定的多能性及稳定 维持、RPE、DA NPC定向分化潜能、 临床有效性和安全性具有显著差异 的细胞系，采用 ChIP-seq 等高通量 技术，以及比较基因组学的手段，分 析鉴定在不同 ES/iPS 细胞系多能 性、RPE、DA NPC 定向分化、安全 性差异中起关键作用的 microRNAs 及其靶基因。 研究内容 预期目标 对比分析不同 ES 和 iPS 细胞系的分析确定不同来源多能干细胞多能 细 胞生长、形态、
