1、植物组织培养教案植物细胞与组织培养教案主讲：陈发菊李晓玲易飞一、本课程的性质、地位和作用植物组织培养是以植物细胞、组织、器官为研究对象，运用工程学原理，利用人工培养基按照预定目标，对植物的器官、组织、细胞和原生质体进行培养，改变生物性状，生产生物产品，为人类生产和生活服务的一门综合性技术科学，也是现代生物技术的核心技术之一。在植物的优良品种快速繁殖、脱毒苗木生产、缩短育种进程、种质资源保存等方面具有其它技术无法比拟的优势。它的主要研究内容是研究在无菌及离体条件下，细胞、组织、器官所需营养条件和环境条件；细胞、组织、器官的形态发育规律，植物材料的快速大量繁殖方法；原生质体融合方法与机理；再生个体
2、的遗传变异；种质资源的离体保存机理与方法；通过植物细胞工程实现对动植物的遗传改造, 创造新的生物种质,为人类造福。二、教学目的及要求了解植物组织培养的发展概况、发展现状、未来发展趋势及在生产实践中应用。理解植物组织培养的基本原理。了解植物组织培养实验室或商业性种苗生产企业的设计与构建。熟悉培养室常用仪器、设备及用具，并掌握其使用方法，熟知组织培养实验室常用药品，并掌握其性质、用途及配制方法。了解植物组织培养中如洗涤、灭菌、培养基配制、无菌操作等技术环节，并掌握其操作规程，会熟练操作。了解影响植物组织培养的环境条件。掌握植物器官、愈伤组织、胚胎、花药与花粉、细胞、原生质体培养及种质资源保存的基础
3、技术。掌握植物组培快繁及脱毒苗培育技术。熟知外植体初代培养、诱导增殖、壮苗与生根及瓶苗驯化等各技术环节，并了解组织培养中污染、褐变及超度含水态苗发生的原因及控制措施。了解重要植物的组培快繁与脱毒技术及组培苗工厂化生产与经营管理。三、内容与课时安排(24学时)章 节 目 录课堂讲授内容及学时分配表章 节内 容学 时第1章概述2第2章植物组织培养实验室的构建和操作技术4第3章愈伤组织培养2第4章胚状体发生2第5章器官培养2第6章花药和花粉培养2第7章细胞培养2第8章原生质体培养和体细胞杂交2第9章植物脱毒技术3第10章组培苗工厂化生产的经营与管理1第11章种质保存2第1章 概 述（2学时）一 植物
4、组织培养的概念二植物组织培养的发展三植物组织培养的应用本章小结目的要求：(1) 掌握组织培养的概念和类型；(2) 掌握组织培养的特点；(3) 了解组织培养发展史；(4) 初步掌握组织培养在农业实践上的应用。 一、植物组织培养的概念（一）植物组织培养的概念高等植物的组织培养（tissue culture）技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。（二）植物组织培养的生理依据细胞全能性(cell totipotency)
5、：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、脱落酸、乙烯等生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强弱为2,4-DNAAIBAIAA。细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老，促进芽的产生等作用。常用的有Zip、KT、6-BA、ZT等作用强弱顺序为。ZipKT6-BAZT。赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。常用的为GA3。（三）植物组织培养的类型组织培养按
6、培养对象可分为组织或愈伤培养、器官培养、植株培养、细胞和原生质体培养等。1组织或愈伤组织培养（tissue, callus culture）为狭义的组织培养，是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株。2 器官培养（organ culture）即离体器官的培养，根据作物和需要的不同，可以包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养3植株培养（plant culture）是对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株
7、的培养。4细胞培养（cell culture）是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。5原生质体培养（protoplast culture）是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。组织培养是本世纪发展起来的一门新技术，由于科学技术的进步，尤其是外源激素的应用，使组织培养不仅从理论上为相关学科提出了可靠的实验证据，而且一跃成为一种大规模、批量工厂化生产种苗的新方法，并在生产上越来越得到广泛的应用。植物组织培养之所以发展如此之快，应用的范围如此之广泛，是由于具备以下几个特点： 培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提
8、供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。生长周期短，繁殖率高植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利
9、于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。二 、植物细胞与组织培养的发展植物组织培养的研究可以追溯到20世纪初期，根据其发展情况，大体可以分为三个时期。1萌芽阶段 组织培养技术的蓬勃发展只是近50年的事，但它的整个历史可以追溯至19世纪末和上世纪初。20世纪初，在Schleiden和Schwann所发展起来的细胞学说的推动下，1902年德国植物学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织为许多细胞组成的观点，以及植物细胞
10、全能性的理论，即植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。他首次发表了植物离体细胞培养实验的报告。1912年，Habefiandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。Robins用含无机盐、葡萄糖或果糖的琼脂培养基，培养了长度为1.453.75cm的豌豆、玉米和棉花的茎尖，形成了一些缺绿的茎和根。2奠基阶段 自Haberlandt的实验之后，直到1934年美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的
11、离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。这之后，White又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pH值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，其成分均为已知化合物，包括3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为White培养基。与此同时，Gautherer（1934）在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织， Nobecourt由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的
12、组织培养物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。后来，White于1943年发表了植物组织培养手册专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。3快速发展和应用阶段40年代Skoog和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即这一比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等则不分化。在寻找促进细胞分裂的物质过程中，Miller等人
13、于1956年发现了激动素。不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加3万倍。结果上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展。1952年；Morel和Martin通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株。19351945年Muir把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅在理论上证明了无
14、壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者做出了重要贡献。1962年印度Guha等人成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究。 以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物培养中获得成功，其数目达到160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引入注目的成就。 1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，其繁殖系数极高。由于这一方法有很大的应用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。1
15、973年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展，已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。在整个植物组织培养发展的历史中，我国学者做出多方面的贡献，除了前述的崔徵的研究成效以外，还有1993年李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的研究工作，以及罗士韦关于幼胚和茎尖培养，李正理关于离体胚的研究培养、王伏雄等关于幼胚的研究培养工作。三、植物组织培养的应用植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域，除了在基础理论的研究上占有重要地位以外，还在农业生产中也得到越来越广泛的应用。（一）植物组织培养
16、的快速繁殖用植物组织培养的方法进行快速繁殖(rapidpropagation)是生产上最有潜力的应用，包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。快速繁殖可用下列手段进行：通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽；通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。试管快速繁殖应用在下列生产或研究中：(1)繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系 等。(2)繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。(3)繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上
17、培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。组织培养突出的优点是“快”，通过这一方法在较短时期内迅速扩大植物的数量，以一个茎尖或一小块叶片为基数，经组织培养一年内可增殖到10 000100 000株。（二）脱毒植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重，甚至会造成极严重的后果。自从Morell952年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗(virus free)后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合，则可提高
18、脱毒培养的效果。对于木本植物，茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。 组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用，如马铃薯，甘薯，草莓，苹果，香石竹，菊花等。而且已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心，这对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一个规范的系统程序，从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。（三）体细胞无性系变异和新品种培育(breeding)植物组织培养过程中往往存在大量的变异，这种变异称为体细胞无性系变异。具有如下特点：1变异的无方向性：既有有利的变异，也有有害的变异既有形态变异，也有生理变异。2变异的普遍
19、性：变异在组织培养中经常发生，出现在组织培养的各个时期。既有数量性状变异，又有质量性状变异。既有农艺性状变异，又有经济性状变异；既有表型变异，又有生理变异。与自然变异与辐身诱变相比，体细胞无性系变异广泛而普遍。且易于获得纯合个体。3植物体细胞无性系变异的类型：一类为可遗传变异，主要是由于遗传物质的变化引起的（尤以基因突变为主）。另一类是不可遗传的变异，为生理型变异。往往是由于培养过程中外加的激素及其它化学物质的刺激引起。如叶形、育性等。4引起植物体细胞无性系变异的原因：激素的刺激为主要原因。高浓度的GA和IAA，会造成畸形胚的高频发生，TDZ可使植株产生白化苗或玻璃化植株。2，4-D则使培养细
20、胞发生染色体数量变化。随培养时间的延长，染色体变异频率升高，变异的性状和范围手扩大。5植物体细胞无性系变异的利用价值及途径：它是一种重要的遗传变异来源，是一种重要的遗传资源。对于育种有重要的应用价值。（四）单倍体育种花药、花粉的培养在苹果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘蓝、天竺葵等约20种园艺植物得到了单倍体植株。在常规育种中为得到纯系材料要经过多代自交，而单倍体育种，经染色体加倍后可以迅速获得纯合的二倍体，大大缩短了育种的世代和年限。(五)种质保存用植物组织培养技术保存种质具有以下优点：（1）在较小的空间内可以保存大量的种质资源。（2）具有较高的繁殖系数。（3）避免外界不利气候及其他栽培
21、因素的影响，可常年进行保存。（4）不爱昆虫、病毒和其他病原体的影响。（5）有利于国际间的种质交换与交流。（六）遗传转化大多数植物遗传转化方法需要通过植物组织培养来进行。本章小结：（1）植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植物体的过程。（2）按照外植体的不同，组织培养可分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。（3）组织培养具有：培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产的突出特点，因而发展迅速。（4）组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；
22、育种上应用；工厂化育苗。第2章 植物组织培养实验室的构建和操作技术（4学时） 第一节商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备第二节培养基及其配制第三节外植体的选择与培养第四节试管苗的驯化与移载本章小结目的要求：(1)掌握组织培养实验室的设计；(2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；(3)掌握调控组织培养的主要环境条件。(4)掌握灭菌和消毒的区别；(5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；(6)掌握无菌接种的步骤；(7)掌握外植体的培养方法和步骤；(8)一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法；(9)掌握试管苗驯化的基本程序；在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备
23、条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。第一节 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备一、设计一个标准的组织培养实验室应当包括：洗涤室、配置室、无菌室、培养室、观察室等。在实际中可结合可行条件，合并一部分。（一）洗涤室(cleaning room)洗涤室
24、用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培养器皿。备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。（二）准备室(repairing room)准备室要求明亮、通风。在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。 （三）缓冲室进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配
25、电板等。（四）无菌操作室（transfering room）接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般78m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。 （五)培养室（culturing room） 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属
26、设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般 设5层，最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。培养室最重要的因子是温度，一般保持在2027左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在7080为好，可安装加湿器。控制日光照时间可安装定时开关
27、钟，一般需要每天光照1016h也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照 植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。（六）驯化室驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。（七）温室应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。二、仪器设备和器皿用具（一）仪器设备（见实验室设计）1超净台，优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机10分
28、钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。超净台功率在145260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于0.3um的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟2430m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。超净台分水平式和垂直式二种型号。2无菌箱，在投资少的情况下，可以用接种箱来代替
29、超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。3空调机，保证室内温度，一般为252，应安置在室内较高的位置。以便于排热散凉。4除湿机，培养室的湿度应为7080%，湿度过高易长杂菌，湿度过低培养器皿内的培养基会失水变干，影响培养物的生长。5恒温箱，用于植物材料的培养，可以控制温度、湿度及光照等。6烘箱，用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80100；进行干热灭菌需保持150，达13h；若测定干物重，则温度应控制在80烘干至完全干燥为止。7高压灭菌锅，用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手
30、提式高压灭菌锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅。通常以电作能源。8冰箱，主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。9电子分析天平和托盘天平，电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。10显微镜及解剖镜，种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时，便于观察、操作，通常放大5-80倍。放大40倍以上操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖镜上带
31、有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。11水浴锅，用于溶解难溶药品和熔化琼脂条12摇床与转床、用于改善液体培养材料的通气状况及促进酶解原生质体的解离。一般在液体培养中转速为每分钟100次左右，在解离原生质体时为每分钟80左右。13磁力搅拌器，磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。14电蒸馏水器，电蒸馏水器，采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养基，配制培养基可用自来水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。15酸度计，组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pH值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pH值计上的温度扭使之和培养基温度相当。注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水冲洗净，盖上电极帽。16、离心机，用于
