1、 氯化钠 5g 琼脂 1g 1.6硫甲酚紫酒精溶液 1ml 糖 10g 硫乙醇酸钠 1g 蒸馏水 1000ml 将胨、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于水槽内，加热使融化，再加入所需的糖，调整pH到7.0，加入指示剂，分装试管，在10磅高压灭菌15分钟后，做成高层。 方法 将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部，于37培养。结果观察同需氧菌。 二、VP试验（二乙酰试验）某些细菌能从葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有碱阿提斯鲁夫尔谷存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，会带来粉
2、红色的化合物。其反应式为： 2CH3HCH33十2CO2 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 -2HCH33 KOHCH3H3 2，3-丁烯二醇 丁二酮（二乙酰）含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5g，完全溶解于1000ml水中后，分装试管内，间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。 1OMearas法 试剂：40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中，加入0.3g肌酐即成。 将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后，于3537培养48小时，于每毫升培养物中加入0.1ml，猛烈摇振混合。 2Baritts法6-奈酚酒精溶液为甲液，40氢氧化钾为乙液。 同上法接种培养霉菌，于2ml培养液内改投甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。
3、 试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应（长时间无反应，置室温过夜），次日不变者为基因型。 三、甲基红（MR）试验某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步纯化被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，而不是生成VP试验中的二乙酰，从而使培养基的pH下降至4.5或以下（VP试验的培养物pH常在4.5以上），故加入甲基红试剂呈长红色。本试验常与VP试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。同VP试验培养基。 甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于300ml95酒精中，再加入蒸馏水200ml。接种细菌于培养液之中， 37培养27天后，于培养物中加入几滴试剂，变红色者为阳性反应。 四、淀粉水解试验
4、细菌如产生淀粉酶可将甲硫氨酸淀粉分解为糖类，在培养基上滴加碘液，可在肉骨粉周围出现透明区。 淀粉琼脂培养基： pH7.6的肉浸汤琼脂 90ml 无菌羊血清（只对不易生长的细菌才加） 5ml 无菌3淀粉溶液 10ml 将琼脂加热融化，冷却到45，加入淀粉液体及羊血清，混匀后，倾注平板。将细菌划线接种于上述平板上，在37培养24小时。生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，观察。 结果：培养基呈深蓝色，能水解淀粉的细菌及其菌落周围有透明的环。 五、枸橼酸盐利用试验当细菌利用铵盐作为独一无二氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上为生长，生成碳酸钠，并同时利用铵盐生成氢，使培养基呈碱
5、性。 方法1： Simmons氏培养基： 柠檬酸钠 lg K2HPO4 lg 硫酸镁 0.2g 琼脂（洗过） 20g NH4H2PO4 1g 1溴麝香草酚蓝酒精溶液 10ml 蒸馏水 加至1，000ml 调整pH至6.8，15磅15分钟高压灭菌后制成斜面。 将上述培养基大大减少中的琼脂省去，制成液体培养基，同样可以应用。将被检细菌少量接种到培养基培养基中会， 37培养24日，培养基变蓝色者为尿样，不变者为阴性。 方法2： Christenten氏培养基： 柠檬酸钠 5g KH2PO4 1g 葡萄糖 0.2g 酚红 0.012g 半胱氨酸 0.1g 琼脂 15g 酵母浸膏 0.5g 蒸馏水加至
6、1000ml 有的配方尚加柠檬酸铁铵0.4g，硫代硫酸钠0.08g。 PH不必调整。高压灭菌后压成做成短厚的斜面。接种时先划线后穿刺，孵育于37观察七天。苯丁酸培养基变红色，阴性者培养基仍为红色。 六、吲哚试验细菌分解蛋白胨中的葡萄糖，生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对位二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚。邓亨氏蛋白胨氢氧化钠同（一）常用下述两种。 1欧立希氏（Eplichs）吲哚试剂 对位二甲基氨基苯甲醛（P-dimethyl aminobenzaldehyde） 1g 纯乙醇 95ml 浓盐酸 20ml 先以乙醇溶解试剂，后加盐酸，要避光保存。 2Kovacs试剂 对位二甲基氨基苯甲醛 5
7、g 戊醇（聚异戊醇） 75g 浓盐酸 25ml以接种环接种待试细菌的新鲜斜面培养中所邓亨氏蛋白胨溶液物于， 37培养2448小时后（可延长45天）。于培养液中加入戊醇或二甲苯23ml，摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入试剂2毫升。在戊醇或二甲苯下面的液体变黄色红色者为阳性反应。 也可将一指头有大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏还原剂，再在同处加滴两滴高硫酸钾（K2S2O4）饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约半寸，置烧杯内水浴煮沸为止，脱脂棉上出现明显红色为阳性。此法略繁，但省试剂且准确，因为将试剂加到液体中，吲哚和粪臭素均呈阳性，而用此法，只是吲哚（它能挥发）呈阳性反应。 亦可以滤纸一小片浸
8、湿1%的二甲基苯丙烯铅的10浓HCl溶液，然后以接种环刮取一环琼脂的纯培养物凝胶涂布于该滤纸上。 细菌涂印周围线状蓝色者为阳性，细菌涂印周围无色泽变化或淡黄色者为阴性。 厌氧菌用蛋白胨冷水 葡萄糖 10g Na2HPO4（无水） 2g 加热溶解，调整pH至7.47.6，过滤，分装小试管，15磅高压15分钟。 七、硫化氢试验有些细菌能分解含硫核苷酸氨基酸，产生硫化氢（H2S），H2S会使培养基中的醋酸铅或氯化铁形成黑色的硫化铅或硫化铁。醋酸铅琼脂法 肉汤琼脂 100ml 10硫代硫酸钠溶液（新配） 2.5ml 10醋酸铅溶液 3ml 三种成分分别高压灭菌，前二者丰泓后待凉至60，加入醋酸铅溶液，
9、混合均匀，无菌分装试管达56cm高，立即浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。用接种针蘸取纯培养磁石，沿管壁作穿刺，孵育于37 12天后观察，必要时可延长57天。培养基变黑色者为阳性。 或将细菌培养于肉汤、肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面，在试管的棉花塞下方挂一约6.50.6cm2的浸蘸饱和氯铅溶液（10g醋酸铅溶于50毫升沸蒸馏水中即成）且已干燥的滤纸六条，于37培养，观察7天，纸条变黑者为红细胞结果。五氯化铁明胶培养基法 硫胨（Thiopeptone） 25g 明胶 120g 牛肉膏 7.5g 上述成份灭菌后趁热加入5ml灭菌的10氯化铁溶液。立即以无菌操作分装试管，达56cm高，迅速冷凝成高层
10、。穿刺接种，培养于37观察7天，培养基变黄色者为阳性。 八、硝酸盐还原试验有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用填入对重氮基苯磺酸，且对重氮基苯磺酸与-萘胺铬酸钾作用能生成红色的化合物N-萘胺偶氮苯磺酸，其反应式为： 对氨基苯磺酸 对重氮基苯磺酸 硝酸钾（不含NO2-） 0.2g 蛋白胨 5g 溶解，调节pH至7.4，分装试管。每管约5毫升，15磅高压灭菌15分钟。 甲液 对位氨基苯磺酸 0.8g 5N醋酸溶液 100ml 乙液 萘胺 0.5g 接种细菌后37培养4天，沿管壁加入甲液二滴与乙液二滴，当时观察。阳性者立刻呈红色。 （二）豆科植物硝酸盐培养基法 硝酸钾（不
11、含NO2-，化学纯） 1g 磷酸氢二钠 2g 葡萄糖 1g 加热溶解，调整pH至7.2，过滤，分装试管，15磅高压灭菌15分钟。接种后作厌氧培养，试验方法和结果观察同上法，但培养12日即可。 九、石蕊牛乳试验紫乳培养基中的主要包括成分为干酪素、乳糖及指示剂等。由于各种细菌对这些成分的促进作用不同，已引起有鉴于培养基的变化也有不同，观察的主要涨落为： 产酸：典型从乳糖产生酸，指示剂变酸色（石蕊为红色，溴甲酚紫为黄色）。 酸凝或加有产气：产酸，并有牛乳的凝固（pH4.7以下）；如有气体形成，则凝块中有裂隙，在魏氏梭菌则呈“暴烈发酵”。 凝乳酶产生：很少或无酸产生，牛乳凝固。 胨化：部分或大部分牛奶
12、变清亮。 产碱：产生蛋白酶可将干酪素分解产生胺或氨，使培养基的pH进一步升高，呈深紫色。加石蕊的酒精于新鲜脱脂牛奶中，使达浅紫色，分装于小试管，用流动蒸汽灭菌，每天1次，每次1小时，共3天。接种细菌后，培养及观察一周。 石蕊酒精溶液的制备：8g石蕊在30ml40乙醇中研磨，吸出上清液，再如此用乙醇操作方式两次。加40乙醇到总量为100ml，并煮沸1分钟。取用上清液，必要时可加几滴1N盐酸使达艳紫色。如今多应用溴甲酚紫代替石蕊，即于100ml脱脂乳中加入1.2ml的1.6溴甲酚紫的碳酸铯。将细菌中所接种于紫乳培养基中，37培养17天后观察结果，根据细菌的种类不同，可再现一种上述一种或几种现象。
13、十、凝固血清液化试验有些病原产生胞外酶，可使凝固的血清液化，借此鉴别细菌。 吕氏血清培养基：1葡萄糖肉汤（pH7.6）100毫升，无菌羊（牛、猪）血清300ml，混合后，分装于无菌试管，每管约57ml，在血清凝固器内摆成斜面，间歇灭菌。 第一天，80 l小时，于37过夜；第二天，851小时，于37过夜；第三天，901小时，于37过夜。 弃去有污染的管。 方法与结果：将纯培养物在斜面上作划线接种，于37培养1周，观察凝胶有无液化。 十一、肉渣消化试验有些细菌能够产生蛋白酶，消化肉渣。 熟肉基：即于pH7.47.6的牛肉汤中，于分装试管前，加入半指高的肉渣。液面上加冷却液一小部分凡士林或液体石蜡，
14、15磅高压灭菌30分钟。用无菌毛细玻管或接种环接种细菌后才，用小写蜡笔于培养基的肉渣层上缘划一横线作标记，在37培养几天，观察管内肉渣的高度有无变化，即可方可判定番茄酱是否已被部分消化。 十二、明胶液化试验有些细菌能产生黏液于细胞蛋白外的明胶酶，降解明胶为氨基酸，使半固体的明胶培养基成为液体。明胶培养基（见附录 培养基27） 方法1、电解液琼脂平板法可于普通琼脂加入1明胶倾注平板后，分为四个区，每个区分别划线接种同一个一种被检菌，经2448小时培养后，于培养基表面注入氯化汞溶液（氯化汞12g，蒸馏水80ml，浓盐酸16ml），如细菌液化明胶，则在菌落周围出现透明带。 方法2、将被检菌穿刺接种于
15、明胶培养基，于20培养7天，逐日观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化前一天，可与冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果，不须凝固时为阳性。 十三、尿素酶试验某些细菌能产生尿素酶。尿素酶可分解尿素，产生大量的氨，使培养基的pH值升高，反应式为： O （NH4）2CO32NH3+CO2+H2O NH2-C-NH2+2H2O应用Christenrsen氏培养基 蛋白胨 1g 氯化钠 5g 尿素酶 KH2PO4 2g 0.2酚红溶液 6ml 琼脂 20g 调整pH至6.9。需有生长因子的细菌，可加入酵母浸膏0.1。 121高压灭菌15分钟，冷却到55前一天加入十分之一的20尿素液（经滤过法除菌）使
16、尿素含量为2（即每1000ml中有20g），制成短斜面。接种细菌时，同时作有划线及穿刺，置37培养24小时后观察，培养基从黄色变红色时为阳性。接种量多，反应快的细菌，数小时即可而使培养基变红。阴性者应继续观察4天。 可以省去琼脂，将各物（包括20g尿素）溶解后，过滤除菌，无菌分装，培养2日，无菌者应用。 十四、触酶试验触酶俗称过氧化氢酶，能将过氧化氢分解成为水和氧气： 2H2O+O2 2H2O2饮食细菌应培养在不含血液的营养琼脂上用，因为红血球含有接触酶。将约1 ml3的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。亦可于清洁小试管中加入少量的H2O2（30），再用清洁无菌
17、的细玻挽（或火焰封口的毛细玻管或镍铬丝做成的接种环）蘸细菌少许，插入于H2O2液面下，有气泡产生者为阳性。不可用铂环取细菌，因为铂有时可使H2O2产生气泡。 Daniel，YC法：将细菌在平皿上才划线，培养于3724小时。另取一支毛细钻头（外径1mm，长67mm左右），将其一端浸于3的H2O2液中，使H2O2上升到毛细玻管内，高度约达20mm。将这一支带有H2O2的毛细管下端，轻轻接触菌落，毛细管内立即出现“沸腾”者为强阳性，观察时间以10秒钟为限。 十五、氧化酶试验（Kovac试验）氧化酶及细胞色素氧化酶。做氧化酶试验时，此酶并不直接与氧化酶试剂起脱氢酶化学反应，而是首先并使细胞色素C氧化，
18、然后此氧化型细胞激素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。 细胞色素 1氧化酶 细胞色素2氧化型细胞色素C十H2O 2还原型细胞色素C+2H+2O2 试剂，1%盐酸四甲基苯二胺水溶液，或1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，配制后盛于棕色瓶中，置冰箱中可保存2周，若冰冻保存可用46周。 方法1 如真菌在固体培养基上长出菌落，可将二氯甲烷试剂直接滴在细菌的菌落上，菌落呈玫瑰红色然后到深紫色者为氧化酶亚硝酸钠阳性。 方法2 取白色通透滤纸一角，蘸取试验菌菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即呈粉红色，以前颜色逐渐加深。 十六、DNA酶试验DNA酶可使DNA链水解成为由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。长链DNA可被酸沉
19、淀，而水解后已经形成的寡核苷酸，则可溶于酸，于DNA琼脂平板上需要进行试验，可在菌落周围形成透明环的。DNA酶试验培养基 营养琼脂（pH7.2） 100ml 脱氧核糖核酸（DNA） 0.2g 8CaCl2水溶液 1ml将被检菌接种于0.2%DNA琼脂平板上为做点状接种，于3537培养1824小时后，用1N盐酸倾注平板。于菌落周围出现透明环为此病。 十七、脂酶试验细菌产生的脂酶可分解脂肪为游离脂肪酸。加在中的维多利亚蓝可与脂肪结合成为无色化合物，如果脂肪被细菌产生的分解脂肪酶溶解，则维多利亚蓝释出，呈现深蓝色。该试验主要包括用于厌氧菌的鉴定。脂酶培养基 蛋白胨 10g 酵母浸膏 3g 琼脂 20
20、g pH7.8 维多利亚蓝（1：1500水溶液） 100ml 玉米油 50ml 蒸馏水 900ml将被检细菌接种于脂酶培养基上，于3537培养24小时。细菌如有脂酶，则而使培养基变为深蓝色，否则酵母不变色（无色或粉红色）。 十八、氨基酸脱羧酶试验有的细菌具有脱羧酶，能使氨基酸脱羧（-COOH），生成胺和CO2，使培养基的pH升高，最常用的氨基酸有赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。 基础培养基： 0.2%溴麝香草酚黑溶液 12ml 调整pH到6.8，每100m1基础培养基，加入所可能需要测定的氨基酸0.5g，所加的氨基酸应先溶解于NaOH溶液内。 Ld赖氨酸0.5g + 15Na0H溶液0.5ml Ld鸟
21、氨酸0.5g + 15%NaOH溶液0.6ml 加入氨基酸后，再调整pH至6.8，分装于灭菌小试管内，每管1ml，121高压灭菌10分钟。从琼脂斜面上挑取培养物少许接种，上面滴加一层无菌液体石蜡，于37培养4天，每天观察结果。阳性者培养液先变为黄色，后变为蓝色。阴性者为黄色。 十九、苯丙氨酸脱氨酶试验病原能将苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂蔫绿色。科散囊变形杆菌及普罗菲登斯菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。 DL苯丙氨酸（或L苯丙氨酸1g） 2g 琼脂 12g Na2HPO4 1g 分装于小试管内，121高压灭菌 10分钟，制成长斜面。 试验方法：多量接种被检菌， 37孵育1824小时
22、，生长好后，取出注入0.2毫升（或45滴）10的FeCl3水溶液于栽种面上，变绿色者为阳性。 二十、氰化钾抑菌试验氰化钾可以抑制某些细菌的呼吸酶系统，细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶，以铁卟啉作为辅基，氰化钾能和铁卟淋结合，促使这些酶失去活性，使细菌生长受到抑制。 Na2HPO4 5.64g NaCl 5g KH2PO4 0.225g 此为基础液。调节pH至7.6，15磅灭菌15分钟，冷却，置冰箱。 于冷基础液中加以15ml0.5氰化钾溶液（0.5g KCN溶于100ml冷却的灭菌蒸馏水中），分装于灭菌小试管，每管约1ml，立即用凉拌有热石蜡的软木塞生菜塞紧，可于冰箱中保存2周。将2024小时肉汤培养物，接种一大环到KCN培养基中，立即用锡箔纸塞紧，置37培养，连续观察2天，有细菌生长时为阳性反应。注意：KCN为剧毒药，宜在通气橱内操作。
